微生物遺傳變異與菌種保藏課件

1、微生物遺傳變異與菌種保藏第八章第八章 微生物遺傳變異與菌種保藏微生物遺傳變異與菌種保藏微生物遺傳變異與菌種保藏本章內(nèi)容本章內(nèi)容第一節(jié)第一節(jié) 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)第二節(jié) 基因突變及修復(fù)基因突變及修復(fù)第三節(jié)第三節(jié) 基因重組基因重組第四節(jié)第四節(jié) 微生物育種微生物育種第五節(jié)第五節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯及保藏菌種的衰退、復(fù)壯及保藏 微生物遺傳變異與菌種保藏第一節(jié)第一節(jié) 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)： 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 噬菌體的感染實(shí)驗(yàn)噬菌體的感染實(shí)驗(yàn) 植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)微生物遺傳變異與菌種保藏實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法： 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)細(xì)菌培

2、養(yǎng)實(shí)驗(yàn)細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)S S型菌無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)型菌無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)（一）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（一）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)Griffith （1928） Avery（1944）微生物遺傳變異與菌種保藏實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料： 肺炎雙球菌肺炎雙球菌光滑型（光滑型（S）粗糙型（粗糙型（R）有有 莢莢 膜膜菌落光滑菌落光滑分泌毒素分泌毒素致致 病病無(wú)無(wú) 莢莢 膜膜菌落粗糙菌落粗糙無(wú)無(wú) 毒毒不不 致致 病病SSS三個(gè)血清型三個(gè)血清型RRR三個(gè)血清型三個(gè)血清型微生物遺傳變異與菌種保藏活活死死死死加活加活R菌或死菌或死S菌菌加活加活S菌菌加加活活R菌和熱死菌和熱死S菌菌抽血分離抽血分離活的活的S菌菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）動(dòng)物實(shí)

3、驗(yàn)?微生物遺傳變異與菌種保藏?zé)崴罒崴?無(wú)菌落生長(zhǎng)無(wú)菌落生長(zhǎng) 體外培養(yǎng)體外培養(yǎng) 活菌活菌 體外培養(yǎng)體外培養(yǎng) 菌落菌落 菌落多菌落多菌落少菌落少 體外混合培養(yǎng)體外混合培養(yǎng)熱死熱死 活菌活菌 說(shuō)明：加熱殺死的說(shuō)明：加熱殺死的S型細(xì)菌中可能存在某種物質(zhì)，型細(xì)菌中可能存在某種物質(zhì)， 能通過(guò)某種方式進(jìn)入能通過(guò)某種方式進(jìn)入R型細(xì)菌。型細(xì)菌。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（2 2）細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)微生物遺傳變異與菌種保藏大量大量R R菌落菌落活活R R菌菌S S菌無(wú)細(xì)胞抽提液菌無(wú)細(xì)胞抽提液+活活R R菌菌+S S菌菌DNADNAS S菌落菌落S S菌菌PrPrS S菌多糖菌多糖R R菌落菌落活活R R菌菌+說(shuō)明：遺

4、傳因子是以說(shuō)明：遺傳因子是以DNA為物質(zhì)基礎(chǔ)。為物質(zhì)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（3 3）S S型菌無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)型菌無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)微生物遺傳變異與菌種保藏（二）（二） 噬菌體的感染實(shí)驗(yàn)噬菌體的感染實(shí)驗(yàn)微生物遺傳變異與菌種保藏吸附吸附10分鐘后分鐘后攪動(dòng)攪動(dòng)離心離心上清液上清液沉沉 淀淀離心離心,分出上清液和沉淀分出上清液和沉淀.沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)，產(chǎn)生大量的子代噬菌體沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)，產(chǎn)生大量的子代噬菌體(30% P32、 1%35 ）。證明：在其證明：在其DNA中，含有包括中，含有包括Pro外殼在內(nèi)的整套遺傳物質(zhì)。外殼在內(nèi)的整套遺傳物質(zhì)。微生物遺傳變異與菌種保藏 植物病毒植物病毒蛋白質(zhì)蛋白

5、質(zhì)和和RNARNA可以人為地分開(kāi)可以人為地分開(kāi), ,同時(shí)又可把它們重新組合成具感染性的病毒同時(shí)又可把它們重新組合成具感染性的病毒. .甲乙甲乙r r 感染癥狀同甲病毒；分離得到甲病毒感染癥狀同甲病毒；分離得到甲病毒 乙甲乙甲r r 感染癥狀同乙病毒；分離得到乙病毒感染癥狀同乙病毒；分離得到乙病毒 （三）（三） 植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)植物病毒的重建實(shí)驗(yàn) TMV:煙草花葉病毒煙草花葉病毒 HRV:霍氏車前花葉病毒（霍氏車前花葉病毒（RNA) 證明遺傳物質(zhì)是證明遺傳物質(zhì)是RNA微生物遺傳變異與菌種保藏TMVHRVHRVTMV原始株原始株 拆開(kāi)拆開(kāi) 重建重建 感染感染 分離純化分離純化 植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)

6、植物病毒的重建實(shí)驗(yàn) 微生物遺傳變異與菌種保藏第二節(jié)第二節(jié) 基因突變及修復(fù)基因突變及修復(fù)一一 基因突變基因突變二二 DNA損傷的修復(fù)損傷的修復(fù)微生物遺傳變異與菌種保藏一一 基因突變基因突變（一）突變類型（一）突變類型（二）突變的特點(diǎn)（二）突變的特點(diǎn)微生物遺傳變異與菌種保藏（一）（一） 突變類型突變類型1 堿基變化與遺傳信息的改變堿基變化與遺傳信息的改變2 表型變化表型變化微生物遺傳變異與菌種保藏1 堿基變化與遺傳信息的改變堿基變化與遺傳信息的改變（1） 錯(cuò)義突變（錯(cuò)義突變（missensemutation）：）：某個(gè)密碼的第一個(gè)某個(gè)密碼的第一個(gè)堿基或第二個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，使編碼某一氨基酸的密

7、碼變?yōu)閴A基或第二個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，使編碼某一氨基酸的密碼變?yōu)榫幋a另一個(gè)氨基酸的密碼。氨基酸置換編碼另一個(gè)氨基酸的密碼。氨基酸置換（2） 無(wú)義突變（無(wú)義突變（nonsense mutation）：）：某個(gè)密碼的第一個(gè)某個(gè)密碼的第一個(gè)堿基或第二、第三個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，變?yōu)椴痪幋a任何氨基酸堿基或第二、第三個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，變?yōu)椴痪幋a任何氨基酸的密碼。終止密碼子（的密碼。終止密碼子（UAA,UAG,UGA)。（3） 同義突變（同義突變（samesense mutation）：發(fā)生改變的堿基發(fā)生改變的堿基位于密碼的第位于密碼的第3位，一般編碼同一個(gè)氨基酸。比如簡(jiǎn)并密碼。編碼位，一般編碼同一個(gè)

8、氨基酸。比如簡(jiǎn)并密碼。編碼的氨基酸與野生型氨基酸相同。的氨基酸與野生型氨基酸相同。（4） 移碼突變（移碼突變（frameshift mutation）：DNA序列中序列中1-2個(gè)個(gè)核苷酸缺失或插入，翻譯的閱讀框改變，導(dǎo)致氨基酸序列改變。核苷酸缺失或插入，翻譯的閱讀框改變，導(dǎo)致氨基酸序列改變。微生物遺傳變異與菌種保藏2 表型變化表型變化（1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型）營(yíng)養(yǎng)缺陷型（2）抗藥性突變型）抗藥性突變型（3）條件致死突變型）條件致死突變型（4）形態(tài)突變型）形態(tài)突變型微生物遺傳變異與菌種保藏（1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型）營(yíng)養(yǎng)缺陷型(auxotroph) 由于代謝障礙成為必須添加某種物質(zhì)才能生長(zhǎng)的突變株。由于代謝障礙成

9、為必須添加某種物質(zhì)才能生長(zhǎng)的突變株。 腺嘌呤突變株腺嘌呤突變株Ade -（完全培養(yǎng)基）（完全培養(yǎng)基） 腺嘌呤野生型菌株腺嘌呤野生型菌株Ade +（基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基）。（基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基）。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型是微生物遺傳學(xué)研究中重要的選擇標(biāo)記和育營(yíng)養(yǎng)缺陷型是微生物遺傳學(xué)研究中重要的選擇標(biāo)記和育 種的重要手段。種的重要手段。 用影印平板進(jìn)行分離篩選。用影印平板進(jìn)行分離篩選。微生物遺傳變異與菌種保藏完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基微生物遺傳變異與菌種保藏（2）抗藥性突變型（）抗藥性突變型（resistant mutant)由于基因突變使菌株對(duì)某種或某幾種藥物，特別由

10、于基因突變使菌株對(duì)某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性的一種突變型。是抗生素，產(chǎn)生抗性的一種突變型。在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長(zhǎng)。長(zhǎng)。微生物遺傳變異與菌種保藏 在某一條件下具有致死效應(yīng)，在另一條件下沒(méi)有致死效應(yīng)。在某一條件下具有致死效應(yīng)，在另一條件下沒(méi)有致死效應(yīng)。 合成關(guān)鍵性酶的基因發(fā)生了突變。合成關(guān)鍵性酶的基因發(fā)生了突變。 如如溫度敏感突變溫度敏感突變t ts s（4242致死，致死，25253030存活）。存活）。 用影印平板進(jìn)行分離篩選。用影印平板進(jìn)行分離篩選。 （3）條件致死突變型）條件致死突變型（conditional l

11、ethal mutant）微生物遺傳變異與菌種保藏細(xì)胞形態(tài)突變細(xì)胞形態(tài)突變 菌落形態(tài)突變菌落形態(tài)突變顏色突變顏色突變噬菌斑形態(tài)突變噬菌斑形態(tài)突變（4） 形態(tài)突變型（形態(tài)突變型（morphological mutant）包括包括微生物遺傳變異與菌種保藏（二）（二） 突變的特點(diǎn)突變的特點(diǎn)1 1 非對(duì)應(yīng)性非對(duì)應(yīng)性：環(huán)境與變異無(wú)對(duì)應(yīng)性。：環(huán)境與變異無(wú)對(duì)應(yīng)性。 2 2 自發(fā)性：自發(fā)性：非人為的誘變因素下發(fā)生。非人為的誘變因素下發(fā)生。3 3 規(guī)律性規(guī)律性：某一特定性的突變率具規(guī)律性。：某一特定性的突變率具規(guī)律性。4 4 獨(dú)立性獨(dú)立性：一個(gè)基因的突變對(duì)其它基因突變無(wú)影響。：一個(gè)基因的突變對(duì)其它基因突變無(wú)影響

12、。5 5 稀有性稀有性：生物自發(fā)突變率為：生物自發(fā)突變率為1010-6-61010-12-12。 6 6 誘變性誘變性：誘變劑可提高突變率：誘變劑可提高突變率1010 10105 5。 7 7 穩(wěn)定性穩(wěn)定性：突變性狀穩(wěn)定、可遺傳。：突變性狀穩(wěn)定、可遺傳。 8 8 可逆性可逆性：有回復(fù)突變。：有回復(fù)突變。微生物遺傳變異與菌種保藏二二 DNA損傷及修復(fù)（自學(xué)）損傷及修復(fù)（自學(xué)）1 1 光復(fù)活作用（光復(fù)活作用（PhotoreactivationPhotoreactivation）2 2 切除修復(fù)（切除修復(fù)（Excision RepairExcision Repair）3 3 重組修復(fù)（重組修復(fù)（Re

13、combination RepairRecombination Repair）4 4 SOSSOS修復(fù)（修復(fù)（SOS RepairSOS Repair）微生物遺傳變異與菌種保藏光復(fù)活作用（光復(fù)活作用（PhotoreactivationPhotoreactivation）Thymine Dimer微生物遺傳變異與菌種保藏Photoreactivation光解酶光解酶Phr在在黑暗黑暗中專一地識(shí)別嘧啶二中專一地識(shí)別嘧啶二聚體，并與之結(jié)合，形成酶聚體，并與之結(jié)合，形成酶-DNA復(fù)合復(fù)合物，當(dāng)物，當(dāng)有光有光時(shí)，酶利用光能時(shí)，酶利用光能將二聚體將二聚體拆開(kāi)拆開(kāi)，恢復(fù)原狀，酶再釋放出來(lái)。，恢復(fù)原狀，酶再釋

14、放出來(lái)。微生物遺傳變異與菌種保藏正?？梢?jiàn)光下光誘導(dǎo)系統(tǒng)的修復(fù)。正?？梢?jiàn)光下光誘導(dǎo)系統(tǒng)的修復(fù)。photoreactivation enzyme光裂合酶光裂合酶photolyasephotolyase烷基轉(zhuǎn)移酶烷基轉(zhuǎn)移酶AlkyltransferasesAlkyltransferases切割嘧啶二聚體，分開(kāi)。切割嘧啶二聚體，分開(kāi)。胸腺嘧啶二聚體光復(fù)活酶可見(jiàn)光 光的吸收酶的釋放光復(fù)活過(guò)程光復(fù)活過(guò)程微生物遺傳變異與菌種保藏第三節(jié)第三節(jié) 基因重組基因重組一、原核生物的基因重組一、原核生物的基因重組 二、真核生物的基因重組二、真核生物的基因重組微生物遺傳變異與菌種保藏基因重組基因重組 把兩個(gè)把兩個(gè)不同性狀

15、不同性狀個(gè)體內(nèi)的個(gè)體內(nèi)的遺傳基因遺傳基因轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到到一起一起，經(jīng)遺傳，經(jīng)遺傳 物質(zhì)重新組合后，物質(zhì)重新組合后，形成新遺傳型個(gè)體形成新遺傳型個(gè)體的方式。的方式。 基因重組基因重組分子水平的雜交分子水平的雜交 一般雜交一般雜交細(xì)胞水平細(xì)胞水平如：如： 甲甲 乙乙生長(zhǎng)快、產(chǎn)量低生長(zhǎng)快、產(chǎn)量低 生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量高生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量高 基因重組基因重組 生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高微生物遺傳變異與菌種保藏一一 原核微生物的基因重組原核微生物的基因重組（一）（一）轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformation)transformation)（二）二）轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)( (transduction) transduction) （

16、三）三）接合接合( (conjugation)conjugation)微生物遺傳變異與菌種保藏（一）轉(zhuǎn)化（一）轉(zhuǎn)化（transformation)transformation)概念概念 受體細(xì)胞受體細(xì)胞( (receptor)receptor)直接直接吸收吸收來(lái)自來(lái)自供體細(xì)胞供體細(xì)胞( (donor)donor)的的DNADNA片斷片斷，并把它整合到自己的基因組中，并把它整合到自己的基因組中，細(xì)胞部分遺傳性狀發(fā)生變化的現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)化。，細(xì)胞部分遺傳性狀發(fā)生變化的現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)化。 1. 1. 感受態(tài)感受態(tài)2. 2. 感受態(tài)因子感受態(tài)因子3. 3. 轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化因子4. 4. 轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)微生物遺

17、傳變異與菌種保藏 （1 1）感受態(tài)）感受態(tài)：受體細(xì)胞最易接受外源：受體細(xì)胞最易接受外源DNADNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化 的一種的一種生理狀態(tài)生理狀態(tài)。 （2 2）轉(zhuǎn)化的決定因素）轉(zhuǎn)化的決定因素：不同菌株的親緣關(guān)系：不同菌株的親緣關(guān)系; ;受體細(xì)胞是否受體細(xì)胞是否 處于感受態(tài)；不同菌出現(xiàn)感受態(tài)的時(shí)處于感受態(tài)；不同菌出現(xiàn)感受態(tài)的時(shí) 間不同。間不同。 （3 3）感受態(tài)的獲得：）感受態(tài)的獲得：自然獲得；用自然獲得；用CaCl2處理細(xì)胞；電穿孔處理細(xì)胞；電穿孔1. 1. 感受態(tài)感受態(tài)微生物遺傳變異與菌種保藏 細(xì)菌自身分泌的一種胞外蛋白質(zhì)，分子量為細(xì)菌自身分泌的一種胞外蛋白質(zhì)，分子量為5 51

18、010kDkD。 其作用為：其作用為： （1 1）催化轉(zhuǎn)化，促進(jìn)外來(lái)）催化轉(zhuǎn)化，促進(jìn)外來(lái)DNADNA片段吸收。片段吸收。 （2 2）可降解細(xì)胞表面某種成分，使）可降解細(xì)胞表面某種成分，使DNADNA受體暴露。受體暴露。 不同菌細(xì)胞不同菌細(xì)胞DNADNA受體位點(diǎn)不同。受體位點(diǎn)不同。 有的菌感受態(tài)因子只對(duì)同種菌起作用。有的菌感受態(tài)因子只對(duì)同種菌起作用。 2. 2. 感受態(tài)因子感受態(tài)因子微生物遺傳變異與菌種保藏3. 3. 轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化因子（1 1） 轉(zhuǎn)化因子由供體提供。轉(zhuǎn)化因子由供體提供。（2 2） 一般為線狀或閉合環(huán)狀；單鏈或雙鏈；雙鏈一般為線狀或閉合環(huán)狀；單鏈或雙鏈；雙鏈 有轉(zhuǎn)化能力，單鏈沒(méi)有。

19、有轉(zhuǎn)化能力，單鏈沒(méi)有。（3 3） 自然情況下可由細(xì)菌細(xì)胞自行裂解產(chǎn)生；實(shí)驗(yàn)室里自然情況下可由細(xì)菌細(xì)胞自行裂解產(chǎn)生；實(shí)驗(yàn)室里 通過(guò)提取獲得。通過(guò)提取獲得。（4 4） 轉(zhuǎn)化的頻率往往很低，一般為轉(zhuǎn)化的頻率往往很低，一般為0.10.11%1%。據(jù)研究，。據(jù)研究， 呈質(zhì)粒形式（雙鏈閉合環(huán)狀）的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)呈質(zhì)粒形式（雙鏈閉合環(huán)狀）的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn) 化頻率最高?；l率最高。 游離的片斷叫轉(zhuǎn)化因子。游離的片斷叫轉(zhuǎn)化因子。微生物遺傳變異與菌種保藏4. 轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)不需兩個(gè)細(xì)胞直接接觸，供體不需兩個(gè)細(xì)胞直接接觸，供體DNADNA提取出來(lái)，注入受體即可。提取出來(lái)，注入受體即可。微生物遺傳變異與菌種保藏

20、在細(xì)菌的感受態(tài)出在細(xì)菌的感受態(tài)出現(xiàn)時(shí)，具有從周圍現(xiàn)時(shí)，具有從周圍環(huán)境吸收環(huán)境吸收DNA分子分子而不被而不被DNA酶破壞酶破壞的生理特性。處于的生理特性。處于感受態(tài)的細(xì)胞，吸感受態(tài)的細(xì)胞，吸收收DNA的能力有時(shí)的能力有時(shí)可比一般細(xì)胞大可比一般細(xì)胞大1000倍。倍。微生物遺傳變異與菌種保藏微生物遺傳變異與菌種保藏（二）（二） 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)(transduction)以以溫和噬菌體溫和噬菌體為媒介，把為媒介，把供體細(xì)胞供體細(xì)胞的的DNADNA或或RNARNA片斷轉(zhuǎn)移到片斷轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞受體細(xì)胞中，從而使后者獲中，從而使后者獲得前者的部分遺傳性狀。得前者的部分遺傳性狀。不需要細(xì)

21、胞間直接接觸。但需要媒介。不需要細(xì)胞間直接接觸。但需要媒介。微生物遺傳變異與菌種保藏 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（Generalized Transduction） 噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)供體染色體的任何部分到受體細(xì)胞中。噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)供體染色體的任何部分到受體細(xì)胞中。 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（Specialized Transduction） 噬菌體總是攜帶同樣的片段到受體細(xì)胞中。噬菌體總是攜帶同樣的片段到受體細(xì)胞中。微生物遺傳變異與菌種保藏結(jié)果結(jié)果10-5頻率出現(xiàn)野生型菌株。（基本培養(yǎng)基）頻率出現(xiàn)野生型菌株。（基本培養(yǎng)基） U型管試驗(yàn)：型管試驗(yàn)：也能出現(xiàn)野生型菌株也能出現(xiàn)野生型菌株 （基本培養(yǎng)基）（基本培養(yǎng)基

22、）在對(duì)鼠傷寒沙門氏菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株在對(duì)鼠傷寒沙門氏菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的研究中發(fā)現(xiàn)的研究中發(fā)現(xiàn)A+B-A-B+A+B+A+B+微生物遺傳變異與菌種保藏供體供體A-B+A+B-多數(shù)受體多數(shù)受體形成溶源菌形成溶源菌A-B+A+B-少數(shù)受體少數(shù)受體A+B+經(jīng)重組形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子經(jīng)重組形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子A:組氨酸組氨酸B:色氨酸色氨酸Generalized Transduction微生物遺傳變異與菌種保藏Specialized Transduction 被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因與噬菌體被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因與噬菌體DNA共價(jià)連接，與噬菌體共價(jià)連接，與噬菌體 DNA一起進(jìn)行復(fù)制包裝以及導(dǎo)入受體細(xì)胞一起進(jìn)行復(fù)制包裝以及導(dǎo)入受體細(xì)胞。 噬菌體攜帶

23、特殊的染色體片段將固定的個(gè)別基因?qū)删w攜帶特殊的染色體片段將固定的個(gè)別基因?qū)?入受體。入受體。普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同之處：普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同之處：微生物遺傳變異與菌種保藏Specialized Transduction原噬菌體原噬菌體供體供體DNA 受體受體DNA微生物遺傳變異與菌種保藏（三）接合（三）接合(conjugation)(conjugation) 概念：概念：供體細(xì)胞與受體細(xì)胞供體細(xì)胞與受體細(xì)胞直接接觸直接接觸，借性菌毛，借性菌毛 傳遞大段傳遞大段DNADNA的過(guò)程。在受體細(xì)胞中發(fā)生交的過(guò)程。在受體細(xì)胞中發(fā)生交 換、整合，使之獲得供體菌的遺傳性狀的換、整合，使之獲得供體菌

24、的遺傳性狀的 現(xiàn)象，稱為接合?，F(xiàn)象，稱為接合。 通過(guò)接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞就稱通過(guò)接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞就稱接合子接合子。微生物遺傳變異與菌種保藏+A+B+C-D-A-B-C+D+接接 合合 及及 其其 發(fā)發(fā) 現(xiàn)（大腸桿菌）現(xiàn)（大腸桿菌）A+B+C+D+A:生物素生物素B:甲硫氨酸甲硫氨酸C:蘇氨酸蘇氨酸D:賴氨酸賴氨酸基本基本培養(yǎng)基培養(yǎng)基A+B+C-D-A-B-C+D+微生物遺傳變異與菌種保藏Davis（1950）U型管試驗(yàn)型管試驗(yàn)兩個(gè)菌株不兩個(gè)菌株不能直接接觸，能直接接觸，只能是培養(yǎng)只能是培養(yǎng)液和營(yíng)養(yǎng)物液和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（包括質(zhì)（包括DNA分子）分子）可以通過(guò)。可以通過(guò)。 完全完全培養(yǎng)基

25、培養(yǎng)基完全完全培養(yǎng)基培養(yǎng)基A+B+C-D-A-B-C+D+基本基本培養(yǎng)基培養(yǎng)基沒(méi)有菌生長(zhǎng)沒(méi)有菌生長(zhǎng)微生物遺傳變異與菌種保藏1. F+與與F-雜交雜交F+細(xì)菌的表面有稱作性菌毛性菌毛（sex pili）的細(xì)長(zhǎng)菌毛，由此與F細(xì)菌接合，一旦接觸后，菌毛發(fā)生改變，成為兩細(xì)胞間的原生質(zhì)通道-細(xì)胞質(zhì)橋細(xì)胞質(zhì)橋或稱結(jié)合管結(jié)合管（conjugation tube），F(xiàn)+細(xì)胞的F因子通過(guò)接合管向F細(xì)胞轉(zhuǎn)遞： 使F變成F，F(xiàn)因子還可改變細(xì)胞表面的構(gòu)造，以防F細(xì)胞間的接合。F F+ +細(xì)菌：含有細(xì)菌：含有F F因子因子F F- -細(xì)菌：不含有細(xì)菌：不含有F F因子因子F因子就是因子就是F質(zhì)粒質(zhì)粒 。微生物遺傳變異與

26、菌種保藏滾環(huán)式復(fù)制滾環(huán)式復(fù)制， 式 微生物遺傳變異與菌種保藏微生物遺傳變異與菌種保藏2. HfrF-雜交雜交HfrHfr菌的形成菌的形成 F F質(zhì)粒整合到細(xì)菌染色體上。質(zhì)粒整合到細(xì)菌染色體上。微生物遺傳變異與菌種保藏質(zhì)粒和染色體共質(zhì)粒和染色體共有插入序列和轉(zhuǎn)有插入序列和轉(zhuǎn)座因子。這些轉(zhuǎn)座因子。這些轉(zhuǎn)座因子之間的同座因子之間的同源重組導(dǎo)致質(zhì)粒源重組導(dǎo)致質(zhì)粒的整合。的整合。微生物遺傳變異與菌種保藏HfrF-雜交雜交結(jié)果仍是結(jié)果仍是Hfr細(xì)胞和細(xì)胞和F-細(xì)胞。細(xì)胞。微生物遺傳變異與菌種保藏Hfr和和F+的聯(lián)系和區(qū)別的聯(lián)系和區(qū)別 聯(lián)系聯(lián)系：（：（1）都是雄性菌，含有）都是雄性菌，含有F質(zhì)粒。質(zhì)粒。 （

27、2）Hfr F質(zhì)粒與染色體整合質(zhì)粒與染色體整合 。 F+ F質(zhì)粒游離在染色體外。質(zhì)粒游離在染色體外。區(qū)別區(qū)別：（1） Hfr 的的F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率低，質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率低， F+ 的的F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率高；質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率高； （2） Hfr 的的F質(zhì)粒整合，質(zhì)粒整合， F+ 的的F質(zhì)粒游離。質(zhì)粒游離。 微生物遺傳變異與菌種保藏3. F 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶有宿主染色體基因攜帶有宿主染色體基因的的F F因子。因子。從從HfrHfr菌中染色體上脫菌中染色體上脫離下來(lái)的離下來(lái)的F F質(zhì)粒有時(shí)會(huì)質(zhì)粒有時(shí)會(huì)攜帶相鄰的染色體基因攜帶相鄰的染色體基因或或DNADNA片段，稱為片段，稱為FF質(zhì)質(zhì)粒（粒（FF因子），因子），該菌該菌

28、被稱為被稱為FF菌。菌。F因子因子微生物遺傳變異與菌種保藏 給體的部分染色體基因給體的部分染色體基因 隨隨F一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。 基因不需整合就可表達(dá)。基因不需整合就可表達(dá)。 利用利用F 因子形成部分二因子形成部分二 倍體叫做性導(dǎo)倍體叫做性導(dǎo) sexduction。FF-雜交雜交微生物遺傳變異與菌種保藏注意區(qū)別注意區(qū)別F+菌、菌、 Hfr 菌、菌、 F 菌的不同！菌的不同！微生物遺傳變異與菌種保藏轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合三者的根本區(qū)別轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合三者的根本區(qū)別在于在于DNADNA轉(zhuǎn)移的方式不同轉(zhuǎn)移的方式不同轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：供體供體DNADNA片斷片斷注入受體細(xì)胞，通過(guò)注入受體細(xì)胞，通過(guò)細(xì)

29、胞膜細(xì)胞膜接合：接合：供體進(jìn)入受體通過(guò)供體進(jìn)入受體通過(guò)性菌毛。性菌毛。轉(zhuǎn)導(dǎo)：轉(zhuǎn)導(dǎo)：供體供體DNADNA片斷通過(guò)片斷通過(guò)媒介噬菌體媒介噬菌體攜帶進(jìn)入受體。攜帶進(jìn)入受體。 微生物遺傳變異與菌種保藏二二 真核微生物的基因重組真核微生物的基因重組（一）有性生殖（一）有性生殖（二）（二）準(zhǔn)性生殖（準(zhǔn)性生殖（parasexual hybridizationparasexual hybridization）（三）酵母菌的接合型遺傳（三）酵母菌的接合型遺傳微生物遺傳變異與菌種保藏（一）（一） 有性生殖有性生殖 一般指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體一般指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代

30、的一種生殖方式。重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種生殖方式。 凡是能產(chǎn)生凡是能產(chǎn)生有性孢子有性孢子的酵母菌或霉菌，原則的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動(dòng)、植物有性生殖相似的方法上都能采用與高等動(dòng)、植物有性生殖相似的方法進(jìn)行有性繁殖。進(jìn)行有性繁殖。一部分真菌的減數(shù)分裂發(fā)生在一部分真菌的減數(shù)分裂發(fā)生在1個(gè)閉合的子囊殼個(gè)閉合的子囊殼中，具較短的生活周期，中，具較短的生活周期，為遺傳重組的研究帶來(lái)為遺傳重組的研究帶來(lái)極大方便。極大方便。微生物遺傳變異與菌種保藏子囊孢子形成過(guò)程子囊孢子形成過(guò)程粗糙脈胞霉：粗糙脈胞霉：1個(gè)子囊內(nèi)產(chǎn)生的雙倍體個(gè)子囊內(nèi)產(chǎn)生的雙倍體核直接減數(shù)分裂后所產(chǎn)生核直接減數(shù)分裂后所產(chǎn)生的

31、的4個(gè)孢子直線排列在子個(gè)孢子直線排列在子囊內(nèi)（為順序排列四分囊內(nèi)（為順序排列四分體），再進(jìn)行一次有絲分體），再進(jìn)行一次有絲分裂，產(chǎn)生裂，產(chǎn)生8個(gè)子囊孢子。個(gè)子囊孢子。AAAAaaaa、aaaaAAAA、AAaaAAaaaaAAaaAA、AAaaaaAA、aaAAAAaa8個(gè)子囊孢子的排列：個(gè)子囊孢子的排列：微生物遺傳變異與菌種保藏粗糙脈胞霉（粗糙脈胞霉（面包霉）的生活史面包霉）的生活史分生孢子（分生孢子（n）菌絲菌絲（n）子實(shí)體子實(shí)體核融合核融合合子核合子核(2n)交配型交配型A交配型交配型B減數(shù)分裂減數(shù)分裂I減數(shù)分裂減數(shù)分裂II有絲分裂有絲分裂萌發(fā)萌發(fā)(n)子囊孢子（子囊孢子（n）微生物遺傳

32、變異與菌種保藏粗糙脈胞霉粗糙脈胞霉減數(shù)分裂減數(shù)分裂微生物遺傳變異與菌種保藏微生物遺傳變異與菌種保藏（二）準(zhǔn)性生殖（二）準(zhǔn)性生殖（parasexual reproduction）1. 1. 準(zhǔn)性生殖準(zhǔn)性生殖2. 2. 準(zhǔn)性生殖的意義準(zhǔn)性生殖的意義3. 3. 過(guò)程過(guò)程 微生物遺傳變異與菌種保藏1 準(zhǔn)性生殖準(zhǔn)性生殖同種異株同種異株的兩個(gè)體細(xì)胞融合，不經(jīng)減數(shù)分的兩個(gè)體細(xì)胞融合，不經(jīng)減數(shù)分裂而導(dǎo)致裂而導(dǎo)致低頻低頻基因重組發(fā)生的一種繁殖方式?；蛑亟M發(fā)生的一種繁殖方式。（單倍體體細(xì)胞重組單倍體體細(xì)胞重組）準(zhǔn)性生殖與有性生殖的不同：準(zhǔn)性生殖與有性生殖的不同： 重組體細(xì)胞和一般營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞外形沒(méi)有不同，重組體細(xì)

33、胞和一般營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞外形沒(méi)有不同， 不產(chǎn)生在特殊的囊器中。不產(chǎn)生在特殊的囊器中。 染色體的交換及單倍體化過(guò)程沒(méi)有規(guī)律性。染色體的交換及單倍體化過(guò)程沒(méi)有規(guī)律性。微生物遺傳變異與菌種保藏2 準(zhǔn)性生殖的意義準(zhǔn)性生殖的意義 對(duì)一些對(duì)一些沒(méi)有有性過(guò)程沒(méi)有有性過(guò)程但有重要生產(chǎn)價(jià)但有重要生產(chǎn)價(jià) 值的值的半知菌半知菌來(lái)說(shuō)，進(jìn)行基因在染色體來(lái)說(shuō)，進(jìn)行基因在染色體 上上定性研究定性研究、雜交育種雜交育種，準(zhǔn)性生殖提，準(zhǔn)性生殖提 供了一個(gè)重要的手段。供了一個(gè)重要的手段。 發(fā)現(xiàn)存在于發(fā)現(xiàn)存在于構(gòu)巢曲菌構(gòu)巢曲菌、米曲菌米曲菌、青霉青霉 等真菌和等真菌和放線菌放線菌中，使之有普遍意義。中，使之有普遍意義。微生物遺傳變異與菌

34、種保藏3 準(zhǔn)性生殖的過(guò)程準(zhǔn)性生殖的過(guò)程（1 1）菌絲聯(lián)結(jié)（）菌絲聯(lián)結(jié)（anastomosisanastomosis）; ; （2 2）形成異核體（形成異核體（heterocaryonheterocaryon）; ; 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核交流形成異核菌絲體。細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核交流形成異核菌絲體。（3 3）核配（）核配（caryogamy)caryogamy)形成雜合二倍體形成雜合二倍體; ; 特點(diǎn)：頻率低，特點(diǎn)：頻率低，1010-5-51010-7-7 促成：樟腦熏蒸、紫外、高溫。促成：樟腦熏蒸、紫外、高溫。 （4 4）體細(xì)胞交換和單倍體化）體細(xì)胞交換和單倍體化微生物遺傳變異與菌種保藏異核體異核體 同時(shí)具

35、有二種或二種以上不同基因型核在同同時(shí)具有二種或二種以上不同基因型核在同一細(xì)胞質(zhì)中，這種現(xiàn)象又叫異核現(xiàn)象。一細(xì)胞質(zhì)中，這種現(xiàn)象又叫異核現(xiàn)象。同核體同核體 同一菌絲中只有一種核。同一菌絲中只有一種核。 微生物遺傳變異與菌種保藏體細(xì)胞交換和單倍體化體細(xì)胞交換和單倍體化 體細(xì)胞交換：體細(xì)胞交換： 雜合二倍體細(xì)胞中有極少數(shù)細(xì)胞核在進(jìn)行雜合二倍體細(xì)胞中有極少數(shù)細(xì)胞核在進(jìn)行有絲分裂有絲分裂 的過(guò)程中，能發(fā)生體細(xì)胞染色體間的交換、分離的過(guò)程中，能發(fā)生體細(xì)胞染色體間的交換、分離 （單倍體化單倍體化）而產(chǎn)生具有新性狀的單倍體雜合子。）而產(chǎn)生具有新性狀的單倍體雜合子。 單倍體化單倍體化： 在一系列有絲分裂過(guò)程中一再

36、發(fā)生的個(gè)別染色體減在一系列有絲分裂過(guò)程中一再發(fā)生的個(gè)別染色體減 半，直至最后形成單倍體的過(guò)程。半，直至最后形成單倍體的過(guò)程。 微生物遺傳變異與菌種保藏（三）酵母菌的接合型遺傳（三）酵母菌的接合型遺傳酵母菌以單倍體或二倍體的狀態(tài)存在。酵母菌以單倍體或二倍體的狀態(tài)存在。單倍體：?jiǎn)伪扼w：a細(xì)胞或細(xì)胞或細(xì)胞，細(xì)胞，或稱或稱a a接合型，接合型，接合型。接合型。二倍體：二倍體： a細(xì)胞和細(xì)胞和細(xì)胞融合形成二倍體細(xì)胞。細(xì)胞融合形成二倍體細(xì)胞。接合型遺傳：接合型遺傳： a細(xì)胞細(xì)胞 細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。盒式機(jī)制轉(zhuǎn)變盒式機(jī)制轉(zhuǎn)變。微生物遺傳變異與菌種保藏啟動(dòng)子啟動(dòng)子沉默狀態(tài)沉默狀態(tài)沉默狀態(tài)沉默狀態(tài)a基因表達(dá)

37、?；虮磉_(dá)。a型細(xì)胞。型細(xì)胞。盒式機(jī)制轉(zhuǎn)變盒式機(jī)制轉(zhuǎn)變?cè)谟谠谟?MAT活性區(qū)的調(diào)控作用活性區(qū)的調(diào)控作用微生物遺傳變異與菌種保藏第四節(jié)第四節(jié) 微生物育種微生物育種一一 誘變育種誘變育種 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選三三 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合微生物遺傳變異與菌種保藏一一 誘變育種誘變育種1 1、概念、概念2 2、誘變劑、誘變劑3. 3. 誘變程序誘變程序4 4、誘變的主要環(huán)節(jié)、誘變的主要環(huán)節(jié)微生物遺傳變異與菌種保藏1 1、概念、概念誘變育種誘變育種是用物理或化學(xué)的是用物理或化學(xué)的誘變劑誘變劑使誘變使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNADNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起生

38、改變，引起性狀變異性狀變異并通過(guò)并通過(guò)篩選篩選獲得符獲得符合要求的合要求的變異菌株變異菌株的一種育種方法。的一種育種方法。微生物遺傳變異與菌種保藏2 誘變劑誘變劑（1 1） 概念概念：凡能提高基因突變頻率的理化因素。：凡能提高基因突變頻率的理化因素。 （2 2） 種類種類： 1 1）物理因子（物理因子（phisical agents) phisical agents) 物理誘變劑：物理誘變劑：U.VU.V、快中子、超聲波等?？熘凶印⒊暡ǖ?。 2 2）化學(xué)因子化學(xué)因子( (chemical agents) chemical agents) 微生物遺傳變異與菌種保藏化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑 堿基修飾

39、劑堿基修飾劑 如如：羥胺、羥胺、氮芥、硫酸二乙酯（氮芥、硫酸二乙酯（DESDES）、）、亞硝基胍（亞硝基胍（NTGNTG） 機(jī)制機(jī)制：對(duì)堿基做修飾，改變堿基的配對(duì)性質(zhì)。：對(duì)堿基做修飾，改變堿基的配對(duì)性質(zhì)。 堿基類似物堿基類似物 如如：疊氮胸腺嘧啶（：疊氮胸腺嘧啶（AITAIT）、）、5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-5-UBUB）、 2- 2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2AP2AP）等。）等。 機(jī)制機(jī)制：在：在DNADNA復(fù)制時(shí)將堿基類似物插入復(fù)制時(shí)將堿基類似物插入DNADNA中，而堿基中，而堿基 類似物存在正常狀態(tài)和稀有狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，在類似物存在正常狀態(tài)和稀有狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，在DNADNA 復(fù)制時(shí)出現(xiàn)突變

40、體。復(fù)制時(shí)出現(xiàn)突變體。微生物遺傳變異與菌種保藏插入劑插入劑 ( (intercalating agents):intercalating agents): 如如：溴化乙錠、吖啶橙等一些：溴化乙錠、吖啶橙等一些三環(huán)分子三環(huán)分子。 機(jī)制機(jī)制：在形態(tài)上類似于堿基對(duì)的扁平分子。它們插入：在形態(tài)上類似于堿基對(duì)的扁平分子。它們插入DNADNA分子的堿基對(duì)之間，使其分開(kāi)，導(dǎo)致分子的堿基對(duì)之間，使其分開(kāi)，導(dǎo)致DNADNA在復(fù)制過(guò)程在復(fù)制過(guò)程中的滑動(dòng)，引起移碼突變。中的滑動(dòng)，引起移碼突變。 微生物遺傳變異與菌種保藏與胞嘧啶反應(yīng)，加上羥基（與胞嘧啶反應(yīng)，加上羥基（-OH-OH），對(duì)胞嘧啶加），對(duì)胞嘧啶加以修飾。修

41、飾后的胞嘧啶類似胸腺嘧啶以修飾。修飾后的胞嘧啶類似胸腺嘧啶T T。C G 羥基化的胞嘧啶羥基化的胞嘧啶 A誘發(fā)誘發(fā)CG到到TA的的轉(zhuǎn)換突變轉(zhuǎn)換突變堿基修飾劑堿基修飾劑-羥胺羥胺微生物遺傳變異與菌種保藏堿基類似物堿基類似物5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5BU5BU）正常狀態(tài)：正常狀態(tài)：類似胸腺嘧啶，與腺嘌呤配對(duì)。類似胸腺嘧啶，與腺嘌呤配對(duì)。 A 5BU A T下一輪下一輪復(fù)制復(fù)制稀有狀態(tài)稀有狀態(tài)：類似胞嘧啶，只與鳥(niǎo)嘌呤配對(duì)。類似胞嘧啶，只與鳥(niǎo)嘌呤配對(duì)。 G 5BU G C下一輪下一輪復(fù)制復(fù)制正常狀態(tài)和正常狀態(tài)和稀有狀態(tài)可稀有狀態(tài)可以相互轉(zhuǎn)換以相互轉(zhuǎn)換微生物遺傳變異與菌種保藏B DNA分子吸收稀有狀

42、態(tài)的分子吸收稀有狀態(tài)的5BU G 5BU A TDNA復(fù)制轉(zhuǎn)換復(fù)制轉(zhuǎn)換成正常狀態(tài)成正常狀態(tài)（G C）（取代（取代G C）A DNA分子吸收正常狀態(tài)的分子吸收正常狀態(tài)的5BU A 5BU G CDNA復(fù)制轉(zhuǎn)換復(fù)制轉(zhuǎn)換成稀有狀態(tài)成稀有狀態(tài)（A T）（取代（取代A T）堿基類似物堿基類似物5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5BU5BU）微生物遺傳變異與菌種保藏圖示 (a) 增加堿基 插入劑分子 模板鏈 5 ATCAG TTACT3 新合成鏈 3TAGTC G AATGA5 068nm 隨機(jī)選擇堿基 嵌入插入劑處 下一輪復(fù)制 5 ATCAG C TTACT 3 3TAGTC G AATGA 5(b)缺失堿基

43、 模板鏈 5 ATCAG T TACT3 新合成鏈 3TAGTC ATGA5 插入劑失去 后復(fù)制 插入劑 5 ATCAGTACT 3 3TAGTCATGA 5 圖 21-15 插入突變導(dǎo)制堿基的增加(a)和減少(b) 微生物遺傳變異與菌種保藏3 誘變程序誘變程序 原始菌種原始菌種 原菌種特性鑒定原菌種特性鑒定 純化純化 斜面斜面/ /肉湯肉湯 培養(yǎng)單孢子培養(yǎng)單孢子/ /單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞懸液 誘變劑處理誘變劑處理 計(jì)算存活率計(jì)算存活率 平板分離平板分離 觀察形態(tài)變異，挑單菌落觀察形態(tài)變異，挑單菌落 移至斜面移至斜面 初篩初篩 復(fù)篩復(fù)篩 小試小試 良種保藏良種保藏 中試中試微生物遺傳變異與菌種保藏

44、4 誘變的主要環(huán)節(jié)誘變的主要環(huán)節(jié)（1）誘變劑的選擇）誘變劑的選擇（2）出發(fā)菌株的選擇）出發(fā)菌株的選擇（3）單孢子或單細(xì)胞懸液的制備單孢子或單細(xì)胞懸液的制備（4 4）設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法）設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法 微生物遺傳變異與菌種保藏（1 1）誘變劑的選擇：）誘變劑的選擇： 1 1）了解誘變劑的性質(zhì)、作用機(jī)理和使用方法。了解誘變劑的性質(zhì)、作用機(jī)理和使用方法。 2 2）處理方式處理方式 單一因子處理：先后使用。單一因子處理：先后使用。 復(fù)合因子處理：兩種以上因素同時(shí)使用、單一復(fù)合因子處理：兩種以上因素同時(shí)使用、單一 因子重復(fù)使用。因子重復(fù)使用。 3 3）處理劑量：測(cè)致死率。

45、處理劑量：測(cè)致死率。 方法：平板菌落計(jì)數(shù)法方法：平板菌落計(jì)數(shù)法 一般殺菌率為一般殺菌率為70%70%左右。左右。 微生物遺傳變異與菌種保藏（2 2）出發(fā)菌株：）出發(fā)菌株： 育種的原始菌種應(yīng)具備：育種的原始菌種應(yīng)具備： 對(duì)誘變劑的敏感性高；對(duì)誘變劑的敏感性高； 生產(chǎn)中選育過(guò)的自發(fā)變異菌株；生產(chǎn)中選育過(guò)的自發(fā)變異菌株； 本身具有一些有利性狀；本身具有一些有利性狀； 對(duì)代謝產(chǎn)物有一定積累；對(duì)代謝產(chǎn)物有一定積累； 已經(jīng)發(fā)生過(guò)某些變異。已經(jīng)發(fā)生過(guò)某些變異。微生物遺傳變異與菌種保藏（3 3）單孢子或單細(xì)胞懸液的制備）單孢子或單細(xì)胞懸液的制備 1 1）必要性）必要性：?jiǎn)渭?xì)胞可均勻地接觸誘變劑，避免出現(xiàn)不：?jiǎn)?/p>

46、細(xì)胞可均勻地接觸誘變劑，避免出現(xiàn)不 純的菌落純的菌落菌種退化。菌種退化。 2 2）制備）制備： 物理誘變劑物理誘變劑生理鹽水（生理鹽水（0.85%0.85%NaCl) NaCl) 化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑緩沖液。緩沖液。 3 3）方法）方法：三角瓶?jī)?nèi)加：三角瓶?jī)?nèi)加0.5cm0.5cm玻璃珠打散玻璃珠打散10-1510-15min; min; 加加.3%.3%吐溫吐溫8080（表面活性劑，用無(wú)菌脫脂棉過(guò)（表面活性劑，用無(wú)菌脫脂棉過(guò) 濾）。濾）。 4 4）濃度）濃度：細(xì)菌、放線菌：細(xì)菌、放線菌 10 108 8個(gè)個(gè)/ /ml ml 霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌 10 106 6個(gè)個(gè)/ /mlml 微生物遺

47、傳變異與菌種保藏（4 4）設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法）設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法 1 1）初篩）初篩：平板上做定性、半定量的測(cè)定，觀察突變株的平板上做定性、半定量的測(cè)定，觀察突變株的 生理效應(yīng)范圍。生理效應(yīng)范圍。 方法方法 梯度平板法（抗性菌株）梯度平板法（抗性菌株） 紙片法（抗性菌株）紙片法（抗性菌株） 透明圈法（淀粉酶產(chǎn)生菌株等）透明圈法（淀粉酶產(chǎn)生菌株等） 變色圈法（氨基酸生產(chǎn)菌株）變色圈法（氨基酸生產(chǎn)菌株） 2 2）復(fù)篩）復(fù)篩： 較精確的生物化學(xué)分析方法較精確的生物化學(xué)分析方法做搖瓶測(cè)定做搖瓶測(cè)定 微生物遺傳變異與菌種保藏二二 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選（一）概念（一

48、）概念（二）篩選方法（二）篩選方法（三）應(yīng)用（三）應(yīng)用 微生物遺傳變異與菌種保藏（一）（一） 概念概念1. 1. 三種遺傳型個(gè)體三種遺傳型個(gè)體2 2、篩選用的培養(yǎng)基、篩選用的培養(yǎng)基微生物遺傳變異與菌種保藏 1 三種遺傳型個(gè)體三種遺傳型個(gè)體（1 1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型（）營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotrophauxotroph）： 經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng) 基內(nèi)加入相應(yīng)有機(jī)養(yǎng)分才能正常生長(zhǎng)的變異菌株?；鶅?nèi)加入相應(yīng)有機(jī)養(yǎng)分才能正常生長(zhǎng)的變異菌株。 如：如：LysLys- - ; Bio ; Bio- -（2 2）野生型野生型( (wild typ

49、e)wild type)： 自然界分離到的任何微生物，在其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷突自然界分離到的任何微生物，在其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷突 變前的原始菌株，為該微生物的野生型。變前的原始菌株，為該微生物的野生型。如：如：Lys+Lys+； Bio+Bio+（3 3）原養(yǎng)型原養(yǎng)型 ( (prototroph)prototroph) ： 指指auxoauxo突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野 生型的表型相同。生型的表型相同。 微生物遺傳變異與菌種保藏2 篩選用的培養(yǎng)基篩選用的培養(yǎng)基1 1）基本培養(yǎng)基（）基本培養(yǎng)基（minimal medium,MMminimal mediu

50、m,MM）-： 僅能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的培養(yǎng)基。僅能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的培養(yǎng)基。2 2）完全培養(yǎng)基（）完全培養(yǎng)基（complete medium,CMcomplete medium,CM）+： 滿足一切滿足一切auxotrophauxotroph生長(zhǎng)的天然或半組合培養(yǎng)基。生長(zhǎng)的天然或半組合培養(yǎng)基。3 3）補(bǔ)充培養(yǎng)基（）補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplemented medium,SMsupplemented medium,SM） x x： 在在MMMM中有針對(duì)性地加入一或幾種營(yíng)養(yǎng)成分以滿足相中有針對(duì)性地加入一或幾種營(yíng)養(yǎng)成分以滿足相 應(yīng)應(yīng)auxotrophauxotroph生長(zhǎng)的組合培養(yǎng)基。生長(zhǎng)的

51、組合培養(yǎng)基。微生物遺傳變異與菌種保藏（二）篩選方法（二）篩選方法auxotroph的篩選程序的篩選程序：篩選一般要經(jīng)過(guò)篩選一般要經(jīng)過(guò)誘變誘變、淘淘汰野生型汰野生型、檢出檢出和和鑒定鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型四個(gè)環(huán)節(jié)。營(yíng)養(yǎng)缺陷型四個(gè)環(huán)節(jié)。 細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng) 離心洗滌離心洗滌 誘變處理誘變處理 在在CMCM上培養(yǎng)上培養(yǎng) 洗滌洗滌 MMMM培養(yǎng)（加青霉培養(yǎng)（加青霉 素等篩選劑）素等篩選劑） 涂布于涂布于CMCM平板平板 影印影印 培養(yǎng)培養(yǎng) 挑取挑取 鑒定鑒定 菌種保存。菌種保存。微生物遺傳變異與菌種保藏完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基微生物遺傳變異與菌種保藏（三）（三） auxotr

52、oph的應(yīng)用的應(yīng)用（1 1）作為標(biāo)記菌株）作為標(biāo)記菌株： 研究代謝、菌種雜交、重組育種和利用基因工研究代謝、菌種雜交、重組育種和利用基因工 程進(jìn)行育種時(shí)帶有特定基因標(biāo)記的親本菌。程進(jìn)行育種時(shí)帶有特定基因標(biāo)記的親本菌。（2 2）作為生產(chǎn)菌種）作為生產(chǎn)菌種：氨基酸、核苷酸等生產(chǎn)菌種；：氨基酸、核苷酸等生產(chǎn)菌種；（3 3）作為氨基酸、維生素、堿基等）作為氨基酸、維生素、堿基等物質(zhì)生物測(cè)定的物質(zhì)生物測(cè)定的 實(shí)驗(yàn)菌種。實(shí)驗(yàn)菌種。微生物遺傳變異與菌種保藏三三 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合（protoplast fusionprotoplast fusion） 使遺傳使遺傳性狀不同性狀不同的的兩兩細(xì)胞的細(xì)胞的原

53、生質(zhì)體原生質(zhì)體發(fā)生融發(fā)生融 合，并發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生融合子（合，并發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生融合子（fusantfusant） 的過(guò)程。的過(guò)程。 已成功地應(yīng)用于真菌細(xì)胞和植物細(xì)胞的屬間和已成功地應(yīng)用于真菌細(xì)胞和植物細(xì)胞的屬間和 科間的科間的遠(yuǎn)緣遠(yuǎn)緣細(xì)胞融合，細(xì)胞融合，融合產(chǎn)物含兩親代細(xì)胞融合產(chǎn)物含兩親代細(xì)胞 基因組?；蚪M。微生物遺傳變異與菌種保藏1 原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備2 原生質(zhì)體融合和再生原生質(zhì)體融合和再生3 融合子的選擇融合子的選擇微生物遺傳變異與菌種保藏1 1 原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備1）選擇兩個(gè)親本菌株。）選擇兩個(gè)親本菌株。 細(xì)菌用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蝸牛酶。細(xì)菌用溶菌酶；酵母

54、菌和霉菌用蝸牛酶。2）酶處理破壞細(xì)胞壁，使原生質(zhì)流出。）酶處理破壞細(xì)胞壁，使原生質(zhì)流出。制備用培養(yǎng)基：高滲緩沖液或培養(yǎng)基。制備用培養(yǎng)基：高滲緩沖液或培養(yǎng)基。微生物遺傳變異與菌種保藏2 2 原生質(zhì)體融合和再生原生質(zhì)體融合和再生1）原生質(zhì)體融合）原生質(zhì)體融合 化學(xué)因子誘導(dǎo)化學(xué)因子誘導(dǎo)：聚乙二醇：聚乙二醇（polyethyeneglycol，PEG） 并加入并加入Ca 2+、Mg 2+等陽(yáng)離子等陽(yáng)離子 電場(chǎng)誘導(dǎo)：電場(chǎng)誘導(dǎo)：電極極化原生質(zhì)體成偶極子，沿電力線電極極化原生質(zhì)體成偶極子，沿電力線 排列成串，電流脈沖，原生質(zhì)體膜被擊排列成串，電流脈沖，原生質(zhì)體膜被擊 穿，融合。穿，融合。2）原生質(zhì)體再生）原

55、生質(zhì)體再生 在再生培養(yǎng)基上再生。在再生培養(yǎng)基上再生。 再生率再生率0.幾幾%幾幾%.微生物遺傳變異與菌種保藏3 3 融合子的選擇融合子的選擇營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇 依靠在選擇培養(yǎng)基上的遺傳標(biāo)記，有兩個(gè)依靠在選擇培養(yǎng)基上的遺傳標(biāo)記，有兩個(gè)遺傳標(biāo)記互補(bǔ)，可確定為融合子。遺傳標(biāo)記互補(bǔ)，可確定為融合子?？顾幮詷?biāo)記。抗藥性標(biāo)記。微生物遺傳變異與菌種保藏第五節(jié)第五節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯及保藏菌種的衰退、復(fù)壯及保藏 一、菌種的衰退和復(fù)壯菌種的衰退和復(fù)壯 二、菌種保藏菌種保藏微生物遺傳變異與菌種保藏一、菌種的衰退和復(fù)壯一、菌種的衰退和復(fù)壯（一）衰退衰退（二）防止衰退的方法防止衰退的方法（三）菌種的

56、復(fù)壯菌種的復(fù)壯微生物遺傳變異與菌種保藏（一）衰退（一）衰退1 1、概念、概念：菌種經(jīng)長(zhǎng)期的人工：菌種經(jīng)長(zhǎng)期的人工培養(yǎng)或保藏培養(yǎng)或保藏, ,在其自在其自 發(fā)突變的影響下，引起某些發(fā)突變的影響下，引起某些優(yōu)良性狀優(yōu)良性狀 變?nèi)趸蛳ё內(nèi)趸蛳У默F(xiàn)象，稱為衰退。的現(xiàn)象，稱為衰退。 2 2、現(xiàn)象、現(xiàn)象 （1 1）菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；）菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；（2 2）生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少；）生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少；（3 3）代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降；）代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降； （4 4）抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。）抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。微生物遺傳

57、變異與菌種保藏 基因負(fù)突變基因負(fù)突變不利突變不利突變（1 1）多次傳代造成負(fù)突變數(shù)量增加）多次傳代造成負(fù)突變數(shù)量增加 如斜面保藏如斜面保藏 細(xì)菌：細(xì)菌：1 1個(gè)月個(gè)月 酵母菌：酵母菌：3 3個(gè)月個(gè)月 放線菌、霉菌、芽孢：半年放線菌、霉菌、芽孢：半年（2 2） 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件；（3 3） 誘變時(shí)出現(xiàn)不純菌落。誘變時(shí)出現(xiàn)不純菌落。3 3、衰退的原因、衰退的原因微生物遺傳變異與菌種保藏（二）防止衰退的方法（二）防止衰退的方法 1 1、控制傳代次數(shù)；、控制傳代次數(shù)； 2 2、選擇合適的培養(yǎng)條件；、選擇合適的培養(yǎng)條件； 3 3、采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代；、采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代； 4 4、采用有

58、效的菌種保藏方法。、采用有效的菌種保藏方法。微生物遺傳變異與菌種保藏（三）菌種的復(fù)壯（三）菌種的復(fù)壯1 1 復(fù)壯復(fù)壯：使衰退的菌種恢復(fù)原來(lái)優(yōu)良性狀的使衰退的菌種恢復(fù)原來(lái)優(yōu)良性狀的 方法。方法。2 2 復(fù)壯的方法復(fù)壯的方法： （1 1）純種分離：純種分離： 菌落純（劃線法、涂布法、傾注法）菌落純（劃線法、涂布法、傾注法） 菌株純（單細(xì)胞挑取法）菌株純（單細(xì)胞挑取法） （2 2）通過(guò)寄主體進(jìn)行復(fù)壯；通過(guò)寄主體進(jìn)行復(fù)壯； （3 3）淘汰已衰退的個(gè)體。淘汰已衰退的個(gè)體。微生物遺傳變異與菌種保藏二、菌種保藏二、菌種保藏（一）目的（一）目的（二）原理（二）原理（三）方法（三）方法微生物遺傳變異與菌種保藏（

59、一）目的（一）目的1 1、存活，不丟失，不污染存活，不丟失，不污染 2 2、防止優(yōu)良性狀喪失防止優(yōu)良性狀喪失 3 3、隨時(shí)為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種隨時(shí)為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種 創(chuàng)造一定條件，盡可能創(chuàng)造一定條件，盡可能降低降低微生物微生物代謝活動(dòng)代謝活動(dòng)強(qiáng)度，使之基本上處于強(qiáng)度，使之基本上處于休眠狀態(tài)。休眠狀態(tài)。條件：條件：1 1）挑選優(yōu)良純種的休眠體；挑選優(yōu)良純種的休眠體；2 2）創(chuàng)造適合長(zhǎng)期休眠的環(huán)境條件（干燥、低溫、創(chuàng)造適合長(zhǎng)期休眠的環(huán)境條件（干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)、添加保護(hù)劑等）缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)、添加保護(hù)劑等）（二）原理（二）原理微生物遺傳變異與菌種保藏（三）方法（三）方法1 1、暫時(shí)保藏法、暫時(shí)保藏法斜面保藏斜面保藏2 2、長(zhǎng)期保藏法、長(zhǎng)期保藏法 微生物遺傳變異與菌種保藏1 1、暫時(shí)保藏法、暫時(shí)保藏法斜面保藏斜面保藏（1 1）方法）方法：斜面置：斜面置44冰