用紫外光譜分析測定飲料中咖啡因的含量

1、酒酒 泉泉 職職 業(yè)業(yè) 技技 術(shù)術(shù) 學(xué)學(xué) 院院 畢畢 業(yè)設(shè)計（論業(yè)設(shè)計（論 文）文） 0 9 級 石油化工生產(chǎn)技術(shù) 專業(yè) 題 目： 用紫外光譜分析測定飲 料中咖啡因的含量 畢業(yè)時間： 2012 屆畢業(yè)生 學(xué)生姓名： 指導(dǎo)教師： 班 級： 09 石化（1）班 2011 年 3 月 5 日 酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院 2 0 1 2 屆各專業(yè) 畢業(yè)論文（設(shè)計）成績評定表 姓名屈永德班級09 石化（1）班專業(yè)石油化工生產(chǎn)技術(shù) 指導(dǎo)教 師第一 次指導(dǎo) 意見 論文內(nèi)容基本符合要求，在第一章中將紫外分光光度計的組成融合到儀器 構(gòu)成當(dāng)中；表格需注明序號及標(biāo)題，置于表格上方居中；插圖注明序號及標(biāo)題， 置于插圖下方居中；

2、將出現(xiàn)的公式用公式編輯器寫規(guī)范；將剪切過來的表格全 部畫出來；另外注意文章排版按照學(xué)校要求的，其次，使文章內(nèi)容連貫得體。 2011 年 5 月 25 日 指導(dǎo)教 師第二 次指導(dǎo) 意見 論文符合要求，但要注意論文中的標(biāo)點符號的正確應(yīng)用；其次論文在排版 上要多下功夫，將第一章中的紫外風(fēng)光光度法的應(yīng)用分四部分寫，先寫定量， 再寫定性，最后寫再其它方面的應(yīng)用，論文中的公式要重新編寫，認(rèn)真的讀論 文，要善于發(fā)現(xiàn)里面的錯別字，修改錯別字。 2011 年 6 月 2 日 指導(dǎo)教 師第三 次指導(dǎo) 意見 指導(dǎo)教 師評語 及評分 成績： 簽字（蓋章） 年 月 日 答辯小 組評價 意見及 評分 成績： 簽字（蓋章）

3、 年 月 日 教學(xué)系 畢業(yè)實 踐環(huán)節(jié) 指導(dǎo)小 組意見 簽字（蓋章） 年 月 日 學(xué)院畢 業(yè)實踐 環(huán)節(jié)指 導(dǎo)委員 會審核 意見 簽字（蓋章） 年 月 日 說明：1、以上各欄必須按要求逐項填寫.。2、此表附于畢業(yè)論文 (設(shè)計)封面之后。 目錄目錄 前言.6 一 紫外可見分光光度計概述.7 （一） 分光光度法原理 .7 （二） 分光光度儀構(gòu)成 .8 1 輻射源.8 2 進(jìn)樣裝置單色器.8 3 光源.9 4 反應(yīng)池（吸收池）.9 5 檢測系統(tǒng).9 （三） 紫外可見分光光度法特點 .9 1 應(yīng)用廣泛.9 2 靈敏度高.10 3 選擇性好.10 4 準(zhǔn)確度高.10 5 適用濃度范圍廣.10 6 分析成本低

4、、操作簡便、快速.10 （四）紫外可見分光光度法的應(yīng)用 .10 1 光譜分析.10 2 紫外可見分光光度法定性分析.11 3 紫外可見分光光度法定量分析物質(zhì)含量.13 4 在其它方面的應(yīng)用.15 二 紫外分光光度法測飲料中咖啡因的含量.16 （一） 實驗藥品及儀器 .16 1 藥品.16 2 儀器.17 （二） 實驗分析步驟 .17 1 樣品的處理.17 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.18 3 測定.18 （三） 實驗結(jié)果 .19 1 計算.19 2 本實驗條件下.19 3 允許差.20 （四） 實驗條件的選擇 .20 1 吸收曲線.20 2 pH 的影響 .20 3 氯化鈉對方法的影響.21 4 萃取

5、時間.22 5 提取溶劑的使用量.22 6 方法精密度.23 （五） 結(jié)果與討論 .24 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線.24 2 咖啡因分析條件的優(yōu)化.24 致謝.27 參考文獻(xiàn).28 摘要摘要 咖啡因廣泛應(yīng)用于當(dāng)今許多碳酸飲料和能量飲料中。隨著可樂飲料如可口 可樂，百事可樂等在全世界的風(fēng)靡，各種可樂飲料已經(jīng)成為人們飲食當(dāng)中攝取咖 啡因次數(shù)較高的一個重要來源，但大量或長期攝取咖啡因有損人體的健康。因此,各 國對飲料中咖啡因的含量都做出了相應(yīng)的規(guī)定和限制?，F(xiàn)有的咖啡因分析方法中， 光譜分析方法簡單，直接，但很難避免樣品基質(zhì)和其它物質(zhì)的干擾，所得結(jié)果往 往有較大誤差；色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法準(zhǔn)確、靈敏度高，但往

6、往樣品前處 理步驟繁瑣，需要使用大量的有機溶劑，分析時間較長，所需的分析費用也相對 較高。因此，發(fā)展一種簡便、有效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的分析方法用于飲料中咖啡因的 日常質(zhì)量控制和法規(guī)檢測顯得尤為重要。 本論文采用紫外光譜分析方法測定飲 料中咖啡因的含量。該方法簡單快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏度高、干擾物排除能力 強，同時也是對所學(xué)知識的一種鞏固運用。 關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：紫外分光光譜法；飲料；咖啡因；測定； 前言前言 咖啡因(caffeine)又名咖啡堿，屬甲基黃嘌呤化合物，化學(xué)名稱為 1，3，7三甲基黃嘌呤，為白色無臭味苦的發(fā)亮針絲狀或粉末結(jié)晶。熔點為 234 -238 ，178升華，能溶于乙醚、丙酮、氯仿、

7、水，微溶于石油醚。以往 咖啡因常采用容量法，因操作復(fù)雜不太理想。實踐證明本方法簡單快速好，可用 于可樂型飲料中咖啡因的測定。 咖啡因具有提神醒腦等刺激中樞神經(jīng)作用，但易上癮。為此，各國制定了咖 啡因在飲料中的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。美國、加拿大、阿根廷、日本、菲律賓規(guī)定飲料 中咖啡因的含量不得超過 200mg/L，南斯拉夫規(guī)定不得超過 120mg/L，到目前為 止我國僅允許咖啡因加入到可樂型飲料中，其含量不得超過 150mg/Kg，為了加 強食品衛(wèi)生監(jiān)督管理，建立咖啡因的標(biāo)準(zhǔn)測定方法十分必要。 紫外分光光度法是可樂型飲料、咖啡和茶葉以及制成品中咖啡因含量的測定 方法。其方法簡單、快速、準(zhǔn)確。最低檢出濃度

8、：紫外法對可樂型飲料為 3mg/L；對咖啡、茶葉及其固體制品為 5mg/100g；對咖啡和茶葉的液體制品為 5mg/L。 一一 紫外可見分光光度計概述紫外可見分光光度計概述 （一）（一） 分光光度法原理分光光度法原理 分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度， 對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。 在分光光度計中，將不同波長的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時，便 可得到與眾不同波長相對應(yīng)的吸收強度。如以波長（）為橫坐標(biāo)，吸收強度 （A）為縱坐標(biāo)，就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線。利用該曲線進(jìn)行物質(zhì)定性、 定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色

9、物 質(zhì)的方法，稱為紫外分光光度法；用可見光光源測定有色物質(zhì)的方法，稱為可見 光光度法。它們與比色法一樣，都以 Beer-Lambert 定律為基礎(chǔ)。 上述的紫外光 區(qū)與可見光區(qū)是常用的。但分光光度法的應(yīng)用光區(qū)包括紫外光區(qū)，可見光區(qū)，紅 外光區(qū)。 當(dāng)一束強度為 I0的單色光垂直照射某物質(zhì)的溶液后,由于一部分光被體系吸 收,因此透射光的強度降至 I，則溶液的透光率 T 為：I/I0 根據(jù)朗伯（Lambert）-比爾（Beer）定律: A=abc 式中 A 為吸光度，b 為溶液層厚度（cm） ，c 為溶液的濃度（g/dm3） ， a 為 吸光系數(shù)。其中吸光系數(shù)與溶液的本性、溫度以及波長等因素有關(guān)。溶

10、液中其他 組分（如溶劑等）對光的吸收可用空白液扣除。 由上式可知，當(dāng)固定溶液層厚度 L 和吸光系數(shù)時，吸光度 A 與溶液的濃度成 線性關(guān)系。在定量分析時，首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況（吸收光 譜） ，從中確定最大吸收波長，然后以此波長的光為光源，測定一系列已知濃度 c 溶液的吸光度 A，作出 A-c 工作曲線。在分析未知溶液時，根據(jù)測量的吸光度 A，查工作曲線即可確定出相應(yīng)的濃度。這便是分光光度法測量濃度的基本原理。 上述方法是依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法來求出未知濃度值，在滿足要求（準(zhǔn)確度和精密 度）的條件下，可以應(yīng)用比較法求出未知濃度值。 （二）（二） 分光光度儀分光光度儀構(gòu)成構(gòu)成 依據(jù)分光光

11、度法測量原理，把比較法應(yīng)用到儀器之中濃度直讀功能。用 標(biāo)準(zhǔn)溶液將儀器調(diào)整好，再測定樣品時，直接顯示樣品濃度值。 1 1 輻射源輻射源 自動檢測儀器的核心組成部分，通過運行檢測程序和鏈接顯示器以及其他外 部設(shè)備，實現(xiàn)在線自動檢測、數(shù)據(jù)儲存于采集、遠(yuǎn)程控制等。 輻射源必須具有穩(wěn)定的、有足夠輸出功率的、能提供儀器使用波段的連續(xù)光 譜，如鎢燈、鹵鎢燈（波長范圍 3502500 納米） ，氘燈或氫燈（180460 納米） ，或可調(diào)諧染料激光光源等。 2 2 進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置單色器單色器 蠕動泵和九通閥實現(xiàn)多個反應(yīng)試劑及樣品的進(jìn)液，計量裝置控制反應(yīng)試劑及 樣品進(jìn)樣量。 單色器它由入射、出射狹縫、透鏡系統(tǒng)和

12、色散元件（棱鏡或光柵）組成，是 用以產(chǎn)生高純度單色光束的裝置，其功能包括將光源產(chǎn)生的復(fù)合光分解為單色光 和分出所需的單色光束。 3 3 光源光源 發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠的光強度，穩(wěn)定。 （穩(wěn)壓裝置） 4 4 反應(yīng)池（吸收池）反應(yīng)池（吸收池） 檢測時的化學(xué)反應(yīng)均在反應(yīng)池內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后被測試液將由檢測系統(tǒng)將 信號傳輸并分析。因此，反應(yīng)池有兩個作用：一是作為分光光度檢測的化學(xué)反應(yīng) 裝置；二是作為分光光度檢測的比色皿。玻璃比色皿能吸收紫外光，僅適用于可 見光區(qū)；石英比色皿不吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)。試樣容器，又稱吸 收池，供盛放試液進(jìn)行吸光度測量之用，分為石英池和玻璃池兩種，

13、前者適用于 紫外到可見區(qū)，后者只適用于可見區(qū)。容器的光程一般為 0.510 厘米。 5 5 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 將通過被測試液吸收后的光信號(強度)放大，并通過顯示器以數(shù)值形式顯示 出來，該過程中應(yīng)該注意，由于隨機誤差原因，比較法準(zhǔn)確度相對于標(biāo)準(zhǔn)曲線法 要差一些，另外標(biāo)準(zhǔn)溶液與被測溶液濃度相差太大時有較大誤差和顯色反應(yīng)與顯 色條件。檢測器，又稱光電轉(zhuǎn)換器，常用的有光電管或光電倍增管，后者較前者 更靈敏，特別適用于檢測較弱的輻射。近年來還使用光導(dǎo)攝像管或光電二極管矩 陣作檢測器，具有快速掃描的特點。 （三）（三） 紫外可見分光光度法特點紫外可見分光光度法特點 分光光度法對于分析人員來說，可以說是最

14、有用的工具之一。幾乎每一個分 析實驗室都離不開紫外可見分光光度計。分光光度法的主要特點為： 1 1 應(yīng)用廣泛應(yīng)用廣泛 由于各種各樣的無機物和有機物在紫外可見區(qū)都有吸收，因此均可借此法加 以測定。到目前為止，幾乎化學(xué)元素周期表上的所有元素（除少數(shù)放射性元素和 惰性元素之外）均可采用此法。 2 2 靈敏度高靈敏度高 由于相應(yīng)學(xué)科的發(fā)展，使新的有機顯色劑的合成和研究取得可喜的進(jìn)展，從 而對元素測定的靈敏度大大提高了一步。特別是由于多元絡(luò)合物和各種表面活性 劑的應(yīng)用研究，使許多元素的摩爾吸光系數(shù)由原來的幾萬提高到幾十萬。相對于 其它痕量分析方法而言，光度法的精密度和準(zhǔn)確度一致公認(rèn)是比較高的。不但在 實

15、際工作中光度法被廣泛采用，在標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的研制中，它更受重視，很多光 度分析法已制定成為標(biāo)準(zhǔn)方法。 3 3 選擇性好選擇性好 目前已有些元素只要利用控制適當(dāng)?shù)娘@色條件就可直接進(jìn)行光度法測定，如 鈷、鈾、鎳、銅、銀、鐵等元素的測定，已有比較滿意的方法了。 4 4 準(zhǔn)確度高準(zhǔn)確度高 對于一般的分光光度法來說，其濃度測量的相對誤差在 1-3%范圍內(nèi)，如采 用示差分光度法測量，則誤差往往可減少到千分之幾。 5 5 適用濃度范圍廣適用濃度范圍廣 可從常量（1-50%） （尤其是使用示差法）到恒量（10-6-10-8%） （經(jīng)預(yù)富集 后） 6 6 分析成本低、操作簡便、快速分析成本低、操作簡便、快速 （四

16、）紫外可見分光光度法的應(yīng)用（四）紫外可見分光光度法的應(yīng)用 1 1 光譜分析光譜分析 有時候需要研究某物質(zhì)在某溶劑中的光譜特性，如 Vc 的乙酸溶液在 252.0 nm 和 237.5nm 處有吸收波峰。 大多數(shù)情況下，比色分析都提供了使用光的波長（一般是最大吸收峰波長） 。 如果沒有提供使用波長的話，可以用紫外分光光度計從 2001000nm 范圍內(nèi)掃 描吸收光譜，搜索到吸收峰，再用吸收峰波長來比色分析。 咖啡因樣品用紫外光譜定性和定量，上：標(biāo)準(zhǔn)品；下：樣品。 圖圖 1 咖啡因樣品用紫外光譜定性和定量圖 2 2 紫外可見分光光度法定性分析紫外可見分光光度法定性分析 （1 1） 可作為物質(zhì)定性的

17、參考可作為物質(zhì)定性的參考 被測物質(zhì)的光譜特性和標(biāo)準(zhǔn)物如果一致，可粗略定性。如檢查 VB12注射液 是否變質(zhì)，測定其光譜，結(jié)果為 2790；361.50；550.70.3nm 個吸收峰， 完全一致，可以判定該物質(zhì)為 VB12（未變質(zhì)） 。 表表 1 一些苯衍生物的紫外光譜特征如下表所示 化合物 溶劑 吸收峰吸收峰 吸收峰 Emolmax，1cm 苯 碳?xì)浠衔?254nm250 nm 204 nm 8800 nm 甲苯 碳?xì)浠衔?262 nm260 nm 208 nm 7900 nm 六甲基苯 碳?xì)浠衔?271 nm230 nm 221 nm 10000 nm 氯苯 碳?xì)浠衔?267 nm

18、200 nm 210 nm 7400 nm 苯酚 碳?xì)浠衔?271 nm1260 nm 213 nm 6200 nm （2 2） 用于有機化合物的定性和結(jié)構(gòu)分析用于有機化合物的定性和結(jié)構(gòu)分析 紫外吸收光譜在某種程度上反映了化合物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，所以可以用于有機 化合物的定性和結(jié)構(gòu)分析。利用標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜可以對未知化合物進(jìn)行鑒定， 即控制相同的測量條件，將未知化合物的吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對照， 如果兩者吸收光譜的形狀、吸收峰的數(shù)目、位置、最大吸收波長及吸光強度完全 一致，則可說明它們分子結(jié)構(gòu)中存在相同的生色基團(tuán)，初步確定它們是同一種物 質(zhì)，如咖啡因的定性。由于大多數(shù)有機化合物的紫外

19、光譜比較簡單，缺乏精細(xì)的 結(jié)構(gòu)特征，而且很多生色團(tuán)的吸收峰幾乎不受分子中其它非吸收基團(tuán)的影響，因 此，僅根據(jù)紫外光譜鑒定有機化合物有很大局限，一般必須與紅外光譜、質(zhì)譜、 核磁共振波譜等相配合，才能進(jìn)行精確的鑒定。 在測定有機物的紫外可見吸收光譜時，在溶解度容許范圍內(nèi)，應(yīng)盡量選擇非 極性溶劑或極性較小的溶劑（烷、烯烴，如正己烷、正庚烷） ，以獲得吸收光譜 的精細(xì)結(jié)構(gòu)。與標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對比時，必須用相同的溶劑。所選擇的 溶劑在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)應(yīng)該沒有明顯的吸收；并且不含有其它干擾物質(zhì)；與 溶質(zhì)沒有相互作用。否則會使光譜線產(chǎn)生移動，低于此波長時，溶劑的吸收不可 忽略。 表表 2 常用溶劑的

20、波長范圍如下 溶 劑使 用 波 長 范 圍溶 劑使 用 波 長 范 圍 甲 醇210二 氯 甲 烷 235 . 乙 醇210氯 仿 235 . Comment S1: 重新輸入 水210乙 酸 乙 酯 235 . 96% 硫 酸210苯 235 . 乙 醚210甲 苯 235 . 3 3 紫外可見分光光度法定量分析物質(zhì)含量紫外可見分光光度法定量分析物質(zhì)含量 （1 1） 朗伯朗伯- -比爾定律比爾定律 朗伯-比爾定律中的 K 稱為吸光系數(shù)。因比色杯的直徑用 cm 為單位，因此 K 的單位決定于濃度 c 用什么單位，如 c 以 mol/L 為單位時 K 稱為摩爾吸光系 數(shù)，用 Emol或 mol表

21、示；如果物質(zhì)的分子量未知，濃度可用%為單位，K 稱為百 分吸光系數(shù)，用 E%表示。 E 的定義是：某波長光通過 1cm 杯、1mol/L 或 1%濃度的某溶液時，該溶液 對該波長光的吸光度。E 在特定波長、1mol/L 或 1%濃度、特定溶劑條件下是該 物質(zhì)的一個特征常數(shù)，反映該物質(zhì)的吸光能力，資料和測定時都要標(biāo)明其特征波 長或最大吸收波長，表示為或E%nm，max，1cm。許 % 1max,cmnm E波長 % 1max,cmnm E波長 多物質(zhì)的吸光系數(shù)在書或資料中可以查到，如藥典規(guī)定 VB12應(yīng)該有 2781 nm、3611nm、5502nm 3 個吸收峰，其 E1%361nm，1cm=

22、207。實際工作中， 1mol/L 的濃度太高，可以配成 1mmol/L 或 1mol/L 的濃度，相應(yīng)地寫成 Emmol（mol）nm，max，1cm。 （2)2) 紫外可見分光光度法定量分析紫外可見分光光度法定量分析 根據(jù)吸光系數(shù)的特性 ，它有 4 項用途： 檢查純度: 紫外光譜法檢查純度是一種簡便有效的方法，用于許多化合物檢測。 如阿司匹林在空氣中容易吸收水分產(chǎn)生水楊酸，阿司匹林在 280nm 處有強吸收 峰，而水楊酸的吸收峰遷移到 312nm，只要檢測在 312nm 處是否有吸收峰，即 可判斷有無水楊酸。再如無水乙醇精制過程中要用苯，測定無水乙醇中是否殘留 苯，測定其吸收光譜，乙醇在

23、210600nm 之間無吸收峰，而苯在 250、254 nm 有吸收峰，以純無水乙醇為參比，對樣品進(jìn)行光譜分析，如果在 250、254nm 處 出現(xiàn)吸收峰，則說明有苯殘留。 檢查含量（純度）:如藥典規(guī)定 VB12的 E1%max，361nm，1cm=207，上述 VB12注 射液原標(biāo)示濃度為 0.05%，求實際濃度，方法：藥液用重蒸水精確稀釋 20 倍， 水做參比，用 361nm 測定的吸光度為 0.512，其含量為：1%207=x%0.512 ，x%=0.00247%，濃度= 0.00247%20=0.049% 應(yīng)用摩爾吸光系數(shù)測定濃度: 一般的比色分析中都有標(biāo)準(zhǔn)品，未知樣品都是 通過和標(biāo)準(zhǔn)

24、溶液對比分析含量。某些情況下，沒有標(biāo)準(zhǔn)品，可以用摩爾吸光系數(shù) 或百分吸光系數(shù)進(jìn)行測定，直接測定溶液的吸光度，通過和該純物質(zhì)的吸光系數(shù) 比較，可以計算出濃度。這樣的分析需要經(jīng)過精確校正了波長的分光光度計，紫 外分光光度計的波長一般精確到 2nm，可以承擔(dān)這樣的分析。如果知道分子量 的話，百分吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)之間可以互相換算，換算公式是：百分吸光 系數(shù)=10摩爾吸光系數(shù)物質(zhì)的分子量。 比如血紅蛋白是 4 個亞基組成的蛋白質(zhì)，單個亞基的平均分子量是 16114.5。每個亞基都在高鐵氰化鉀K3Fe(CN)6和氰化鉀KCN溶液中形成單體 氰化高鐵血紅蛋白（HiCN） ，它的特征（最大）吸收峰在 5

25、40nm 處，摩爾吸光 系數(shù)是 11000，表示為 Emolmax,540nm,HiCN=11000。 測定樣品在同樣條件下的吸光度，就可以計算出含量。如：將血液 0.02ml 加入到 5.0ml 氰化高鐵試劑中，用 540nm 測定的吸光度為 0.35，求血液中 Hb 的 含量（g/L） 。第一步，計算血液稀釋倍數(shù)：5.020.02=251（倍） ；第二步，計算： 1mol11000=x mol0.35，x=0.3511000 mol/L，乘以分子量和稀釋倍數(shù)變?yōu)?g， x=0.351100016114.5 251=128.7（g/L） 。如果有些物質(zhì)不知分子量，用它的 1%溶 液在同樣條件

26、下測定，用百分吸光系數(shù)同樣可以換算。 作為光度計使用：有色的反應(yīng)液可以用普通的分光光度計（721、722、濃度 計） ，也可以用紫外分光光度計比色。某些溶液、反應(yīng)液無色，在 200400nm 之間有特征性光吸收，就只能用紫外分光光度計。 1. 單一物質(zhì)測定：先測定溶質(zhì)的吸收光譜，一般用最大吸收波長進(jìn)行比色。常 用方法有 2 種: （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：用標(biāo)準(zhǔn)液制作一系列標(biāo)準(zhǔn)管的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品測定結(jié)果查標(biāo) 準(zhǔn)曲線求知。 （2）對照管法：制作標(biāo)準(zhǔn)測定管和樣品測定管，在特征吸收峰（或最大吸收峰） 處測定吸光度進(jìn)行比較，可直接求出樣品含量。如 VB12含量測定：精確吸 VB12 注射液 Vml，加重蒸水稀

27、釋 n 倍，使每含的標(biāo)示量為 30g/ml，另外配 VB12標(biāo)準(zhǔn) 液濃度為 30g/ml，蒸餾水調(diào)零，用 361nm 測定吸光度 A，計算：測定液中 VB12 含量（g/ml）=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)品）30；注射液中 VB12含量（g/ml）=（A樣品/A 標(biāo)準(zhǔn)品）30 n（稀釋倍數(shù)）V（取樣量，ml） 。 2. 混合物中兩物質(zhì)同時測定（兩物質(zhì)的最大吸收峰有部分重合） ，例四環(huán)素和金 霉素混合物的測定：四環(huán)素在 0.25 N NaOH 中最大吸收峰為 380nm，E1%1cm，max =372.0；在 0.1N HCl 中最大吸收峰為 355nm，E1%1cm，max =303.2 ；兩吸收峰都可

28、以做為四環(huán)素的測定波長。但與金霉素共存時，因為金 霉素在 355nm 處有吸收（金霉素在 0.1N HCl 中 E1%1cm，max =182.6） ，只能用 380nm 測定四環(huán)素?；旌蠘悠吩?355nm 處測定二者的總吸光度，在 380nm 處測 得四環(huán)素的吸光度，則兩者的濃度都可以求出。測定方法： （1）測定 1%混合物在 0.1N HCl 溶液的吸光度 A335 （2）測定 1%混合物在 0.25N NaOH 溶液的吸光度 A380，計算：四環(huán)素濃度 C1（g%）= AC1380 / E1%（C1）1cm，380= AC1380 / 372.0 金霉素濃度 C2（g%） =AC1+C2

29、335（E1%（C1）1cm，355 C1）E1%（C2）1cm，355 = AC1+C2335（303.2AC1380372.0）182.6 4 4 在其它方面的應(yīng)用在其它方面的應(yīng)用 紫外光度法廣泛應(yīng)用在化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測、食品衛(wèi)生檢驗分 析方面。凡在 200-1000nm 范圍內(nèi)有特征性吸收，或與試劑反應(yīng)后形成特征性吸 收，符合郎伯比爾定律的，都可以分析。如： (1)(1) 測定蛋白質(zhì)：測定蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸對 280nm 的紫外線有最大吸收， 吸收值與其濃度成正比，樣品不必反應(yīng)，稀釋后直接測定。 (2)(2) 肌紅蛋白：肌紅蛋白：在 576nm 附近有吸收峰，

30、不需要標(biāo)準(zhǔn)品，通過摩爾吸光系數(shù)法， 可直接測定。 (3)(3) 還原性谷胱甘肽：還原性谷胱甘肽：與四氧嘧啶反應(yīng)，生成物在 305nm 處有最大吸收峰。 (4)(4) 過氧化氫酶：過氧化氫酶：有可見光測定法，也有紫外法。 (5)(5) 抗生素：抗生素：大部分可用紫外法測定，如青霉素、鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、金 霉素、新生霉素。 (6)(6) 許多藥物要用紫外光譜測定：許多藥物要用紫外光譜測定：如咖啡因用 272.6nm；巴比妥類（安眠藥）用 220240nm 測定；5 種氯丙嗪類藥（鎮(zhèn)定藥）全用 249307nm 測定；安眠酮用 235 和 503nm 分析；安定（鎮(zhèn)靜藥）用 240 和 285

31、nm 分析。 (7)(7) 用于紫外比色測定：用于紫外比色測定：食品中硒與鄰苯二胺反應(yīng)，將絡(luò)合物提取到甲苯中，反 應(yīng)物在 335nm 左右有吸收峰，用紫外比色測定。 二二 紫外分光光度法紫外分光光度法測飲料中咖啡因的含量測飲料中咖啡因的含量 （一）（一） 實驗藥品及儀器實驗藥品及儀器 1 1 藥品藥品 本實驗所用試劑均為分析純試劑，實驗用水為蒸餾水。 （本實驗所有試劑均 由酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系實驗室提供） （1 1）無水硫酸鈉無水硫酸鈉 （2 2）三氯甲烷三氯甲烷使用前重新蒸餾 （3 3）1.5(m/v)1.5(m/v)高錳酸鉀溶液高錳酸鉀溶液: : 稱取 1.5g 高錳酸鉀，用水溶解并

32、稀釋至 100mL。 （4 4）亞硫酸鈉和硫氰酸鉀混合溶液亞硫酸鈉和硫氰酸鉀混合溶液: : 稱取 10g 無水亞硫酸鈉(Na2SO3)，用水 溶解并稀釋至 100mL，另取 10g 硫氰酸鉀，用水溶解并稀釋至 100mL，然后二者 均勻混合。 （5 5）15%(V/V)15%(V/V)磷酸溶液磷酸溶液: : 吸取 15mL 磷酸置于 100mL 容量瓶中，用水稀釋至刻 度，混勻。 （6 6）20%(m/V)20%(m/V)氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液: : 稱取 20g 氫氧化鈉，用水溶解，冷卻后稀釋至 100mL。 （7 7）20%(m/V)20%(m/V)醋酸鋅溶液醋酸鋅溶液: : 稱取 20

33、g 醋酸鋅Zn(CH3COO)22H2O加入 3mL 冰 乙酸，加水溶解并稀釋至 100mL。 （8 8）10%(m/V)10%(m/V)亞鐵氰化鉀溶液亞鐵氰化鉀溶液: : 稱取 10g 亞鐵氰化鉀。K4Fe(CN)63H2O用 水溶解并稀釋至 100mL。 （9 9）咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品: : 含量 98.0%以上。 （1010）咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲備液咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲備液: : 根據(jù)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的含量用重蒸三氯甲烷配制成 每 mL 相當(dāng)于 0.5mg 咖啡因的溶液，置于冰箱中保存。 2 2 儀器儀器 紫外分光光度計。 （二）（二） 實驗分析步驟實驗分析步驟 1 1 樣品的處理樣品的處理 （1 1）

34、 飲料飲料:在 250mL 的分液漏斗中，準(zhǔn)確移入 10.0mL 經(jīng)超聲脫氣后的均勻可 樂型飲料試樣，加入 1.5%高錳酸鉀溶液 5mL，搖勻，靜置于 5min，加入混合溶 液 10mL，搖勻，加入 30mL 重蒸三氯甲烷。振搖 100 鎰，靜止分層，收集三氯 甲烷。水層再加入 10mL 重蒸三氯甲烷，振搖 100 次，靜置分層。合并二次三氯 甲烷萃取液，并用重蒸三氯甲烷定容至 100mL，搖勻，備用。 （2 2） 咖啡、茶葉及其固體制成品咖啡、茶葉及其固體制成品: :在 100mL 燒杯中稱取經(jīng)粉碎成低于 30 目的 均勻樣品 0.52.0g，加入 80mL 沸水，加蓋，搖勻，浸泡 2h，然

35、后將浸出液全 部移入 100mL 容量瓶中，加入 20%醋酸鋅溶液 2mL，加入 10%亞鐵氰化鉀溶液 2mL，搖勻，用水定容至 100mL，搖勻，靜置沉淀，過濾。取濾液 5.020.0mL 按 5:1:1 操作進(jìn)行，制備成 100mL 三氯甲烷溶液，備用。 （3 3）咖啡或茶葉的液體制成品：）咖啡或茶葉的液體制成品：在 100mL 容量瓶中準(zhǔn)確移入 10.020.0mL 均 勻樣品，加入 20%醋酸鋅溶液 2mL，搖勻，加入 10%亞鐵氰化鉀溶液 2mL，搖 勻，用水定容至 100mL，搖勻，靜置沉淀，過濾；取濾液 5.020.0mL 按 5:1:1 操作進(jìn)行，制備成 100mL 三氯甲烷溶

36、液，備用。 2 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 從 0.5mg/mL 的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲備液中，用重蒸三氯甲烷配制成濃度分別為 2. 00 ，4. 00 ，6. 00 ，8. 00 ，10. 00 ，12. 00 ，14. 00g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列，以 0g/mL 作參比管，調(diào)節(jié)零點，用 1cm 比色杯于 276.5nm 下測量吸光度 A，得出 吸光度-咖啡因濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線或求出直線回歸方程。 圖圖 2 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線 3 3 測定測定 在 25mL 具塞試管中，加入 5g 無水硫酸鈉，倒入 20mL 樣品的三氯甲烷制 備液，搖勻，靜置。將澄清的三氯甲烷用 1cm 比色杯于 276.5nm 測出

37、其吸光度， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（直線回歸方程）求出樣品的吸光度相當(dāng)于咖啡因的濃度 C（g/mL） 。這時用重蒸三氯甲烷作試劑空白。 （三）（三） 實驗結(jié)果實驗結(jié)果 1 1 計算計算 % 1max,cmnm E波長 % 1max,cmnm E 波長 可樂型飲料中咖啡因含量 . 1000 1000100 0 V cc l mg 咖啡、茶葉及其固體制成品中咖啡因含量(mg/100g) 1000 100100100 1 0 MV CC 咖啡、茶葉及其固體制成品中咖啡因含量(mg/100g) （3） 式中:C樣品吸光度相當(dāng)于咖啡因濃度（g/mL） C0試劑空白吸光度相當(dāng)于咖啡加濃度（g/mL） m稱取樣品的重

38、量（g） V 移取樣品的體積（mL） V1移取樣品處理后水溶液的體積（mL） 2 2 本實驗條件下本實驗條件下 本法儀器檢出限為 0.2g/mL，方法檢出限可樂型飲料為 3mg/L，咖啡、茶 葉及其固體制成品為 5mg/100g，咖啡或茶葉的液體制品為 5mg/L。 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍： 0.030.0g/mL。 相關(guān)系數(shù)：0.999。 方法回歸率：90.1101.8%。 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差：4.0%。 3 3 允許差允許差 同一實驗室平行測定或重復(fù)測定結(jié)果的相對偏差絕對值可樂型飲料為 10%，咖啡、茶葉及其制品為 15%。 （四）（四） 實驗條件的選擇實驗條件的選擇 1 1 吸收曲線吸收曲線 從圖

39、3 可見，咖啡因最大吸收峰，在 276.5 毫微米處。 圖圖 3 咖啡因吸收曲線 2 2 pHpH 的影響的影響 吸取 10 微克標(biāo)準(zhǔn)咖啡因溶液于 50 毫升容量瓶或燒杯中，加水至 45 毫升， 用 0.1NHCI 和 0.1NNaOH 溶液，調(diào)節(jié) pH110。然后分別倒人 250 毫升的分液漏 斗中，以下操作按提取(1)進(jìn)行。結(jié)果見圖 4。 圖圖 4 pH 值對提取效果的影響 圖 4 說明，pH 值在 110 范圍內(nèi)，對萃取效果，沒有明顯地差異，其吸光 度穩(wěn)定。說明 pH 在 110 范圍內(nèi)，對咖啡因沒有影響，但萃取咖啡因的最佳 pH 范圍為 6.010.0；在 pH6.0 以一下時，當(dāng)劇烈

40、振搖時，易乳化，分層慢，在 pH6.010.0 沒有以上現(xiàn)象。 3 3 氯化鈉對方法的影響氯化鈉對方法的影響 取含有咖啡因毫克的樣品溶液，倒人不同濃度的氯化鈉溶液中進(jìn)行測定，得 到圖 5 曲線。由曲線可知，氯化鈉的濃度對測定方法，有明顯的影響。再使用飽 合鹽水 00.3 毫升時，提取時產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，測定結(jié)果偏低；使用飽合鹽水 0.51.5 毫升時，其吸光度的變化，趨于平穩(wěn)，回收率為 98.5%，故選定飽合鹽 水加入量為 1.0 毫升，作為測定條件最宜濃度。加入飽和鹽水 1.sml 以上時，產(chǎn) 生大量沉淀物，其測定結(jié)果偏低。 圖圖 5 氯化鈉溶液濃度對提取效果影響 4 4 萃取時間萃取時間 萃取

41、搖蕩時間的長短，對吸光度值無明響地影響，所以我們選定搖蕩時間為 l 分鐘。 5 5 提取溶劑的使用量提取溶劑的使用量 根據(jù)目前市售可樂型飲料中的咖啡因濃度，取不含咖啡因的可口可樂（預(yù)先 將咖啡因全部提出來）100 毫升，加入標(biāo)準(zhǔn)咖啡因 40 毫克，以不同體積的三氯 甲烷分別萃取三次，得到總回收率見表 3。 表表 3 三氯甲烷提取溶劑的使用量（毫升） 第一次使用 （ml） 第一次使用 （ml） 第一次使用 （ml） 第一次使用 （ml） 第一次使用 （ml） 432968 5431277.5 6541589.8 8641896.92 8752099.70 12852599.85 表 3 結(jié)果說明

42、，提取劑三氯甲烷使用量，在 18 毫升以上均可提取完全，為 了適應(yīng)各種可樂型飲料，故將提取溶劑定為 50ml。 6 6 方法精密度方法精密度 為了檢查本方法的精密度，根據(jù)上述實驗條件，得到表 4。 表表 4 咖啡因回收率對比表 樣品含咖啡因 （毫克） 加入標(biāo)準(zhǔn)咖啡因 （毫克） 測得總咖啡因 （毫克） 回 收 率 （%） 5.52.07.60101.30 5.52.07.65106.25 5.52.07.4298.93 5.54.09.3896.87 5.54.09.4299.15 5.56.011.2595.8 5.56.011.50100 5.56.011.50100 5.510.015.0

43、095 5.510.015.1396.25 5.510.015.3498.97 5.510.015.2098.06 5.510.015.2597.50 11.01.011.9593.80 11.01.011.9899.83 11.01.012.00100 從表 4 的結(jié)果，說明方法的精密度比較高，同時在原料和成品中做出的回收 率是一致的，其平均回收率了 98.61%，標(biāo)淮偏差 Sx2.70，變動系數(shù) CV2.94。 （五）（五） 結(jié)果與討論結(jié)果與討論 1 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 觀察咖啡因的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知隨著咖啡因含量的增加,其在最大吸收波長處的 吸光度也逐漸增加,呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系.線性方程為:

44、Y= 0.031 74+0.050 62X.相關(guān) 系數(shù) r= 0.999 7. 2 2 咖啡因分析條件的優(yōu)化咖啡因分析條件的優(yōu)化 （1 1） 溶劑的選擇溶劑的選擇 準(zhǔn)確移取三份 1.0 mL 200 mg/L 咖啡因水溶液于三支 10 mL 比色管中，分別 加入二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯 8.0 mL，充分震蕩，萃取后離心分離，取 清液在 250300 nm 波長范圍內(nèi)掃描。比較咖啡因在不同溶劑中的紫外吸收光譜， 可以看出三氯甲烷作溶劑時，吸光度最大，最大吸收峰位于 276 nm。由此可知 三氯甲烷的萃取效率最佳。因此，本實驗選用三氯甲烷作溶劑。 （2 2） 樣品和溶劑的混合體積比選擇樣品和

45、溶劑的混合體積比選擇 本實驗選用 5 mL 溶劑，樣品用量分別選 0.35 mL、0.60 mL、1.00 mL，即 體積比分別為 14:1、8:1、5:1 進(jìn)行測定,結(jié)果見表 5。廠家報道的咖啡因含量為:可 口可樂 95.7 mg/L,百事可樂 104.2 mg/L11。從表 5 可以看出 14:1 與 8:1 時所 測得的萃取液中的咖啡因濃度與標(biāo)準(zhǔn)值相近。而 5:1 時測得結(jié)果偏低.因此樣品 測定中溶劑與溶液的體積比采用 8:1。 表表 5 三氯甲烷與樣品不同體積比混合所測得的咖啡因濃度（mg/L） 體 積 比樣 品 14:18:15：1 可口可樂（瓶裝）90.5790.0585.27 百

46、事可樂（瓶裝）101.48101.2597.08 （3 3）樣品分析和標(biāo)準(zhǔn)加入的回收率樣品分析和標(biāo)準(zhǔn)加入的回收率 用本研究中建立的方法對康師傅綠茶、康師傅紅茶、可口可樂(瓶裝)、可口 可樂(灌裝)、百事可樂(瓶裝)、百事可樂(灌裝)中的咖啡因含量進(jìn)行了測定，結(jié)果 見表 6。從表 6 可以看出康師傅紅茶中所含咖啡因的濃度最小，為 54.29 mg/L； 百事可樂(灌裝)所含咖啡因的濃度最大為 118.21 mg/L。 表表 6 飲料中咖啡因濃度測定結(jié)果 咖 啡 因 濃 度 mg/L 樣 品 第 1 次 測 試 第 2 次 測 試 第 3 次 測 試 平 均 值相對標(biāo)準(zhǔn) 偏 差% 康師傅綠茶98.

47、0092.1698.0096.053.51 康師傅紅茶53.1255.4454.3254.292.14 可口可樂 (瓶)89.9287.6091.0489.521.95 可口可樂（罐）92.9492.2499.1294.774.00 百事可樂（瓶）101.3699.12101.36100.611.29 百事可樂 (罐)122.08114.00118.56118.213.43 在 6 種不同的可樂飲料中加入不同濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實驗， 結(jié)果見表 7。從表 7 可以看出所得回收率的數(shù)據(jù)在 94.0%112.0%之間，說明該 方法對飲料中咖啡因的分析結(jié)果較準(zhǔn)確。 表表 7 飲料中加入不

48、同濃度標(biāo)準(zhǔn)咖啡因的回收率測定結(jié)果 咖 啡 因 濃 度 mg/L 樣 品飲料咖啡因 濃度 加 入 量 （mg/L） 測 得 量 （mg/L） 回 收 率 （%） （mg/L） 1011.5396.09 2020.7093.89 康 師 傅 綠 茶 1.921 4041.1097.95 1011.66105.74 2020.1395.22 康 師 傅 紅 茶 1.086 4042.54103.64 1011.3895.90 2020.5693.85 可 口 可 樂 （瓶 裝） 1.790 4041.3999.00 1013.10112.05 2022.14101.23 可 口 可 樂 （罐 裝）

49、1.895 4042.54101.61 1011.5295.08 2022.72103.54 百 事 可 樂 （瓶 裝） 2.012 4041.5398.80 101108.94.36 2022.3099.68 百 事 可 樂 （罐 裝） 2.364 4042.0799.27 通過實驗得出通過實驗得出：用紫外光譜分析法測定了市售飲料中的咖啡因濃度.該方法 具有快速、準(zhǔn)確、溶劑消耗少等特點。 致謝致謝 通過這一階段的畢業(yè)論文的最后落筆，我受益匪淺，不僅鍛煉了良好的邏輯 思維能力，而且培養(yǎng)了棄而不舍的求學(xué)精神和嚴(yán)謹(jǐn)作風(fēng)。我大學(xué)生活也即將畫上 一個圓滿的句號?；仡欉@三年的點點滴滴一切都?xì)v歷在目，讓人

50、倍感留戀，倍感 珍惜。是大學(xué)三年所學(xué)知識很好的總結(jié)。 任老師對本論文從選題、構(gòu)思、資料收集到定稿的各個環(huán)節(jié)給予悉心指導(dǎo)。 在論文的整個過程中任老師不斷把對我得到的結(jié)論總結(jié)，并提出新的問題，我的 論文才能夠繼續(xù)下去。 此次編制招標(biāo)文件不僅重溫了過去所學(xué)知識，而且學(xué)到了很多新的內(nèi)容。相 信這次畢業(yè)論文對我今后的工作會有一定的幫助。所以，我很用心的把它完成。 在論文中體味艱辛，在艱辛中體味快樂。 最后，我要感謝我的指導(dǎo)老師任小娜老師，她對我的畢業(yè)論文進(jìn)行了多次的 修改，我的畢業(yè)論文才得以順利完成。同樣我也要衷心的感謝養(yǎng)育了我的父母， 感謝教育過和指導(dǎo)過我的各位老師，感謝給予我?guī)椭呐笥褌?，?jǐn)獻(xiàn)上我最真摯 的祝福。 參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) 1張萬明。自茶葉中提取咖啡因?qū)嶒灲虒W(xué)