淀粉液化及糖化實(shí)驗(yàn)

1、淀粉液化及糖化實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握用酶解法從淀粉原料到水解糖的制備原理及方法；2. 掌握還原糖的測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理在發(fā)酵過(guò)程中，因有些微生物不能直接利用淀粉，當(dāng)以淀粉為原料時(shí)，必須先將淀 粉水解成葡萄糖，才能供發(fā)酵使用。一般將淀粉水解為葡萄糖的過(guò)程成為淀粉的糖 化，所制得的糖液成為淀粉水解糖。水解淀粉為葡萄糖的方法包括酸解法、酸酶結(jié) 合法和酶解法。實(shí)驗(yàn)室常采用酶解法制備淀粉水解糖。酶解法是指利用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖的過(guò)程。酶解法葡萄糖可分為兩步：第 一步是利用a -淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)化為糊精及低聚糖， 使淀粉的可溶性增加，這個(gè)過(guò)程 稱(chēng)為液化；第二步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解

2、，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^(guò)程， 這個(gè)過(guò)程在生產(chǎn)上成為糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下進(jìn)行的，故該方 法也稱(chēng)為雙酶法。1. 酶解法液化原理淀粉的酶解法液化是以a -淀粉酶作為催化劑，該酶作用于淀粉的a -1,4-糖苷鍵，從內(nèi)部隨機(jī)地水解淀粉，從而迅速將淀粉水解為糊精及少量麥芽糖， 所以a -淀粉酶 也稱(chēng)內(nèi)切淀粉酶。淀粉受到 a -淀粉酶的作用后，其碘色反應(yīng)發(fā)生以下變化：藍(lán)色- 紫色t紅色t淺紅色t不顯色（即顯碘原色）。酶解法液化因生產(chǎn)工藝不同分為間歇法、半連續(xù)法和連續(xù)法；液化設(shè)備分為管式、 罐式和噴射式；加酶方法包括一次加酶法、二次加酶法和三次加酶法；根據(jù)酶制劑 的耐溫性分為中溫酶法、高溫酶法及中

3、溫酶和高溫酶混合法。本實(shí)驗(yàn)采用：高溫酶 法，間歇式，罐式，一次加酶法2. 酶解法糖化原理淀粉的酶解法糖化是以糖化酶為催化劑，該酶從非還原末端以葡萄糖為單位依次分 解淀粉的a -1,4-糖苷鍵或a -1,6-糖苷鍵，由于是從鏈的一端逐漸一個(gè)個(gè)地切斷為 葡萄糖，所以糖化酶也成為外切淀粉酶。淀粉糖化的理論收率：因?yàn)樵谔腔^(guò)程中有水的參與反應(yīng)，故糖化的理論收率為111.1%(CeHoO) n+HS nC6H2Q16218180淀粉糖化實(shí)際收率的計(jì)算公式:X100%糖液量（L） X糖液葡萄糖含量（g/L） 投入淀粉量（g） X原料中純淀粉含量（）淀粉轉(zhuǎn)化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被轉(zhuǎn)化為葡萄糖。淀

4、粉轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：淀粉轉(zhuǎn)化率= 糖液量（L） X糖液葡萄糖含量（g/L）x100%投入淀粉量（g） X原料中純淀粉含量（%） X1.11糖化液中還原糖（以葡萄糖計(jì)）占干物質(zhì)的百分比，稱(chēng)為DE值。用DE直表示淀粉水解的程度或糖化程度。DE值的計(jì)算公式:DE值=還原糖含！X 100%還原糖含量用3,5-二硝基水楊酸（DSN比色法測(cè)定，表示方法：g葡萄糖/100mL糖干物質(zhì)含量用阿貝折光儀測(cè)定，表示方法：g干物質(zhì)/100mL糖液。本實(shí)驗(yàn)采用淀粉 干重替代（即原料中純淀粉含量為100%）。糖化時(shí)間與糖化酶用量的關(guān)系見(jiàn)表 1表1糖化時(shí)間與糖化酶用量關(guān)系表糖化時(shí)間/h68101624324872糖化酶用量（

5、U/g淀粉）480400320240I180150120100三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1.儀器分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、烘箱、滴定管、酸度計(jì)、電爐、離心機(jī)、白瓷板、燒杯、試管等。2.試劑玉米淀粉、a -淀粉酶、糖化酶、PH試紙、鹽酸、葡萄糖溶液、DNS式劑、無(wú)水酒精 等。磷酸-檸檬酸緩沖液（PH6.0）:稱(chēng)取磷酸氫二鈉（NaHPO 12HQ） 45.23g，檸檬酸（GH8O H20 8.07g，用蒸餾水溶解定容至1000mL配好后應(yīng)以酸度計(jì)調(diào)整 PH值為6.0。原碘液（存儲(chǔ)液）：稱(chēng)取0.5g碘和5.0g碘化鉀，研磨，溶于少量蒸餾水中，然后定容至100mL儲(chǔ)存于棕色瓶中備用。稀碘液（工作液）：取1m/L

6、原碘液用蒸餾水稀釋100倍（當(dāng)天制備）。反應(yīng)終止液：0.1mol/L硫酸。四、實(shí)驗(yàn)方法1. 淀粉的液化配置30%勺淀粉乳（按照0.1L配制）兩份，調(diào)節(jié)PH值至6.5，加入氯化鈣（固形物 0.2%,鈣離子的存在可以保持 a -淀粉酶在水解過(guò)程中保持活力和穩(wěn)定性），加入a - 淀粉酶（1220U/g淀粉）；在劇烈攪拌下，先加熱至 72 C，保溫15min;再加熱至 90C,并維持30min,中間不停止攪拌，以達(dá)到所需的液化程度（DE值1518% ;取小樣檢測(cè)碘色反應(yīng)呈棕紅色；液化反應(yīng)后，再升溫至100120C，保持58min,以凝聚蛋白質(zhì)；以6000r/min離心5min得到上清液。2. 淀粉的糖

7、化迅速將上述上清液用鹽酸將 PH調(diào)至4.24.5，同時(shí)迅速降溫至60 C ;然后加入糖化 酶（酶活力為10000U的酶液0.5mL）,于60C保溫12h;當(dāng)用無(wú)水酒精檢驗(yàn)無(wú)糊精 存在時(shí)，將溶液PH值調(diào)至4.85.0，同時(shí)，將溶液加熱至80C，保溫20min;然后 將溶液溫度降至6070C，以6000r/min離心5min即得到糖上清液；量取該糖液體積，取樣分析還原糖含量（測(cè)定方法參見(jiàn)附錄“葡萄糖含量的測(cè)定（3,5-二硝基水楊 酸比色法）”相關(guān)內(nèi)容）。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 在詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上完成下表，計(jì)算淀粉轉(zhuǎn)化率。（1）葡萄糖含量測(cè)定 吸光度測(cè)定試劑試管編號(hào)0123451mg/mL葡萄糖溶液

8、（mL）00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL1.00.80.60.40.20DNS式齊( mL333333吸光度 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 葡萄糖含量計(jì)算（2）淀粉轉(zhuǎn)化率測(cè)定淀粉量純淀粉含量糖液量糖液葡萄糖含量糖化實(shí)際收率淀粉轉(zhuǎn)化率(g)(%(L)(g/L)(%(%100六、實(shí)驗(yàn)思考1. 分析糖化酶用量對(duì)糖化效果的影響？2. 淀粉液化過(guò)程中幾個(gè)保溫過(guò)程有何作用?附錄1:葡萄糖含量的測(cè)定（3,5-二硝基水楊酸比色法）一、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)是利用3,5-二硝基水楊酸（DNS試劑與還原糖溶液共熱后被還原成棕紅 色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的含量和棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度成一定 比例關(guān)系，故可用于比色測(cè)

9、定。葡萄糖與 3,5-二硝基水楊酸試劑反應(yīng)生成的有色物 質(zhì)在540nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰，故在此波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定。二、實(shí)驗(yàn)方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制取6支大試管，分別編號(hào)05,按下表1加入各種試劑。表i葡萄糖含量的測(cè)定試劑試管編號(hào)0123451mg/mL葡萄糖溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL1.00.80.60.40.20DNS式齊( mL333333將各試管中溶液振蕩均勻后，在沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5mi n,將試管取出迅速用冷水冷卻至室溫，加入蒸餾水15mL搖勻。在540nm波長(zhǎng)下，用0號(hào)試管作為空白調(diào) 零，測(cè)定其他試管內(nèi)溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2. 樣品的測(cè)定將發(fā)酵液5ml，以5000r/min離心5min，取上