細(xì)胞培養(yǎng)入門技術(shù)

1、2021/3/141細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)2021/3/142 目的:了解哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的一般步驟,學(xué)習(xí)細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù) 原理:無菌操作 細(xì)胞休眠2021/3/143離心機(jī)櫥柜實驗臺冰箱培養(yǎng)箱試劑柜實驗儀器臺超凈工作臺實驗臺實驗臺實驗臺實驗臺水池冰箱衣柜實驗臺顯微鏡遞物窗緩沖間無菌操作室準(zhǔn)備室1.細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)置2021/3/144下風(fēng)口下風(fēng)口上風(fēng)口上風(fēng)口無菌操作室2021/3/145超凈工作臺和CO2培養(yǎng)箱2.2.細(xì)胞培養(yǎng)的主要實驗設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的主要實驗設(shè)備n超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

2、 nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒箱內(nèi)蒸餾水槽中預(yù)留滅菌蒸餾水，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。2021/3/146解剖顯微鏡倒置顯微鏡2.2.細(xì)胞培養(yǎng)的主要實驗設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的主要實驗設(shè)備2021/3/147血清（天然成分）:基礎(chǔ)培養(yǎng)基（人工合成）:干粉培養(yǎng)基DMEM 、-MEM、RPMI1640水:高純度的去離子水細(xì)胞培養(yǎng)的主要試劑（培養(yǎng)基）抗菌素:通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用,使用濃度為100U/mln 血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。n 常用血清有胎牛血清、新

3、生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。n 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體病毒污染。n 血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘n 血清的消毒：過濾除菌n 血清的使用濃度為520消化液:常用0.25胰蛋白酶,使細(xì)胞脫離組織或容器壁, 用含血清培養(yǎng)液中止其活性2021/3/148細(xì)胞培養(yǎng)用器皿的清洗和消毒 一般玻璃器皿的清洗分為四個步驟:1、自來水浸泡2、洗滌劑刷洗(如有必要進(jìn)行超聲處理）3、泡酸（濃硫酸、重鉻酸鉀及蒸餾水）4、流水沖洗過夜,依次用蒸餾水、三蒸水漂洗,最后烘干備用 常用消毒方法:1、濕熱滅菌法（高壓蒸汽滅菌）,15磅,1520m

4、in2、過濾除菌(如:血清的除菌）2021/3/149 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指細(xì)胞的離體培養(yǎng),是在無菌條件下,把動物或植物的細(xì)胞從機(jī)體中分離出來，置于培養(yǎng)皿中，并在一個合適的環(huán)境中，給以營養(yǎng)物質(zhì)，使之繼續(xù)生存和繁殖的方法。2021/3/1410 原代培養(yǎng)(primary culture),或稱為初代培養(yǎng),就是從供體取下組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物。常用的原代培養(yǎng)方法有組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。2021/3/1411 傳代培養(yǎng)(secondly culture),在原代培養(yǎng)物鋪展為單細(xì)胞層后,將原代培養(yǎng)細(xì)胞分開接種到兩個或多個新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)增殖。202

5、1/3/1412 細(xì)胞培養(yǎng):使用單個細(xì)胞懸液 組織培養(yǎng):使用組織塊（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培養(yǎng)：使用器官原基或器官的一部分或整個器宮2021/3/1413v 貼附型 成纖維樣細(xì)胞型 上皮樣細(xì)胞型v 懸浮型培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)人口腔上皮細(xì)胞培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞2021/3/1414v 細(xì)胞的貼壁生長v 接觸抑制v 細(xì)胞的生長曲線細(xì)胞貼壁延展過程細(xì)胞貼壁延展過程( (模式圖模式圖) )細(xì)胞的接觸抑制現(xiàn)象細(xì)胞的接觸抑制現(xiàn)象2021/3/1415正常培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線正常培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線退化死亡平臺期細(xì)胞數(shù)增大極限點,出現(xiàn)接觸抑制細(xì)胞指數(shù)生長極限點指數(shù)生長期潛伏期細(xì)胞數(shù)量0

6、24487296120小時指數(shù)生長期是最佳實驗期指數(shù)生長期是最佳實驗期 ! !2021/3/1416培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件1 細(xì)胞的營養(yǎng)需要2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓 3 無污染 4 無毒2021/3/1417 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水:新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液:無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml2021/3/1418 消化液: 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或

7、精氨酸相連接的肽健,除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白,影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間:2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用 2021/3/1419培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液,分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點:營養(yǎng)成分豐富,培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。 成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的

8、分析。 易發(fā)生支原體污染 2021/3/1420合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量,用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基,如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點:標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。 成本低 缺點: 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。 2021/3/1421 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存,要想使細(xì)胞生長和繁殖,還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 2021/3/1422 血清中含有:多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子; 激

9、素; 促貼附物質(zhì),如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分2021/3/1423 一般說來含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死 對于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明,但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚 血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子,同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。 在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞2021/3/1424 血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。 常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等,其中以胎牛血清

10、質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn):透明,淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。 血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）:56 ，30 分鐘 血清的消毒：過濾除菌2021/3/1425 抗菌素的使用: 在培養(yǎng)液配制后,培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素,以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素:每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定2021/3/1426完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95血清 5一20碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100卑位毫升2021/3/1427培養(yǎng)基的配制 RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g

11、 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌。 調(diào)節(jié)pH值至7.2 加血清（終濃度 10） 2021/3/1428v 將原代培養(yǎng)物分割后重新接種到兩個或多個培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),這一操作稱為傳代培養(yǎng),傳代比例為1:3 至1:6,依細(xì)胞種類而異.v 細(xì)胞傳代培養(yǎng)的意義v 傳代時機(jī)的把握v 傳代培養(yǎng)的代數(shù)限制;少數(shù)細(xì)胞可出現(xiàn)永生化2021/3/1429吸去舊液加入消化液解離細(xì)胞約2min在倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞呈圓粒狀細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng):貼附型貼附型PBS洗 滌12次吹打懸浮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度 分裝接種,置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞

12、的觀察2021/3/1430細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng):貼附型貼附型培養(yǎng)細(xì)胞的觀察培養(yǎng)液顏色、是否清亮培養(yǎng)液顏色、是否清亮培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)2021/3/1431細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng):貼附型貼附型吸去舊液加入消化液解離細(xì)胞約5min在倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞呈圓粒狀PBS洗 滌12次吹打懸浮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度 分裝接種,置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞的觀察胰酶消化數(shù)分鐘胰酶消化數(shù)分鐘細(xì)胞脫離器壁，呈圓粒狀細(xì)胞脫離器壁，呈圓粒狀2021/3/1432吸去舊液加入消化液解離細(xì)胞約2min在倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞呈圓粒狀細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng):

13、貼附型貼附型PBS洗 滌12次吹打懸浮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度 分裝接種,置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞的觀察中止消化、吹散細(xì)胞中止消化、吹散細(xì)胞細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù),調(diào)節(jié)密度調(diào)節(jié)密度2021/3/1433細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng):懸浮型懸浮型直立瓶去舊液加新液分瓶接種加新液2021/3/1434無菌操作注意事項 無菌操作中的注意事項 在無菌操作中,一定要保持工作區(qū)的無菌清潔。為此,在操作前要認(rèn)真地洗手并用75乙醇消毒。操作前2030分鐘起動超凈臺吹風(fēng)。操作時，嚴(yán)禁說話，嚴(yán)禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養(yǎng)瓶要在超凈臺內(nèi)才能打開瓶

14、塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內(nèi)完成。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端，將尖端在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然后再去吸取液體?？傊?，在整個無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行。2021/3/1435細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費,減少污染,減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。2021/3/1436凍存和復(fù)蘇的原則:慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下,可以產(chǎn)生以下變化:細(xì)胞器脫水,細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

15、如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶;相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。2021/3/1437慢凍程序 標(biāo)準(zhǔn)程序: 當(dāng)溫度在-25 以上時, 12 /min 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時, 510 /min 當(dāng)溫度達(dá)-100時，可迅速放入液氮中 細(xì)胞凍存盒2021/3/1438低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 在細(xì)胞凍存時加入溫保護(hù)劑,能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護(hù)劑是DMSO,它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減

16、少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。2021/3/1439細(xì)胞凍存方法 1預(yù)先配制凍存液,避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞 配方: 含血清培的完全培養(yǎng)基 5% DMSO 2 取對數(shù)生長期細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞/ml) 3 加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。 4 年后，存潔率可達(dá)80以上。2021/3/1440細(xì)胞復(fù)蘇方法 （l）從液氮中取出冷凍管,迅速投入3738 水浴中,使其融化（1分鐘左右）。 （2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。 （3）低速離心10分鐘。 （4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)

17、蘇的細(xì)胞。2021/3/1441細(xì)胞計數(shù) 血細(xì)胞計數(shù)器:手工計數(shù)細(xì)胞 Coulter計數(shù)儀:人工計數(shù)2021/3/1442培養(yǎng)細(xì)胞活力測定 細(xì)胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。 任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成,從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。 1 細(xì)胞克隆形成率實驗 單個細(xì)胞在體外增殖6代以上,其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬勺溆脕肀硎炯?xì)胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù) 缺點:操作繁瑣 優(yōu)點:精確、可靠2021/3/14432臺盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色,死細(xì)胞染成藍(lán)色,用活細(xì)胞占 細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞恬力 2021/3/14443 四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán), 四吐鹽比色法的原理:活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan),并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值 MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗、腫瘤放射敏