國家自然基金標(biāo)書-終稿

1、報(bào)告正文（一） 立項(xiàng)依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）： 1、 項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)隨著機(jī)械通氣、表面活性物質(zhì)替代療法等新技術(shù)應(yīng)用，危重新生兒、尤其是早產(chǎn)兒存活率已顯著提高。然而，長時(shí)間吸入高濃度氧，幸存者易發(fā)生肺部氧化應(yīng)激損傷。目前，高氧肺損傷已成為發(fā)達(dá)國家NICU最為棘手的問題之一和嬰兒慢性肺疾病的最常見形式。但高氧肺損傷的確切機(jī)制尚未完全闡明，更無有效的防治手段。因此深入研究其發(fā)病機(jī)制，積極防治高氧肺損傷，具有優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)的戰(zhàn)略意義。高氧肺損傷是一個(gè)涉及許多細(xì)胞活動(dòng)的復(fù)雜過程，可分為早期的組織損傷（彌散性肺泡炎）和晚期的損傷后修復(fù)（肺間質(zhì)重構(gòu)）兩個(gè)過程。細(xì)胞外基質(zhì)（extrace

2、llular matrix,ECM）的重建參與了高氧肺損傷的整個(gè)病理過程，若ECM重建正常，則損傷完全修復(fù)，肺結(jié)構(gòu)正常；若ECM重建紊亂，將導(dǎo)致肺纖維化。因此，ECM重建是關(guān)系高氧肺損傷結(jié)局的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)室在國內(nèi)外率先開展了對早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和其抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)表達(dá)的研究，已發(fā)現(xiàn)肺損傷時(shí)MMPs過度表達(dá)、MMPs/TIMPs失衡是ECM重建紊亂發(fā)生纖維化的關(guān)鍵原因 1（具體研究成果見研究基礎(chǔ)欄）。有關(guān)MMPs在高氧肺損傷中的作用

3、已為少數(shù)國外學(xué)者所重視，但高氧肺損傷后ECM重建過程中，引起MMPs過度增加的具體機(jī)制是什么？本實(shí)驗(yàn)室擬從MMPs的誘導(dǎo)劑和抑制劑兩方面深入研究。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑（extracellular matrix metalloproteinase inducer,Emmprin）在上調(diào)MMPs表達(dá)中起關(guān)鍵作用。Emmprin是分子量為58KD的質(zhì)膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，不僅表達(dá)于正常組織，還表達(dá)于腫瘤組織如肺部腫瘤細(xì)胞，提示Emmprin參與體內(nèi)生理及病理過程2。目前，少數(shù)文獻(xiàn)已證明，體外Emmprin與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，成纖維細(xì)胞MMPs表達(dá)增加。進(jìn)一步研究表明，Emmpr

4、in在細(xì)胞表面與自身受體或MMP結(jié)合，激活胞內(nèi)MAPK p38信號通路，該途徑激活促進(jìn)ECM降解3，4。但關(guān)于Emmprin/MAPK p38對MMPs調(diào)節(jié)的研究僅限于腫瘤細(xì)胞，有關(guān)高氧肺損傷后肺ECM重建過程中，Emmprin如何調(diào)控MMPs/TIMPs平衡，目前國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor beta, TGF-）在下調(diào)MMPs表達(dá)中起關(guān)鍵作用。研究證明TGF-刺激可使肺成纖維細(xì)胞MMPs生成減少5。另有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-抑制元件位于MMP-1基因啟動(dòng)子區(qū)，嚴(yán)密調(diào)控MMP-1在不同生理和病理情況下的表達(dá)6。進(jìn)一步的研究表明，TGF-對

5、MMP-1的作用通過SMAD信號途徑介導(dǎo)，該途徑激活可阻止ECM降解5。因此，推測TGF-/SMAD對MMPs/TIMPs平衡的調(diào)節(jié)可能是影響肺損傷后ECM重建的關(guān)鍵因素之一。有關(guān)高氧肺損傷后肺ECM重建過程中，TGF-如何調(diào)控MMPs/TIMPs平衡，目前國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。近年來對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，位于大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)膜上約50-100nm大小的囊性凹陷結(jié)構(gòu)小窩（caveolae），是許多信號分子完成跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的“驛站”。小窩蛋白（caveolin）是小窩胞漿面包被的一種21-24kD的膜蛋白，是許多信號分子活性狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)者。在無胞外信號刺激下，caveolin通常與富集于小窩質(zhì)膜

6、上的各種信號分子、受體及非受體型酪氨酸激酶等相結(jié)合，抑制這些信號物質(zhì)的活性；在激動(dòng)劑與受體結(jié)合后，caveolin分子構(gòu)象發(fā)生變構(gòu)或共價(jià)修飾，調(diào)節(jié)信號物質(zhì)的活化狀態(tài)，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控7。有關(guān)caveolin在肺ECM重建中的作用，有學(xué)者提出肺泡型上皮細(xì)胞caveolin表達(dá)缺失可能是發(fā)生肺纖維化的亞細(xì)胞指標(biāo)。對caveolin-1基因敲除小鼠的研究，肺組織顯示肺泡隔因細(xì)胞增殖而增厚和肺纖維化。caveolin-1在肺發(fā)育的不同階段，可表達(dá)于不同血管和上皮細(xì)胞，呈時(shí)相分布8。研究發(fā)現(xiàn)，caveolin 1與TGF-型受體（TR）相互作用，抑制TGF-介導(dǎo)的SMAD-2和下游分子的磷酸化，從而調(diào)節(jié)

7、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)9。Emmprin具有酪氨酸蛋白激酶活性，且其信號傳導(dǎo)為酪氨酸磷酸化依賴的MAPK p38途徑，申請者推測caveolin能與Emmprin相互作用，調(diào)控Emmprin介導(dǎo)的MAPK p38和下游分子的磷酸化。簡圖如下：胞外信 caveolin +? caveolin/Emmprin作用 Emmprin/MAPK p38號刺激 變構(gòu)活化 + caveolin/TR作用 TGF-/SMAD信號整合 調(diào)控肺ECM重建 基于上述，申請者提出如下假設(shè)：高氧暴露下MMP誘導(dǎo)劑/抑制劑失衡是高氧肺損傷MMPs增加，ECM重建紊亂的主要原因。高氧暴露使質(zhì)膜小窩表達(dá)或功能異常，從而影響Emmprin/

8、MAPK p38和TGF-/SMAD兩條信號通路整合，繼而導(dǎo)致MMPs增加，ECM重建紊亂。本人所在的研究室屬呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。多年來，本人一直致力于新生兒高氧慢性肺損傷的研究，已成功建立了早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷的動(dòng)物模型、掌握了支氣管肺泡灌洗術(shù)、體外型肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)、核酸、蛋白分析等技術(shù)，并對抗氧化酶、細(xì)胞因子水平、一氧化氮、MMPs/TIMPs失衡等因素在高氧肺損傷發(fā)病機(jī)制中所起的作用進(jìn)行了較深入的研究，同時(shí)應(yīng)用地塞米松、維甲酸、人類重組促紅細(xì)胞生成素、EGb761進(jìn)行了抗氧化損傷的干預(yù)研究（見研究基礎(chǔ)欄）。這些理論研究和技術(shù)方法的積累為本課題的開展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 本研

9、究如能完成，可望為探索高氧肺損傷后肺ECM重建紊亂的機(jī)制開拓新思路，并為尋找有效的預(yù)防和干預(yù)高氧肺損傷提供依據(jù)。 參考文獻(xiàn)1. Taylor PM, Woodfield RJ, Hodgkin MN et al.Breast cancer cell-derived EMMPRIN stimulates fibroblast MMP2 release through a phospholipase A(2) and 5-lipoxygenase catalyzed pathway. Oncogene 2002 Aug 22;21(37):5765-722. Liang L, Major T, B

10、ocan T.Characterization of the promoter of human extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN). Gene 2002 Jan 9;282(1-2):75-863. Lim M, Martine T, Jablons D. Tumor-derived EMMPRIN(extrocellular matrix metalloproteinases inducer) stimulates collagenase transcription through MAPK p38. FEBS

11、Lett 1998;441(1):88924. Yuan W, Varga J. Transforming growth factor-beta repression of matrix metalloproteinase-1 in dermal fibroblasts involves Smad3. J Biol Chem 2001;276(42):38502-105. White LA, Mitchell TI, Brinckerhoff CE. Transforming growth factor beta inhibitory element in the rabbit matrix

12、metalloproteinase-1 (collagenase-1) gene functions as a repressor of constitutive transcription. Biochim Biophys Acta 2000 Feb 29;1490(3):259-686. Razani B, Zhang XL, Bitzer M, et al. Caveolin-1 regulates TGF-beta/SMAD signaling through an interaction with the TGF-beta type I receptor. J Biol Chem 2

13、001;276 (9):672767387. Ramirez MI, Pollack L, Millien G, et al. The alpha-Isoform of Caveolin-1 Is a Marker of Vasculogenesis in Early Lung Development. J Histochem Cytochem 2002;50(1):33428. Drab M, Verkade P, Elger M, et al. Loss of caveolae, vascular dysfunction, and pulmonary defects in caveolin

14、-1 gene-disrupted mice. Science 2001;293(5539):2449522、 項(xiàng)目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵問題。研究目標(biāo)：建立早產(chǎn)大鼠慢性高氧肺損傷模型，探討Emmprin與TGF-調(diào)節(jié)失衡是否為高氧肺損傷MMPs增加，ECM重建紊亂的主要原因；探討小窩蛋白對Emmprin/MAPK p38和TGF-/SMAD兩條信號通路整合的影響，為高氧肺損傷發(fā)生機(jī)制和尋找有效防治措施提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容：1. Emmprin/MAPK p38信號通路活化狀態(tài)及高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的相關(guān)性： 研究高氧肺損傷不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中Emmprin、P38、磷

15、酸化P38的表達(dá)。 研究高氧肺損傷Emmprin/MAPK p38信號通路活化狀態(tài)與MMPs表達(dá)雙變量關(guān)系。2. TGF-/SMAD信號通路活化狀態(tài)及高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的相關(guān)性： 研究高氧肺損傷不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中TGF-、TR、SMAD、磷酸化SMAD的表達(dá)。 研究高氧肺損傷TR的激酶活性，計(jì)算磷酸化SMAD與非磷酸化SMAD比值。 研究高氧肺損傷TGF-/SMAD信號通路的活化狀態(tài)與MMPs/TIMPs的雙變量關(guān)系。3. caveolin-1對Emmprin/MAPK p38和TGF-/SMAD兩條信號通路及其與高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的相關(guān)性： 研究高氧肺損傷不同時(shí)間點(diǎn)肺組織

16、中caveolin-1表達(dá)及酪氨酸磷酸化水平。 研究高氧肺損傷肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin-1與Emmprin的共定位。 研究高氧肺損傷肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin-1與TR的共定位。擬解決的關(guān)鍵問題：1. 成年動(dòng)物急性高氧肺損傷模型，因其肺發(fā)育已成熟，不能如實(shí)反映不成熟肺的損傷情況，并且與臨床上早產(chǎn)兒需長期用氧情況差異較大。本項(xiàng)目采用早產(chǎn)大鼠慢性高氧肺損傷模型，能更如實(shí)模擬支氣管肺發(fā)育不良的發(fā)生情況。雖然此模型技術(shù)難度較大，但本研究組在早產(chǎn)大鼠模型制備方面已積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，能成功完成此模型的復(fù)制。2. 本研究假設(shè)caveolin與Emmprin的相互作用可調(diào)控Emmprin/MAPK

17、 p38信號通路活化；caveolin-1與TR的相互作用可調(diào)控TGF-/SMAD信號通路活化。以往由于技術(shù)條件限制，未能從形態(tài)學(xué)上直接證實(shí)。借助共聚焦顯微鏡觀察和熒光雙重標(biāo)記技術(shù)可解決這一技術(shù)難題。3、 擬采取的研究方案及可行性分析。研究方法： 本課題采用共聚焦顯微鏡（confocal microscope）、免疫熒光雙重標(biāo)記和免疫組織化學(xué)等研究方法，輔以蛋白質(zhì)與核酸分析技術(shù)（Western Blot、Northern Blot方法），檢測各指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，并對各指標(biāo)進(jìn)行定位、定性、定量分析。1.建立早產(chǎn)大鼠慢性高氧肺損傷模型： 參照申請者著作，實(shí)用兒科臨床雜志，.檢測caveolin-1酪

18、氨酸磷酸化水平： 應(yīng)用抗caveolin-1pAb 進(jìn)行免疫沉淀 應(yīng)用抗磷酸化酪氨酸mAb 進(jìn)行Western Blot分析. 檢測肺組織中Emmprin、P38、磷酸化P38 、TGF-、TGF-型受體（TR）及SMAD-2、磷酸化SMAD表達(dá)，探討高氧肺損傷所致ECM重建紊亂的分子機(jī)制： 蛋白質(zhì)水平檢測Western Blot。 mRNA水平檢測Northern Blot（或RT-PCR）。 . 檢測肺組織中TR的激酶活性： TR分離提取免疫沉淀法（immunoprecipition） TR與純化的激酶底物GST-SMAD2（由美國國立癌癥研究機(jī)構(gòu)de Caestecher, M教授提供）

19、反應(yīng)，應(yīng)用免疫印跡法檢測磷酸化SMAD2水平，計(jì)算TR的激酶活性。. 檢測肺組織質(zhì)膜小窩內(nèi)caveolin /Emmprin及caveolin-1/TR的共定位及表達(dá)：樣本制備： 制備組織切片加入抗caveolin mAbPE標(biāo)記的二抗加入抗Emmprin/TR的pAbFITC標(biāo)記二抗 共聚焦顯微鏡（TCSSP型，德國Leica公司）檢測共定位；應(yīng)用圖象分析軟件對caveolin表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理數(shù)據(jù)：應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。技術(shù)路線： 早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷模型caveolaecaveolin酪氨酸磷酸化狀態(tài)（免疫沉淀、免疫印跡） Emmprin/MAP

20、K p38 TGF-/SMAD信號通路研究信號通路研究Emmprin、P38、磷酸化P38TGF-、TR、SMAD、磷酸化SMAD表達(dá)（免疫印跡與Northern Blot 表達(dá)（Western Blot和Northern Blot）或RT-PCR)TR激酶活性（免疫沉淀和免疫印跡）caveolin/Emprin共定位 (熒光雙標(biāo)記、共聚焦顯微鏡)caveolin/ TR共定位 (熒光雙標(biāo)記、共聚焦顯微鏡)可行性分析：1. 申請者所在的研究室屬于呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室臨床二室，本室在慢性阻塞性肺疾病和肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究領(lǐng)域已有大量工作積累，為本項(xiàng)目的研究打下了良好的工作基礎(chǔ)。申請者及所在研

21、究室在產(chǎn)兒高氧損傷領(lǐng)域進(jìn)行了一系列開拓性研究，已熟練掌握急、慢性高氧肺損傷模型復(fù)制，蛋白、核酸分析等技術(shù)。（詳見研究基礎(chǔ)欄）2. 本項(xiàng)目研究的主要成員之一，香港合作者教授，是國際上新生兒肺損傷研究的前沿科學(xué)家，目前與本研究小組密切合作，進(jìn)行有關(guān)慢性肺損傷研究?；籼┹x教授除承擔(dān)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，并提供部分試劑。3. 新一代共聚焦顯微鏡具有觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的立體定位功能，用其檢測在體組織caveolin/Emmprin、caveolin/ TR信號分子在亞細(xì)胞位點(diǎn)的共定位表達(dá)，雖無文獻(xiàn)報(bào)道，在技術(shù)上難度較大，但申請者已掌握了多種熒光標(biāo)記技術(shù)，應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察caveolin-1在細(xì)胞質(zhì)膜上的定位表達(dá)也已

22、獲成功。申請人所在單位的醫(yī)學(xué)中心的共聚焦顯微鏡和本實(shí)驗(yàn)室的基本研究設(shè)備，能保證本實(shí)驗(yàn)研究完成。4、 本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處。理論上的創(chuàng)新：u 研究Emmprin/MAPK p38信號通路在器官發(fā)育和組織病理損傷中的作用,國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。u 本課題研究caveolin對Emmprin/MAPK p38、TGF-/SMAD共調(diào)節(jié)機(jī)制，將為早產(chǎn)兒高氧肺損傷發(fā)病機(jī)制開辟新的研究領(lǐng)域，并為其防治開拓新思路。方法上的創(chuàng)新：以在體組織為研究對象，應(yīng)用免疫熒光雙重標(biāo)記共聚焦顯微鏡技術(shù)研究caveolin/Emmprin、caveolin/TR共定位，國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道，可望為深入研究小窩蛋白對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)

23、控機(jī)制開辟新途徑。5、 年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果。年度研究計(jì)劃及預(yù)測進(jìn)展 本課題研究內(nèi)容預(yù)計(jì)用3年時(shí)間完成. 2004年1月8月購買所需試劑。建立預(yù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。進(jìn)行各項(xiàng)預(yù)實(shí)驗(yàn)。 2004年9月2005年2月 建立動(dòng)物模型。完成標(biāo)本的收集。 2005年3月7月 完成MMPs、TIMPs、TGF-、TR、SMAD2及其mRNA表達(dá)的研究，并進(jìn)行階段性總結(jié)。 2005年8月2005年12月 完成caveolin-1表達(dá)和caveolin-1/TR共定位研究，并進(jìn)行階段性總結(jié)。 2006年1月2006年6月 完成caveolin-1的酪氨酸磷酸化狀態(tài)研究，并進(jìn)行階段性總結(jié)。 2006年7月12月

24、研究數(shù)據(jù)資料分析、總結(jié)、論文撰寫及成果鑒定。 預(yù)期研究成果本項(xiàng)目所建立的早產(chǎn)新生大鼠慢性高氧肺損傷模型，不僅為本課題提供了研究對象，而且為研究高氧肺損傷后肺ECM重建提供了模型。本研究可望為闡明早產(chǎn)兒高氧肺損傷機(jī)制提供新的線索：高氧暴露下MMP誘導(dǎo)劑/抑制劑失衡是高氧肺損傷MMPs增加，ECM重建紊亂的主要原因。高氧暴露使質(zhì)膜小窩表達(dá)或功能異常，從而影響Emmprin/MAPK p38和TGF-/SMAD兩條信號通路整合，繼而導(dǎo)致MMPs增加，ECM重建紊亂。本研究內(nèi)容也可能為預(yù)防和干預(yù)高氧肺損傷提供理論依據(jù)。（二）研究基礎(chǔ)與工作條件1、 工作基礎(chǔ)1. 與本項(xiàng)目有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究

25、工作成績本課題組多年來一直進(jìn)行高氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制及防治的研究，做了許多基礎(chǔ)和臨床研究工作。已成功建立早產(chǎn)新生大鼠高濃度氧（85%95%）急性肺損傷和慢性肺纖維化的模型；已完成肺組織中各種抗氧化酶活力、羥脯氨酸含量與肺纖維化的相關(guān)性研究；內(nèi)源性一氧化氮在高氧肺損傷中雙重作用的研究；體外高氧對肺泡巨噬細(xì)胞分泌IL-8的影響研究；TGF-在早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷肺組織中表達(dá)的研究；基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在高氧肺損傷中的作用機(jī)制的研究；及促紅細(xì)胞生成素、地塞米松、維甲酸對新生鼠高氧肺損傷的干預(yù)研究。獲獎(jiǎng)?wù)n題目前正承擔(dān)的相關(guān)科研項(xiàng)目：1. 2. 相關(guān)研究工作發(fā)表的文章：附：基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑在高氧肺損傷中的作用1. 高氧組病理學(xué)改變 2. 高氧組MMPs表達(dá) 圖1 肺發(fā)育不良，示肺泡 圖2 細(xì)胞增生、間質(zhì)纖維 圖3 MMP-2強(qiáng)陽性表達(dá)數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)簡單 化改變3. 酶譜法測BALF中明膠酶活性 4. 高氧暴露后MMPs