微生物檢驗(yàn)操作規(guī)程

1、-作者xxxx-日期xxxx微生物檢驗(yàn)操作規(guī)程【精品文檔】 微生物檢驗(yàn)操作規(guī)程1. 目的建立微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，保證檢驗(yàn)操作規(guī)范化。2. 范圍適用于本公司相關(guān)的微生物檢驗(yàn)活動的全過程。3. 職責(zé)3.1 微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)微生物檢驗(yàn)的全過程；3.2 QC主管負(fù)責(zé)監(jiān)督檢查本規(guī)程的有效實(shí)施。4. 操作規(guī)程4.1 微生物檢驗(yàn)玻璃器皿吸管的洗滌4.1.1 一般的玻璃器皿（例如培養(yǎng)皿、試管、三角瓶等），可用毛刷及洗滌劑洗去灰塵、油垢，然后用自來水、蒸餾水充分沖洗，直至玻璃器皿內(nèi)壁均勻分布一層薄的水膜，即器壁既不掛水珠也無條紋，即洗滌達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。4.1.2 玻璃器皿內(nèi)有污跡不能洗凈時，可浸泡于洗液中，待器皿

2、中有機(jī)物氧化分解后，取出用自來水、蒸餾水沖洗干凈，備用。4.1.3 新購的玻璃器皿先用2鹽酸浸泡，再用用自來水、蒸餾水充分沖洗。4.2 器皿的包扎4.2.1 試管：塞上膠塞，然后用牛皮紙或報紙把試管頭包扎起來。做發(fā)酵試驗(yàn)時，將試管頭塞上專用的耐高溫PVC試管帽。4.2.2 三角瓶、抽濾瓶：將三角瓶（抽濾瓶）口塞上膠塞，然后用牛皮紙把塞頭部包起來。4.2.3 吸管：將耐高溫的移液槍頭裝盒，用用牛皮紙或報紙包裹。4.2.4 平皿：10個為一組，用牛皮紙包裹。4.3消毒和滅菌：4.3.1 化學(xué)滅菌：此法適用于微生物操作過程中不能加熱、紫外線的地方。如人手等。（1）用75%的乙醇溶液或0.1%新潔爾滅

3、擦拭或浸泡。（2）一般用12%的甲醛液浸泡軟管和用具。（3）一般成品漂白粉的有效成分是2532% 。使用時配成有效成份的2%溶液灑在地面或容器內(nèi)，（對金屬有腐蝕作用）放置1015min后沖洗即可。（4）氯滅菌劑的能力以有效氯表示，將氯水配制成50100PPm 的有效氯溶液，可用于浸泡，沖洗和表面殺菌。但氯對金屬有腐蝕作用。4.3.2 物理滅菌：4.3.2.1 干熱滅菌：適用于干燥的玻璃器皿（吸管、平皿等）、金屬器具（鑷子等）、固體試液、液狀石蠟等。滅菌條件一般選用在160干熱空氣滅菌2h。（1）器具用牛皮紙或滅菌袋包（裝）扎，放入金屬容器內(nèi)。（2）器具在干燥箱加熱前放入，每個器具之間留有足夠的

4、空隙，使熱空氣能暢通。（3）關(guān)閉箱門接通電源，打開通氣孔，使箱內(nèi)濕空氣能逸出，至箱內(nèi)溫度達(dá)到100時關(guān)閉。（4）加熱至160，保持2小時。（5）切斷電源，冷卻至60 時，打開箱門，取出滅菌器具，并打開箱頂通氣口。注：滅菌時必須注意溫度不能超過180，以免使棉花、報紙烘焦；滅菌時不得打開箱門；干燥箱未冷卻時，不要取出里面器具，防止內(nèi)外溫差過大造成玻璃器具爆炸璃器具爆炸。4.3.2.2 濕熱滅菌：適用于容器、培養(yǎng)基、無菌衣、膠塞以及其他遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損傷的物品。詳見壓力蒸汽滅菌器操作規(guī)程。（1）裝入培養(yǎng)基的瓶用膠塞蓋上，再用牛皮紙包扎。（2）瓶中的培養(yǎng)液不要超過1L，否則滅菌不徹底。（3

5、）容器的上部應(yīng)留有足夠的空間（一般不超過裝量的2/3），以便產(chǎn)生氣泡。（4）器具用牛皮紙包裹。（5）器具的組合和包裹應(yīng)允許滅菌蒸汽接觸所用物品。（6）各類器具裝入滅菌器時，相互間要留有空隙以使蒸汽自由流動。4.4 無菌操作的準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)4.4.1 微生物室應(yīng)定期按微生物實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)程清潔。4.4.2 微生物室使用前，應(yīng)先打開紫外燈滅菌2030min。4.4.3 微生物室應(yīng)備有專用剪刀、鑷子、接種針，每次使用前后應(yīng)滅菌消毒。4.4.4 微生物室應(yīng)備有75%酒精棉球；新潔爾滅消毒液內(nèi)浸紗布數(shù)塊，備用。4.4.5 進(jìn)入微生物，換專用鞋，穿好潔凈服，離室時脫去潔凈服和專用鞋，潔凈服和專用鞋只準(zhǔn)在

6、微生物室內(nèi)使用，不準(zhǔn)穿到其它地方去，并定期洗換和消毒滅菌。4.4.6 樣品檢驗(yàn)前應(yīng)在原始記錄本上記錄名稱、批號等內(nèi)容，并在所用平皿或試管上詳細(xì)記錄樣品序號、檢驗(yàn)日期等內(nèi)容。4.4.7 無菌操作前，用75%的酒精棉球擦手。4.4.8 操作要正確迅速，所用的器皿均應(yīng)是經(jīng)過嚴(yán)格滅菌的器皿。4.4.9 檢驗(yàn)完畢，立即清理工作臺，棄去不需要物品，打開紫外燈滅菌2030min。4.5 微生物檢驗(yàn)用培養(yǎng)基、溶液的配制、使用與儲存配制方法參見培養(yǎng)基說明書或檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下規(guī)定配制。4.5.1 水：電導(dǎo)率在25時不超過25s/cm，除非另有規(guī)定要求。4.5.2 稱重和溶解：保存培養(yǎng)基的時間需視培養(yǎng)基中水份蒸發(fā)的程度

7、及有無污染而定，已制備好的培養(yǎng)基要保存于冰箱中。在冰箱中存放的培養(yǎng)基在使用前要先置于室溫30min，使其與室溫一致再使用，因?yàn)闅怏w的溶解度可因溫度上升而降低，特別是乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)的倒管會因溫度上升而出現(xiàn)氣泡，這一點(diǎn)必須注意。4.5.3 pH 的測定和調(diào)整： 用pH計(jì)測pH，必要時在滅菌前進(jìn)行調(diào)整，除特殊說明外，培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25時，pH應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)pH0.2范圍內(nèi)。一般使用濃度約為40g/L（約1mol/L）的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5 g/L（約1mol/L）的鹽酸溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH。4.5.4 分裝：將配好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦校萜鞯捏w積應(yīng)比培養(yǎng)基體積最少大20%。4.5.6

8、 培養(yǎng)基的使用：經(jīng)過高壓的培養(yǎng)基應(yīng)盡量減少重新加熱時間，融化后避免過度加熱。融化后應(yīng)短暫置于室溫中（如2 min）以避免玻璃瓶破碎。 融化后的培養(yǎng)基放入4750的恒溫水浴鍋中冷卻保溫，且應(yīng)盡快使用，放置時間一般不應(yīng)超過4 h。未用完的培養(yǎng)基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培養(yǎng)基尤應(yīng)注意，融化后保溫時間應(yīng)盡量縮短，如有特定要求可參考指定的標(biāo)準(zhǔn)。 4.5.7平板的制備和儲存 傾注融化的培養(yǎng)基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少為3 mm（直徑90 mm的平皿，通常要加入18 mL20 mL瓊脂培養(yǎng)基）。將平皿蓋好皿蓋后放到水平平面使瓊脂冷卻凝固。如果平板需儲存，或者培養(yǎng)時間超過48h或培養(yǎng)溫度高于4

9、0，則需要傾注更多的培養(yǎng)基。凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放于暗處和（或）53冰箱的密封袋中，以防止培養(yǎng)基成分的改變。在平板底部或側(cè)邊做好標(biāo)記，標(biāo)記的內(nèi)容包括名稱、制備日期和（或）有效期。也可使用適宜的培養(yǎng)基編碼系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記。 將倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延長儲存期限。為了避免冷凝水的產(chǎn)生，平板應(yīng)冷卻后再裝入袋中。儲存前不要對培養(yǎng)基表面進(jìn)行干燥處理。 對于采用表面接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，應(yīng)先對瓊脂表面進(jìn)行干燥：揭開平皿蓋，將平板倒扣于烘箱或培養(yǎng)箱中（溫度設(shè)為2550）；或放在有對流的無菌凈化臺中，直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止。注意不要過度干燥。商品化的平板瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說

10、明使用。4.6 檢驗(yàn)方法做樣前，將滅菌好的吸管、培養(yǎng)皿等放入操作臺上，操作臺、微生物室紫外線滅菌30min，然后關(guān)紫外線滅菌燈，開啟凈風(fēng)循環(huán)30min后開始做樣。詳見附錄各檢測方法附錄1 菌落總數(shù)測定附錄2 霉菌和酵母計(jì)數(shù)附錄3 大腸菌群計(jì)數(shù)附錄4 大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)附錄5 沙門氏菌檢驗(yàn)附錄6 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)附錄1 菌落總數(shù)的測定方法1. 樣品的稀釋1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水中均質(zhì)1 min2 min制成1:10 的樣品勻液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適

11、當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。1.3 用1mL微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面），換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.4 按4.6.1.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1 mL無菌吸頭。1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。1.6

12、 及時將15mL20mL冷卻至46的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置461恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。2. 培養(yǎng)2.1 待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，361培養(yǎng)48h2h。如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4 mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按條件進(jìn)行培養(yǎng)。 菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（CFU）表示。2選取菌落數(shù)在30CFU300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU可記錄為多不可計(jì)。每個稀釋

13、度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。2.3.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。2.3.3 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計(jì)數(shù)。3 結(jié)果與報告菌落總數(shù)的計(jì)算方法3.1.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。3.1.2 若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時，按下式計(jì)算：N=Cn1+0.

14、1n2d式中：N樣品中菌落數(shù)；C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。3.1.3 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。3.1.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。3.1.5若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。3.1.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU300CFU之間，其中一部分小于

15、30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。3.2 菌落總數(shù)的報告3.2.1 菌落數(shù)小于100 CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。3.2.2 菌落數(shù)大于或等于100 CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。3.2.3 若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報告菌落蔓延。3.2.4 若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。3.2.5 稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。附錄2霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)1

16、. 樣品的稀釋1.1 固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，充分振搖，即1:10稀釋液。1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL無菌蒸餾水的錐形瓶（可在瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3 取1mL1:10稀釋液注入含有9mL無菌水的試管中, 另換一支1mL無菌吸管反復(fù)吹吸，此液為1:100稀釋液。1.4 按1.3 操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管。1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同

17、時，每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個無菌平皿內(nèi)。同時分別取1mL樣品稀釋液加入2個無菌平皿作空白對照。1.6 及時將15mL20mL冷卻至46的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基（可放置于461恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。2. 培養(yǎng)待瓊脂凝固后，將平板倒置，281培養(yǎng)5d，觀察并記錄。3. 菌落計(jì)數(shù)肉眼觀察，必要時可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的霉菌和酵母數(shù)。以菌落形成單位（CFU）表示。選取菌落數(shù)在10CFU150CFU的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計(jì)數(shù)霉菌和酵母數(shù)。霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計(jì)。菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。4. 結(jié)果與報告4.1

18、計(jì)算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算。4.1.2 若所有平板上菌落數(shù)均大于150CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。4.1.3 若所有平板上菌落數(shù)均小于10 CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。4.1.4 若所有稀釋度平板均無菌生長，則以小于1乘最低稀釋倍數(shù)計(jì)算；如為原液，則以小于1計(jì)數(shù)。4.2 報告4.2.1 菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報告。4.2.2 菌落數(shù)大于或等于100時，前3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示

19、結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來表示，此時也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字。4.2.3 稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告，報告或分別報告霉菌和/或酵母數(shù)。附件A菌落總數(shù)、霉菌及酵母數(shù)檢驗(yàn)流程圖附錄3大腸菌群計(jì)數(shù)第一法 MPN計(jì)數(shù)1. 樣品的稀釋1.1 固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水均質(zhì)1min2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋制成1:10 的樣品勻液。1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充

20、分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3 樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，必要時分別用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)節(jié)。1.4 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面），換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。2. 初發(fā)酵試驗(yàn)每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣

21、品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），361 培養(yǎng)24h2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。3. 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，361培養(yǎng)48h2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。4. 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告按3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附件B，表1），報告每g（mL）樣品中大

22、腸菌群的MPN值。第二法 平板計(jì)數(shù)法1. 樣品的稀釋按第一法中的1進(jìn)行。2. 平板計(jì)數(shù)2.1 選取2個3個適宜的連續(xù)稀釋度, 每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。2.2 及時將15mL20mL冷至46的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于361培養(yǎng)18h24h。2.3 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU150CFU 之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑

23、為或更大。3. 證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，361培養(yǎng)24h48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。4. 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以2.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。附件B表1 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表陽性管數(shù)MP

24、N95%置信區(qū)間陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間上限下限上限下限00000011111111222222001123000112230001110101000120101001201211111115161420152027-111818381818382038424242384242424294222223333333333333332223300011112222333301201012012301230123212835293623386443751201609315021029024046011001100179173740183740904290180420429494949494110

25、1801802004204204204204301000100020004100注1：本表采用3個稀釋度0.1g (mL)、0.01g (mL)和0.001g (mL)，每個稀釋接種3管。注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g (mL)、0.1g (mL)和0.01g(mL)時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g (mL)時，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推?！揪肺臋n】附件 C大腸菌群計(jì)數(shù)檢驗(yàn)流程圖第一法 MPN計(jì)數(shù)法 第二法 平板計(jì)數(shù)法附錄4大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)第一法 MPN計(jì)數(shù)法1. 樣品的稀釋1.1 固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛

26、有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水均質(zhì)1min2min,制成1:10 的樣品勻液。1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3 樣品勻液的pH值應(yīng)在之間，必要時分別用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)節(jié)。1.4 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面），換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)

27、，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。2. 初發(fā)酵試驗(yàn)每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），361 培養(yǎng)24h2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。如所有LST 肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN 結(jié)果。3. 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LS

28、T肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于已提前預(yù)溫至45的EC 肉湯管中，放入帶蓋的水浴箱內(nèi)。水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)24h2h，檢查小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h。記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的EC肉湯管數(shù)。如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行EMB平板分離培養(yǎng)。4. 伊紅美藍(lán)平板分離培養(yǎng)輕輕振搖各產(chǎn)氣管，用接種環(huán)取培養(yǎng)物分別劃線接種于EMB平板，361培養(yǎng)18h24h。觀察平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。5. 營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)從每個平板上挑5 個典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心

29、部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上，361，培養(yǎng)18h24h。取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗(yàn)。6. 鑒定取培養(yǎng)物進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)、MR（甲基紅）-VP試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)（詳見生化試劑盒使用）。5.3 大腸埃希氏菌MPN 計(jì)數(shù)的報告大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，IMViC生化試驗(yàn)為或。只要有1個菌落鑒定為大腸埃希氏菌，其所代表的LST肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表（見附件D，表2），報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌MPN值。第二法 平板計(jì)數(shù)法1. 樣品稀釋按第一法中的1進(jìn)行2. 平板計(jì)數(shù)2.1 選取2個3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，

30、每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL稀釋液加入無菌平皿做空白對照。2.2 將10mL15mL冷至45的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加3mL4mL VRBA-MUG覆蓋平板表層。凝固后翻轉(zhuǎn)平板，361培養(yǎng)18h24h。2.3 平板菌落數(shù)的選擇選擇菌落數(shù)在10CFU100CFU之間的平板，暗室中360nm366nm 波長紫外燈照射下，計(jì)數(shù)平板上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。檢驗(yàn)時用已知MUG陽性菌株（如大腸埃希氏菌ATCC 25922）和產(chǎn)氣腸桿菌（如ATCC 13048）做陽性和陰性對照。3. 大腸埃希氏菌平板

31、計(jì)數(shù)的報告兩個平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌數(shù)，以CFU/g (mL)表示。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。附件D 表2 大腸埃希氏菌最可能數(shù)（MPN）檢索表陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間陽性管數(shù)MPN95%置信區(qū)間上限下限上限下限00000011111111222222001123000112230001110101000120101001201211111115161420152027-111818381818382038424242384242424294222223333333333333332

32、2233000111122223333012010120123012301232128352936233864437512016093150210290240460110011001791737401837409042901804204294949494941101801802004204204204204301000100020004100注1：本表采用3個稀釋度0.1g (mL)、0.01g (mL)和0.001g (mL)，每個稀釋接種3管。注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g (mL)、0.1g (mL)和0.01g(mL)時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g

33、(mL)、0.0001g (mL)時，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。附件E大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)流程圖第一法 MPN計(jì)數(shù) 第二法 平板計(jì)數(shù)法附錄5 沙門氏菌檢驗(yàn)1. 前增菌稱取25g（mL）樣品放入盛有225mLBPW的容器中，均質(zhì)1min2 min。若樣品為液態(tài)，振蕩混勻。如需測定pH 值，用1mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.80.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，于361培養(yǎng)8h18h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45以下不超過15min，或25不超過18h解凍。2. 增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB 內(nèi)，于421培養(yǎng)18h24h。同時，另取

34、1mL，轉(zhuǎn)種于10mL SC內(nèi)，于361培養(yǎng)18h24h。3. 分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD 瓊脂平板。于361分別培養(yǎng)18h24h（XLD 瓊脂平板）或40h48h（BS瓊脂平板），觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上的菌落特征見表3：表3 沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落形態(tài)選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS 瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。XLD 瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色

35、中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)基的說明進(jìn)行判定。4. 生化試驗(yàn)4.1 自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接營養(yǎng)瓊脂平板，于361培養(yǎng)18h24h，必要時可延長至48h。4.2 用接種針挑取營養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)物，分別接種賴氨酸和賴氨酸對照管，361培養(yǎng)18h24h。 在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表4。表4 沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫酸酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果三糖鐵瓊脂賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫KA（）（）可疑沙門氏菌屬KA（）（）可疑沙門氏菌屬AA（

36、）（）可疑沙門氏菌屬AA/非沙門氏菌KK/非沙門氏菌注： K（產(chǎn)堿，紅色）；A（產(chǎn)酸，黃色）；產(chǎn)氣（斷層）；產(chǎn)硫化氫（變黑）（陽性，）；（陰性）；（）：多數(shù)陽性，少數(shù)陰性；/：陽性或陰性。4.3 當(dāng)三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)的初步判斷為可疑沙門氏菌屬時，用接種環(huán)挑?。ㄝ^大菌落取一半菌落，小菌落取一個）營養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)物，接種到3mL無菌水中，振搖制成麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，用無菌吸管接種于沙門氏菌干制生化鑒定盒（北京路橋）的9個圓孔中，每孔，蓋上盒蓋，于36 1 培養(yǎng)。各生化反應(yīng)的培養(yǎng)及結(jié)果見表5、表6。注：將已挑菌落的平板儲存于25或室溫至少保留24h，以備必要時復(fù)查。表5 生化試劑盒（北京路橋

37、）結(jié)果判定表試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果判定沙門氏菌生化現(xiàn)象培養(yǎng)時間說明備注陰性結(jié)果陽性結(jié)果氨基酸對照黃色18h24h接種后需滴加2-3滴滅菌液體石蠟覆蓋培養(yǎng)及表面出現(xiàn)黃色即為陰性賴氨酸脫羧酶對照管黃色對照管黃色陽性或陰性試驗(yàn)管黃色試驗(yàn)管紫色氰化鉀對照生長24h48h生長為混濁氰化鉀對照管生長對照管生長不生長試驗(yàn)管不生長試驗(yàn)管生長靛基質(zhì)黃色玫瑰紅色大多數(shù)陰性18h24h培養(yǎng)后滴加2-3滴靛基質(zhì)試劑，即刻觀察。-尿素黃色或橙色玫瑰紅色或紅色18h24h-甘露醇藍(lán)色或綠色黃色陽性18h24h-山梨醇大多數(shù)陽性O(shè)NPG不變色黃色陽性或陰性1h3h和24h-表6 沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號硫化氫（H2S）靛

38、基質(zhì)pH 7.2 尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶A1A2A3/注：陽性；陰性；/陽性或陰性。4.3.1 反應(yīng)序號A1：典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN 和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按表7可判定為沙門氏菌。 如有2 項(xiàng)異常為非沙門氏菌。表7 沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判 定 結(jié) 果甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）沙門氏菌或（要求符合本群生化特性）沙門氏菌個別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）注：表示陽性；表示陰性。4.3.2 反應(yīng)序號A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。.3 反應(yīng)序

39、號A3：補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌。大部分沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陽性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。4.5 血清學(xué)鑒定.1 抗原的準(zhǔn)備一般采用1.21.5瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。O 血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的（如23）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O凝集反應(yīng)時，可挑取菌苔于1 mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H 抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.550.65半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0.30.4半固體瓊脂的小玻管1 次2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。.2 多價菌體

40、抗原（O）鑒定在玻片上劃出2個約1 cm2 cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2 環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1 滴多價菌體（O）抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1 min，并對著黑暗背景進(jìn)行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應(yīng)。1.6 結(jié)果與報告綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報告25 g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。附錄6 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)1 操作步驟1.1 樣品的處理稱取25g樣品至盛有%氯化鈉肉湯容器中，均質(zhì)1min2 min。若樣品為

41、液態(tài)，吸取25mL 樣品至盛有225mL7.5 %氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。1.2 增菌和分離培養(yǎng)1.2.1 將上述樣品勻液于361培養(yǎng)18h24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長。 1.2.2 將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板361培養(yǎng)18 h24 h。Baird-Parker平板361培養(yǎng)18h24h或45h48h。1.2.3 金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹

42、膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。1.3 鑒定1.3.1 染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5m1m。1.3.2 血漿凝固酶試驗(yàn)：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，361培養(yǎng)18h24h。取新鮮配置兔血漿mL，放入

43、小試管中，再加入BHI 培養(yǎng)物mL0.3 mL，振蕩搖勻，置361 溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，361培養(yǎng)18h48h，重復(fù)試驗(yàn)。1.5 結(jié)果與報告1.5.1結(jié)果判定：符合1.2.3、1.3，可判定為金黃色葡萄球菌。1.5.2結(jié)果報告：在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。第二法 金黃色葡萄球菌 Baird-Parker平板計(jì)數(shù)2 操作步驟2.1 樣品的稀釋2.1.1 固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的容器內(nèi)，均質(zhì)1min2min，制成1:10的樣品勻液。2.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。2.1.3 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的