Chap12重組與修復

1、Chapter 12 重組與修復1 1 重組的分子基礎(chǔ)重組的分子基礎(chǔ)2 2 轉(zhuǎn)座與轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)座與轉(zhuǎn)座因子 3 DNA3 DNA損傷的修復損傷的修復1 1 重組的分子基礎(chǔ)重組的分子基礎(chǔ) 變異是生物進化的原材料,變異的來源是基變異的來源是基因突變和基因重組；因突變和基因重組； 基因重組改變了染色體上基因的組成和排列順序；一、遺傳重組的類型：一、遺傳重組的類型：（一）、同源重組（一）、同源重組(homologous recombination): 發(fā)生在DNA的同源序列之間。有重組熱點, 而異染色質(zhì)及其附近區(qū)域很少發(fā)生重組.真核生物：減數(shù)分裂發(fā)生于同源染色體的非姊妹染色單體之間。細菌及某些低等真核生

2、物的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合，某些病毒的重組都屬于這一類。 E. coli的同源重組需要RecA蛋白, 故又稱依賴RecA重組.（二）、位點專一重組（二）、位點專一重組(site-specific recombination): 常見于原核生物，直接在專一序列之間配對而發(fā)生重組,兩個DNA并不交換對等的部分，而是一個DNA分子整合到另一個DNA分子中，又稱整合式重組。 如噬菌體在att位點整合到細菌基因組中，不需要RecA蛋白參與。P P att site B B Bacterial chr gal bio att site P B B P bio gal Prophage/lysogen Excis

3、ion ( int + xis IHF) Integration ( int + IHF) 噬菌體通過位點專噬菌體通過位點專一性重組整合到細一性重組整合到細菌基因組中菌基因組中。 細菌上的附著點稱為細菌上的附著點稱為attBattB，由，由BOBBOB組成組成噬菌體上的附著點稱噬菌體上的附著點稱為為attPattP，由，由POPPOP組成組成（三）、（三）、異常重組 屬于非同源重組范疇，完全不依賴于序列間的同源性而使一段DNA序列插入到另一段中。但在形成重組分子時往往是依賴于DNA復制而完成重組過程，因此又稱為復制性重組(replicative recombination)。如轉(zhuǎn)座子一般的同源

4、重組模型需能夠解釋：1. DNA雙鏈的斷裂、交換和重連 2. 交互性3. 一般性 4. 精確性 5. 基因轉(zhuǎn)變二、同源重組的分子機制 A A a a 重組不僅有正常重組不僅有正常的交互方式，偶的交互方式，偶而也有不規(guī)則的而也有不規(guī)則的非交互方式。非交互方式。 吡哆醇依賴型突變：吡哆醇依賴型突變： pdxp pdxp pdxpdx 585個子囊個子囊重組后應該同時出現(xiàn)野生型和雙突變型孢子對鏈孢霉VB6突變型的雜交試驗(Mitchell,1955)基因轉(zhuǎn)變頻率比這些位點的正常突變率高得很多，好象是一個基因轉(zhuǎn)變成為另一個基因，其鄰近的基因仍然是2:2分離 基因轉(zhuǎn)變(gene conversion):

5、 細胞減數(shù)分裂生成4個子細胞時, 如果3個子細胞得到了一個親本的等位基因, 只有一個子細胞得到了另一個親本的等位基因, 這種親本之間等位基因被調(diào)換的現(xiàn)象稱為基因轉(zhuǎn)變?；蜣D(zhuǎn)變是通過重組和DNA修復所造成的?；蜣D(zhuǎn)變的特點 基因轉(zhuǎn)變的頻率很低； 基因轉(zhuǎn)變與遺傳重組有關(guān)，因為基因轉(zhuǎn)變與遺傳重組都發(fā)生在同樣兩個染色單體的子囊比例高達90%；一個基因發(fā)生基因轉(zhuǎn)變時常伴隨著它兩旁的基因發(fā)生重組。 基因轉(zhuǎn)變的類型一個染色單體相當于一個DNA分子，轉(zhuǎn)變可以影響一個DNA分子的雙鏈，也可僅僅影響其中的一條鏈。 染色單體轉(zhuǎn)變（chromatid conversion):減數(shù)分裂的4個產(chǎn)物中只有一個發(fā)生轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)

6、6:2分離； 半染色單體轉(zhuǎn)變（half-chromatid conversion)：減數(shù)分裂的4個產(chǎn)物中有一個產(chǎn)物的一半或兩個產(chǎn)物的各一半發(fā)生轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)5:3分離或3:1:1:3分離?；蚍蛛x發(fā)生在減數(shù)分裂后的有絲分裂中，即減數(shù)后分離。 一些學者提出不同的重組模型，其中Holliday提出的一個重組模型受到多數(shù)學者的支持，以后又經(jīng)過一些學者和Holliday本人的修改。這個模型叫做異源或雜種DNA模型(heteroduplex or hybrid DNA model)，適用于原核類和真核類。遺傳重組的Holliday模型 (1) 5 A B 3 (8) A 3 5 B3 55 a b 3 兩臂

7、旋轉(zhuǎn) 聯(lián)會 (2) 5 A B 3 b 3 5 a3 55 a b 3 (9) A 酶切 B (3) 5 A B 33 5 b 3 5 a5 a b 3 游離端移動聯(lián)會 (4) 5 A B 3 (10) A A 3 5 B B 3 55 a b 3 游離端交叉連接 b b(5) 5 A B 3 a a3 53 5 (11) A B A b5 a b 3 形成單鏈交叉 a b a B(6) 5 A B 33 5 3 5 A B A b 5 a b 3 分支點移動(7) A a b a B B a b 圖 238 Holiday 重組模型。1. 同源的非姊妹染色體的DNA配對 2. 同源非姊妹染色

8、單體DNA中兩個方向相同的單鏈在DNA內(nèi)切酶的作用下, 在相同位置上同時切開。34. 單鏈的游離端交換位置 5. 單鏈連接，形成交單鏈連接，形成交聯(lián)橋結(jié)構(gòu)（聯(lián)橋結(jié)構(gòu)（cross-bridged structure）6.交聯(lián)橋的位置可以靠拉交聯(lián)橋的位置可以靠拉鏈式活動鏈式活動,沿著配對沿著配對DNA分子移動分子移動橋遷（橋遷（Bridge migration），形成較大），形成較大片段的異源雙鏈區(qū)。這種片段的異源雙鏈區(qū)。這種結(jié)構(gòu)又稱為結(jié)構(gòu)又稱為Holliday 中間中間體體 (1) 5 A B 3 (8) A 3 5 B3 55 a b 3 兩臂旋轉(zhuǎn) 聯(lián)會 (2) 5 A B 3 b 3 5 a

9、3 55 a b 3 (9) A 酶切 B (3) 5 A B 33 5 b 3 5 a5 a b 3 游離端移動聯(lián)會 (4) 5 A B 3 (10) A A 3 5 B B 3 55 a b 3 游離端交叉連接 b b(5) 5 A B 3 a a3 53 5 (11) A B A b5 a b 3 形成單鏈交叉 a b a B(6) 5 A B 33 5 3 5 A B A b 5 a b 3 分支點移動(7) A a b a B B a b 圖 238 Holiday 重組模型。 (1) 5 A B 3 (8) A 3 5 B3 55 a b 3 兩臂旋轉(zhuǎn) 聯(lián)會 (2) 5 A B 3

10、 b 3 5 a3 55 a b 3 (9) A 酶切 B (3) 5 A B 33 5 b 3 5 a5 a b 3 游離端移動聯(lián)會 (4) 5 A B 3 (10) A A 3 5 B B 3 55 a b 3 游離端交叉連接 b b(5) 5 A B 3 a a3 53 5 (11) A B A b5 a b 3 形成單鏈交叉 a b a B(6) 5 A B 33 5 3 5 A B A b 5 a b 3 分支點移動(7) A a b a B B a b 圖 238 Holiday 重組模型。79.繞交聯(lián)橋旋轉(zhuǎn)180度，出現(xiàn)中空的十字構(gòu)型1011通過兩種方式切斷DNA單鏈以消除交聯(lián)橋

11、,恢復兩個線形DNA分子 ，如左右切斷, 形成的線性分子是非重組體(AB與ab); 如上下切斷, 在形成的線性分子中, 其異源雙鏈異源雙鏈DNA的兩側(cè)標記基因是重組體(Ab與aB).Holliday 模型的十字構(gòu)型中間體的電鏡照片 g+ ACAGT g ACATT TGTCA TGTAA則所形成的異源雙鏈區(qū)域為: ACAGT TGTAA ACATT TGTCA 不管Holliday結(jié)構(gòu)斷裂是否導致旁側(cè)標記基因的重組, 它們都含有一個異源雙鏈DNA區(qū), 所以如果雜交的親本為 錯配堿基由核酸外切酶切除,留下單鏈缺口，由DNA聚合酶合成互補片段，填補缺口，再由連接酶把新合成的短鏈以共價鍵連接上去，成

12、為完整的核苷酸鏈，完成修復過程。異源異源DNA鏈的兩種校正方式鏈的兩種校正方式G(+)A()GCTA切除A,野生型g+切除G,突變型g-基因轉(zhuǎn)換的起源 錯配堿基G/A校為G/C, C/T校為A/T, 產(chǎn)生4:4分離;G/A或C/T校為G/C或C/G, 產(chǎn)生6:2或2:6分離;G/A校為G/C, C/T未校正, 產(chǎn)生5:3或3:5分離;G/A或C/T均未校正, 產(chǎn)生3:1:1:3分離. A g+ A g+ a g+ A g+ 全部校正 4 : 4 a g+ 6 :2 a g 正常分離 正常分離 a g A g+ 未校正 A g+ A g+ a g A g+ a g 部分 a g+ 校正 a g

13、a g+ a g+ 5 : 3 A g+ A g+ 異常 a g+ 4 : 4 分離 A g+ 異常分離 A g A g a g a g A g a g a g a g 圖 23-7 基因轉(zhuǎn)變和減數(shù)后分離2 轉(zhuǎn)座與轉(zhuǎn)座因子 有些基因在染色體上的位置是可以移動的, 這類基因稱為可移動基因，也可稱為轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座因子(transposable element). 基因可移動概念的提出 McClintock (1951), 玉米粒顏色的遺傳: 正常：有色 有色 異常：有色 色斑 有色 無色McClintocks microscope and ears of corn on exhibition at

14、 the National Museum of Natural History.Barbara McClintock (1902-1992)原核生物中的轉(zhuǎn)座因子：插入序列（IS）轉(zhuǎn)座子（Tn）真核生物中的轉(zhuǎn)座因子：玉米的Ac-Ds系統(tǒng)果蠅的P因子 插入序列(inserted sequence ，IS): 僅含有轉(zhuǎn)座酶基因的簡單轉(zhuǎn)移序列，本身沒有任何表型效應，長度多在7001500bp左右. 由末端反向反向重復序列(IR,inverted repeat sequence), 轉(zhuǎn)座酶基因組成. 插入基因組中時, 在靶位上生成正向正向重復序列(DR).IS 長度/bp 末端IR 靶位DR 插入選擇I

15、S1 768 23 9 隨機IS10 1329 22 9 TNAGCN IS50 1531 9 9 熱點常見的IS結(jié)構(gòu) 帶有轉(zhuǎn)座酶基因等必需基因及抗藥性等與轉(zhuǎn)座無關(guān)基因的轉(zhuǎn)座因子. 結(jié)構(gòu)特征: 兩端具有同向或反向插入序列, 同時, 兩端的IS可能相同或不同. 常見的轉(zhuǎn)座子： 轉(zhuǎn)座子 長度/bp 抗性標記 兩端序列 取向 Tn 5 5700 KanR IS50 反向 Tn10 9300 TetR IS10 反向 Tn 9 2500 CamR IS1 同向 復合轉(zhuǎn)座子(transposon, Tn)轉(zhuǎn)座子的遺傳學效應轉(zhuǎn)座子的遺傳學效應 1引起插入突變； 2插入位置上出現(xiàn)新基因； 3、切離：造成回復

16、突變或染色體畸變。 4造成同源序列的整合。 5產(chǎn)生新的變異,有利于進化。由轉(zhuǎn)座子引起的染色體由轉(zhuǎn)座子引起的染色體DNA缺失和倒位缺失和倒位 玉米的Ac-Ds系統(tǒng)玉米中的Ac-Ds系統(tǒng)（9染色體短臂）該系統(tǒng)的控制元件可分為兩類：自主移動的調(diào)節(jié)因子Ac ，能合成轉(zhuǎn)座酶，并支配受體因子移動，4.5 kb, 5個exon, 編碼轉(zhuǎn)座酶.非自主移動的受體因子Ds ，不產(chǎn)生蛋白，0.54.0 kb, 與Ac有同源序列, 插入引起色素不能合成.C AcC DsC Ds AcThe relationship of Ac/Ds in the control of the elements and mosaic

17、color of maize. The seed in 10 is colorless, there is no Ac element present and Ds inhibits the synthesis of colored pigments called anthocyanins. In 11 to 13, one copy of Ac is present. Ds can move and some anthocyanin is produced, creating a mosaic pattern. In the kernel in panel 14 there are two

18、Ac elements and in 15 there are three.P型型（父本貢獻的，（父本貢獻的，paternal contributing）M型型（母本貢獻的，（母本貢獻的，maternal contributing） P品系（品系（paternal strains）M品系品系 ( maternal strains) 果蠅的P因子 M果蠅 P果蠅 不育 M果蠅 P果蠅 可育雜種劣育雜種劣育（hybrid dysgenesis）P因子因子（1） P因子全長因子全長2907bp，兩端有，兩端有31bp的反向的反向重復序列。重復序列。開放閱讀框 ORF 0ORF1ORF2ORF3 內(nèi)含

19、子 1 2 3（2）P因子有因子有4個編碼區(qū)，個編碼區(qū)，3個內(nèi)含子。個內(nèi)含子。P因子表達差異：體細胞 ORF 0，1，2 66 kD轉(zhuǎn)座阻遏物生殖細胞 ORF 0，1，2，3 87 kD轉(zhuǎn)座酶P型細胞質(zhì): 含66 kD轉(zhuǎn)座阻遏物M型細胞質(zhì): 不含66 kD轉(zhuǎn)座阻遏物，導致P因子轉(zhuǎn)座和配子敗育 P P 含P因子轉(zhuǎn)座阻遏物 P因子不能轉(zhuǎn)移, 可育 P M 含P因子轉(zhuǎn)座阻遏物 P因子不能轉(zhuǎn)移, 可育 P M 不含阻遏物 P因子能轉(zhuǎn)移, 不育雌性雌性M果蠅細胞內(nèi)缺失轉(zhuǎn)座阻遏蛋白，引起雄性來源染果蠅細胞內(nèi)缺失轉(zhuǎn)座阻遏蛋白，引起雄性來源染色體上色體上P轉(zhuǎn)座子自由轉(zhuǎn)移，并造成卵細胞敗育轉(zhuǎn)座子自由轉(zhuǎn)移，并造成

20、卵細胞敗育.有 P 因子轉(zhuǎn)座 P 品系 (PP) 雄性染色體 雌性染色體 P 細胞型 阻遏物 P 因子 P 因子 66KD 阻遏物 抑制所 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 66K PM 雄性染色體 雌性染色體 P 細胞型 P 因 子 P 因子 合成轉(zhuǎn) ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 座 酶 87K 雜種不育 MP 雄性染色體 雌性染色體 P 細胞型 阻遏物 無 P 因子 P 因子 66KD 阻遏物 抑制所 ORF0 ORF1 ORF2 ORF3 66K 有 P 因 子轉(zhuǎn)座 圖 23-57 雜種不育取決于基因組中 P 因子和不同類型細胞中

21、66KD 阻遏物的相互作用。 (仿 B.Lewin:GENES ,1997, Fig.18.27)無阻遏物(3)插入后在靶插入后在靶DNA序列形成序列形成8bp的正向重復的正向重復序列序列(4)缺失了中間序列而保留兩端缺失了中間序列而保留兩端IR的的P因子，因子，只要有相應的外顯子提供轉(zhuǎn)座酶，就能轉(zhuǎn)座只要有相應的外顯子提供轉(zhuǎn)座酶，就能轉(zhuǎn)座(5)P因子可以從原位切離因子可以從原位切離類型 (1) 復制型轉(zhuǎn)座復制型轉(zhuǎn)座 （replicative transposition） (2) 非復制型轉(zhuǎn)座非復制型轉(zhuǎn)座 （nonreplicative transposition） (3) 保留轉(zhuǎn)座保留轉(zhuǎn)座 （

22、conservative tranposition）轉(zhuǎn)座機制轉(zhuǎn)座機制以細菌的轉(zhuǎn)座子為例，說明復制型轉(zhuǎn)座的過程1切開 轉(zhuǎn)座酶有兩種功能(1)識別受體靶序列。從5端切開, 產(chǎn)生兩個粘性末端。(2)識別自身兩邊的IR。3切開。 2連接 供體和受體結(jié)合成為共聯(lián)體，以共價鏈齊頭相連,形成兩個缺口。 3復制 DNA多聚酶補上缺口,連接酶連接,形成正向重復序列。 供體質(zhì)粒 受體質(zhì)粒 共聯(lián)體 4重組 在特定位點重組。共合體分離成兩部分。 轉(zhuǎn)座子是以它的一個復制品轉(zhuǎn)移到另一位置,而在原來位置上仍然保留原有的轉(zhuǎn)座子。 供體質(zhì)粒 受體質(zhì)粒 共聯(lián)體 轉(zhuǎn)座因子的遺傳學效應轉(zhuǎn)座因子的遺傳學效應 1引起插入突變； 2插入位

23、置上出現(xiàn)新基因； 3、切離：造成回復突變或染色體畸變。 4造成同源序列的整合。 5產(chǎn)生新的變異,有利于進化。3 DNA損傷的修復DNA損傷的修復機制：一. 直接修復二. 切補修復途徑三. AP核酸內(nèi)切酶修復途徑四. DNA糖基酶修復途徑五. 重組修復作用 1. 概念：在可見光存在的條件下，在光概念：在可見光存在的條件下，在光裂裂合酶作合酶作用下將用下將UV引起嘧啶二聚體分解為單體的過程。引起嘧啶二聚體分解為單體的過程。 一、 直接修復（光復活）光復活）(photoreactivation)光裂合酶（photolyase),由phr 基因編碼2. 作用過程：作用過程：*光復活是原核生光復活是原核

24、生物中的一種主要修物中的一種主要修復形式。復形式。1.概念概念:不需要光照, 而是經(jīng)過一系列修復酶將損傷切除并修補的過程, 稱暗修復。暗修復。2.特點：消除由特點：消除由UV、電離輻射和化學誘變劑引起、電離輻射和化學誘變劑引起的損傷。的損傷。二. 切補修復（暗修復）暗修復）例： 著色性干皮癥是由于缺乏切補修復酶造成的遺傳性缺陷.在E.coli中的切除修復系統(tǒng)損傷：突變的堿基錯配或改變DNA結(jié)構(gòu)剪切：內(nèi)切酶在損傷堿基位點兩側(cè)剪切切除：外切酶除去切口間的DNA合成：DNA pol 合成取代DNA連接酶封閉缺口Uvr系統(tǒng)在修復各階段中的作用UvrAB識別損傷； UvrBC在DNA上切一缺口； Uvr

25、D使被標記區(qū)解旋三. AP核酸內(nèi)切酶修復途徑 單個嘌呤或嘧啶脫去后的位點稱AP位點, 細胞中自發(fā)產(chǎn)生的AP位點的頻率很高. 由AP核酸內(nèi)切酶切斷DNA上的磷酸二酯鍵. 然后再啟動外切、聚合外切、聚合和連接連接酶系統(tǒng)進行切補修復過程. Nucleotide containingA damaged base 5 3 A ATCGTAGATAGCTAA TACCATCTATCGATT 3 5 Glycosylase enzyme recognizes damaged base and cleaves bond 5 3 between base and sugas, A ATCGTAGATAGCTAA releasing the base.TACCATCTATCGATT 3 5 AP endon