微生物誘變育種

1、第四章第四章 微生物誘變育種微生物誘變育種誘變育種：誘變育種：是以人工手段誘發(fā)微生物基因突變，改變其遺傳是以人工手段誘發(fā)微生物基因突變，改變其遺傳結(jié)構(gòu)和功能，從多種多樣的突變體中篩選出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)結(jié)構(gòu)和功能，從多種多樣的突變體中篩選出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變株，良的突變株， 并設(shè)計(jì)出適合該突變株最佳的培養(yǎng)基和條件，并設(shè)計(jì)出適合該突變株最佳的培養(yǎng)基和條件，使其在最適的工藝條件下最有效地合成產(chǎn)物。使其在最適的工藝條件下最有效地合成產(chǎn)物?；蛲蛔兪俏⑸镒儺惖闹饕慈斯ふT變是加速基因突基因突變是微生物變異的主要源泉，人工誘變是加速基因突變的重要手段。誘變育種有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：變的重要手段。誘變育種

2、有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：速度快、收效大、速度快、收效大、方法簡(jiǎn)單。方法簡(jiǎn)單。分三個(gè)階段：菌種基因型改變，分三個(gè)階段：菌種基因型改變， 突變體篩選，產(chǎn)量評(píng)估突變體篩選，產(chǎn)量評(píng)估1. 遺傳性狀穩(wěn)定遺傳性狀穩(wěn)定2. 純凈無(wú)污染純凈無(wú)污染3. 繁殖力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、短時(shí)間內(nèi)能產(chǎn)生所需產(chǎn)物繁殖力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、短時(shí)間內(nèi)能產(chǎn)生所需產(chǎn)物4. 能誘變產(chǎn)生遺傳性變異能誘變產(chǎn)生遺傳性變異5. 具有產(chǎn)量高、收得率高具有產(chǎn)量高、收得率高理想的工業(yè)生產(chǎn)菌種必須具備：理想的工業(yè)生產(chǎn)菌種必須具備： 出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇 單孢子（單細(xì)胞）懸液的制備單孢子（單細(xì)胞）懸液的制備 誘變劑及誘變劑量的選擇誘變劑及誘變劑量的選擇 誘變

3、處理方法誘變處理方法 高產(chǎn)菌株的分離高產(chǎn)菌株的分離第一節(jié)第一節(jié) 誘變育種的步驟誘變育種的步驟對(duì)出發(fā)菌株的要求：對(duì)出發(fā)菌株的要求：1. 對(duì)誘變因素敏感，變異幅度大，正突變率高對(duì)誘變因素敏感，變異幅度大，正突變率高 2. 具有一定生產(chǎn)能力具有一定生產(chǎn)能力 3. 具有有利性狀，如生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子具有有利性狀，如生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株早而多的菌株一、出發(fā)菌株一、出發(fā)菌株4. 有時(shí)可考慮選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為出發(fā)菌株。有時(shí)可考慮選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為出發(fā)菌株。5. 采用一類被稱為采用一類被稱為“增變菌株增變菌株”的變異菌株，它們對(duì)誘變的變異菌株，它們對(duì)誘

4、變劑的敏感性比原始菌株大為提高，更適宜作為出發(fā)菌株。劑的敏感性比原始菌株大為提高，更適宜作為出發(fā)菌株。6. 在選擇產(chǎn)核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)考慮能累積在選擇產(chǎn)核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)考慮能累積少量所需產(chǎn)物或其前體的菌株少量所需產(chǎn)物或其前體的菌株; 而在選擇產(chǎn)抗生素的出發(fā)而在選擇產(chǎn)抗生素的出發(fā)菌株時(shí)，最好選擇已通過(guò)幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價(jià)都菌株時(shí)，最好選擇已通過(guò)幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價(jià)都有一定程度提高的菌株作為出發(fā)菌株。有一定程度提高的菌株作為出發(fā)菌株。 連續(xù)誘變育種過(guò)程中如何選擇出發(fā)菌株連續(xù)誘變育種過(guò)程中如何選擇出發(fā)菌株?突變株的產(chǎn)量是數(shù)量遺傳，只能逐步累加，一次性大幅度提突變株的

5、產(chǎn)量是數(shù)量遺傳，只能逐步累加，一次性大幅度提高發(fā)酵水平不太容易。高發(fā)酵水平不太容易。在選擇出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)挑選每代誘變處理后均有一些表型上在選擇出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)挑選每代誘變處理后均有一些表型上改變的菌株，如發(fā)酵單位有一定程度的提高、形態(tài)上發(fā)生過(guò)改變的菌株，如發(fā)酵單位有一定程度的提高、形態(tài)上發(fā)生過(guò)一次變異或產(chǎn)生過(guò)回復(fù)突變的菌株等，以利于突變率的增加一次變異或產(chǎn)生過(guò)回復(fù)突變的菌株等，以利于突變率的增加 菌號(hào)菌號(hào)誘變代數(shù)誘變代數(shù)菌落大小菌落大小/cm菌落表面菌落表面結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)菌落顏色菌落顏色可溶性色可溶性色素素變株效價(jià)變株效價(jià)提高提高/%454111.3平滑疏松龜背灰綠赭石10071046100.8平滑緊

6、密白火泥棕2011B-53110.6平滑緊密白海螺橙2642C-04自然分離后0.5平滑緊密白淡可可棕3547D-756 130.4平滑緊密白魚(yú)鰓紅6911灰黃霉素高產(chǎn)菌灰黃霉素高產(chǎn)菌D-756誘變系譜菌株表型變異與產(chǎn)量遞增的關(guān)系誘變系譜菌株表型變異與產(chǎn)量遞增的關(guān)系二、單孢子（單細(xì)胞）懸液的制備二、單孢子（單細(xì)胞）懸液的制備對(duì)菌懸液的制備有如下的要求：對(duì)菌懸液的制備有如下的要求：1. 供試菌株的孢子或菌體要年輕、健壯供試菌株的孢子或菌體要年輕、健壯 2. 供試細(xì)胞培養(yǎng)物要新鮮供試細(xì)胞培養(yǎng)物要新鮮3. 菌懸液中的菌體應(yīng)該是單細(xì)胞或單核的孢子菌懸液中的菌體應(yīng)該是單細(xì)胞或單核的孢子制備方法：制備方法

7、：1. 采取分散法采取分散法2. 菌懸液中細(xì)胞的濃度，要求霉菌孢子濃度約為菌懸液中細(xì)胞的濃度，要求霉菌孢子濃度約為106/ml，放，放線菌孢子濃度約為線菌孢子濃度約為106-107/ml。3. 制備菌懸液通常采用生理鹽水。如果用化學(xué)誘變劑處理制備菌懸液通常采用生理鹽水。如果用化學(xué)誘變劑處理時(shí)，應(yīng)采用相應(yīng)的緩沖液配制，以防處理過(guò)程中時(shí)，應(yīng)采用相應(yīng)的緩沖液配制，以防處理過(guò)程中pH變化變化而影響誘變效果。而影響誘變效果。 1. 誘變劑種類選擇誘變劑種類選擇對(duì)遺傳穩(wěn)定的出發(fā)菌株，最好采用以前未使用過(guò)的、突對(duì)遺傳穩(wěn)定的出發(fā)菌株，最好采用以前未使用過(guò)的、突變譜較寬的、誘變率高的強(qiáng)誘變劑。變譜較寬的、誘變率

8、高的強(qiáng)誘變劑。對(duì)遺傳不穩(wěn)定的出發(fā)菌株，采用溫和誘變劑。對(duì)遺傳不穩(wěn)定的出發(fā)菌株，采用溫和誘變劑。對(duì)誘變史較長(zhǎng)的高產(chǎn)菌株，如多次使用某一誘變劑，可對(duì)誘變史較長(zhǎng)的高產(chǎn)菌株，如多次使用某一誘變劑，可能出現(xiàn)能出現(xiàn)“鈍化鈍化”現(xiàn)象，此時(shí)則需改用另外的誘變劑?，F(xiàn)象，此時(shí)則需改用另外的誘變劑。三、誘變劑及誘變劑量的選擇三、誘變劑及誘變劑量的選擇2. 最佳劑量的選擇：最佳劑量的選擇：經(jīng)長(zhǎng)期誘變后的高產(chǎn)菌株、遺傳性狀不太穩(wěn)定的菌株，經(jīng)長(zhǎng)期誘變后的高產(chǎn)菌株、遺傳性狀不太穩(wěn)定的菌株，宜用較溫和的誘變劑和較低劑量處理。宜用較溫和的誘變劑和較低劑量處理。要篩選具有特殊性狀的菌株、較大幅度提高產(chǎn)量的菌株，要篩選具有特殊性狀

9、的菌株、較大幅度提高產(chǎn)量的菌株，則用強(qiáng)誘變劑和高劑量處理。則用強(qiáng)誘變劑和高劑量處理。對(duì)野生低產(chǎn)菌株，開(kāi)始用高劑量，然后逐步用低劑量處對(duì)野生低產(chǎn)菌株，開(kāi)始用高劑量，然后逐步用低劑量處理。對(duì)多核細(xì)胞菌株，用高劑量處理。理。對(duì)多核細(xì)胞菌株，用高劑量處理。誘變處理方式：誘變處理方式：?jiǎn)我蜃犹幚恚菏遣捎脝我徽T變劑處理（一般突變率低）單因子處理：是采用單一誘變劑處理（一般突變率低）復(fù)合因子處理：是指采用兩種以上誘變因素處理（突變率高）復(fù)合因子處理：是指采用兩種以上誘變因素處理（突變率高）分下列幾種情況：分下列幾種情況：1. 兩個(gè)以上因子同時(shí)處理兩個(gè)以上因子同時(shí)處理2. 不同誘變劑交替處理不同誘變劑交替處理

10、3. 同一誘變劑連續(xù)重復(fù)使用同一誘變劑連續(xù)重復(fù)使用4. 紫外線光復(fù)活交替處理紫外線光復(fù)活交替處理四、誘變處理方式四、誘變處理方式隨機(jī)突變，定向篩選。隨機(jī)突變，定向篩選。篩選的條件決定了選育的方向，設(shè)計(jì)一個(gè)好的篩篩選的條件決定了選育的方向，設(shè)計(jì)一個(gè)好的篩選方案是誘變育種的重要前提。選方案是誘變育種的重要前提。五、突變體的分離和篩選五、突變體的分離和篩選出發(fā)菌株出發(fā)菌株誘變誘變絕大多數(shù)個(gè)體死亡絕大多數(shù)個(gè)體死亡少數(shù)存活少數(shù)存活少數(shù)突變少數(shù)突變多數(shù)未變多數(shù)未變多數(shù)負(fù)變多數(shù)負(fù)變少數(shù)正變少數(shù)正變少數(shù)變幅大少數(shù)變幅大多數(shù)變幅小多數(shù)變幅小少數(shù)宜投產(chǎn)少數(shù)宜投產(chǎn)多數(shù)不宜投產(chǎn)多數(shù)不宜投產(chǎn)存活率存活率 突變率突變率正

11、變率正變率高產(chǎn)率高產(chǎn)率 投產(chǎn)率投產(chǎn)率第一代：出發(fā)菌株第一代：出發(fā)菌株分離到平皿上（有時(shí)還結(jié)合指示劑，呈色劑或底物等）分離到平皿上（有時(shí)還結(jié)合指示劑，呈色劑或底物等）挑選菌落挑選菌落 200個(gè)個(gè)初篩初篩 1瓶瓶/株株3-5株（提供第二代誘變出發(fā)菌株）株（提供第二代誘變出發(fā)菌株）誘變誘變50株復(fù)篩株復(fù)篩常規(guī)篩選程序：常規(guī)篩選程序：第二代：出發(fā)菌株第二代：出發(fā)菌株4株株分離到平皿上（有時(shí)還結(jié)合指示劑，呈色劑或底物等）分離到平皿上（有時(shí)還結(jié)合指示劑，呈色劑或底物等）挑菌落挑菌落 初篩初篩 1瓶瓶/株株3-5株（提供第三代誘變出發(fā)菌株）株（提供第三代誘變出發(fā)菌株）誘變誘變挑挑50株復(fù)篩株復(fù)篩100個(gè)個(gè)1

12、00個(gè)個(gè)100個(gè)個(gè)100個(gè)個(gè)第一代：出發(fā)菌株第一代：出發(fā)菌株分離到平皿上分離到平皿上打瓊脂塊挑菌落打瓊脂塊挑菌落1000-3000 塊塊挑取挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落選選3-5株（提供第二代誘變出發(fā)菌株）株（提供第二代誘變出發(fā)菌株）誘變誘變初篩初篩置于檢定板上置于檢定板上選選30-50個(gè)菌株個(gè)菌株復(fù)篩復(fù)篩簡(jiǎn)便篩選程序簡(jiǎn)便篩選程序第二代：出發(fā)菌株第二代：出發(fā)菌株4株株分離到平皿上分離到平皿上打瓊脂塊挑菌落打瓊脂塊挑菌落1000-3000 塊塊挑取挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落選選3-5株（提供第三代誘變出

13、發(fā)菌株）株（提供第三代誘變出發(fā)菌株）誘變誘變初篩初篩置于檢定板上置于檢定板上選選30-50個(gè)菌株個(gè)菌株復(fù)篩復(fù)篩青霉菌的選育青霉菌的選育2 U/ml 85000 U/ml 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘變方法和所用的誘變因子與普通誘變育種營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘變方法和所用的誘變因子與普通誘變育種基本相同，只是由于營(yíng)養(yǎng)缺陷型屬于單一基因突變，各種誘基本相同，只是由于營(yíng)養(yǎng)缺陷型屬于單一基因突變，各種誘變劑的功能不同，有的不宜作為營(yíng)養(yǎng)缺陷型誘變劑。變劑的功能不同，有的不宜作為營(yíng)養(yǎng)缺陷型誘變劑。第二節(jié)第二節(jié) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選 一、營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選一、營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選一般包括：一般包括

14、：誘發(fā)突變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型、鑒別誘發(fā)突變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型、鑒別缺陷種類缺陷種類等等4個(gè)步驟。個(gè)步驟。 （一）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘發(fā)（一）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘發(fā)常用的方法有抗生素法和菌絲過(guò)濾法。常用的方法有抗生素法和菌絲過(guò)濾法。（二）淘汰野生型菌株（二）淘汰野生型菌株1. 抗生素法抗生素法常用于細(xì)菌和酵母菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的富集，前者用青常用于細(xì)菌和酵母菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。霉素法，后者用制霉菌素法。青霉素法的原理為：青霉素法的原理為：細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分為肽聚糖類，細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分為肽聚糖類，而青霉素能抑制細(xì)胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完而

15、青霉素能抑制細(xì)胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完整的細(xì)胞壁。處在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程的細(xì)菌對(duì)青霉素十分敏感，整的細(xì)胞壁。處在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程的細(xì)菌對(duì)青霉素十分敏感，因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處于休止?fàn)顟B(tài)的細(xì)因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處于休止?fàn)顟B(tài)的細(xì)菌。菌。制霉菌素法原理：制霉菌素法原理：制霉菌素作用于真菌細(xì)胞膜上的甾醇，制霉菌素作用于真菌細(xì)胞膜上的甾醇，引起細(xì)胞膜的損傷，殺死生長(zhǎng)繁殖過(guò)程的真菌，起到富集引起細(xì)胞膜的損傷，殺死生長(zhǎng)繁殖過(guò)程的真菌，起到富集營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的作用。營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的作用。1. 誘變后的菌體用完全培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)誘變后的菌體用完全培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)2-3代，以結(jié)束表代，以結(jié)

16、束表型延遲現(xiàn)象型延遲現(xiàn)象2. 進(jìn)行離心、洗滌，轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基中進(jìn)行饑餓培養(yǎng)進(jìn)行離心、洗滌，轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基中進(jìn)行饑餓培養(yǎng)4-6h 3. 轉(zhuǎn)移到含無(wú)機(jī)氮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到含無(wú)機(jī)氮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4h，加入一定濃度的，加入一定濃度的青霉素青霉素4. 經(jīng)涂布培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)完全培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上菌落的經(jīng)涂布培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)完全培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上菌落的差數(shù)，確定產(chǎn)生最多缺陷型的青霉素溶度差數(shù)，確定產(chǎn)生最多缺陷型的青霉素溶度青霉素淘汰細(xì)菌野生型細(xì)菌的步驟：青霉素淘汰細(xì)菌野生型細(xì)菌的步驟： 2. 菌絲過(guò)濾法菌絲過(guò)濾法真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本培養(yǎng)基中能萌真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本

17、培養(yǎng)基中能萌發(fā)長(zhǎng)成菌絲，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā)。發(fā)長(zhǎng)成菌絲，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā)。把誘變處理后的孢子移入到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)把誘變處理后的孢子移入到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)10h左左右，使野生型孢子萌發(fā)的菌絲剛剛?cè)庋劭梢?jiàn)，用滅菌的脫右，使野生型孢子萌發(fā)的菌絲剛剛?cè)庋劭梢?jiàn)，用滅菌的脫脂棉、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔脂棉、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3-4h過(guò)過(guò)濾一次，重復(fù)濾一次，重復(fù)3-4次，最大限度地除去野生型細(xì)胞。然后稀次，最大限度地除去野生型細(xì)胞。然后稀釋，涂皿分離。釋，涂皿分離。3高溫差別殺菌法高溫差別殺菌法 利用芽孢菌類的芽孢和營(yíng)養(yǎng)體對(duì)熱敏感性的差

18、異。利用芽孢菌類的芽孢和營(yíng)養(yǎng)體對(duì)熱敏感性的差異。 在基本培養(yǎng)液中，野生型芽孢可以萌發(fā)，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型在基本培養(yǎng)液中，野生型芽孢可以萌發(fā)，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型芽孢不能萌發(fā)。此時(shí)將培養(yǎng)物加熱到芽孢不能萌發(fā)。此時(shí)將培養(yǎng)物加熱到80，維持一定時(shí)間，維持一定時(shí)間，野生型細(xì)胞大部分被殺死，缺陷型則得以保留，起到了濃野生型細(xì)胞大部分被殺死，缺陷型則得以保留，起到了濃縮作用?？s作用。1. 點(diǎn)植對(duì)照法點(diǎn)植對(duì)照法三、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出三、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出 CMMMCM2. 影印法影印法1. 防止菌落擴(kuò)散和蔓延防止菌落擴(kuò)散和蔓延可以在培養(yǎng)基中加入可以在培養(yǎng)基中加入0.5左右的脫氧膽酸鈉，或在基本左右的脫氧膽酸鈉，或在基本培養(yǎng)基

19、中用山梨糖作為碳源，再加入適量蔗糖使菌落長(zhǎng)得培養(yǎng)基中用山梨糖作為碳源，再加入適量蔗糖使菌落長(zhǎng)得小而緊密。小而緊密。2. 克服孢子擴(kuò)散而帶來(lái)不純現(xiàn)象克服孢子擴(kuò)散而帶來(lái)不純現(xiàn)象 在完全培養(yǎng)基上的菌落尚未形成孢子之前，用一張滅在完全培養(yǎng)基上的菌落尚未形成孢子之前，用一張滅菌的薄紙覆蓋瓊脂平板上，待菌落的菌絲長(zhǎng)到紙上后，把菌的薄紙覆蓋瓊脂平板上，待菌落的菌絲長(zhǎng)到紙上后，把紙轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基平板上。薄紙上的菌絲向基本培養(yǎng)基紙轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基平板上。薄紙上的菌絲向基本培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，便在相應(yīng)位置上長(zhǎng)出菌落。表面生長(zhǎng)，便在相應(yīng)位置上長(zhǎng)出菌落。采用影印法檢出霉菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型時(shí)，要注意兩點(diǎn)：采用影印法檢出霉菌營(yíng)養(yǎng)

20、缺陷型時(shí)，要注意兩點(diǎn)：3. 夾層法夾層法4. 限量補(bǔ)充培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法該法有兩種情況，如果試驗(yàn)的目的僅是檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型該法有兩種情況，如果試驗(yàn)的目的僅是檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，則其方法是將富集培養(yǎng)后的細(xì)胞接種到含有菌株，則其方法是將富集培養(yǎng)后的細(xì)胞接種到含有0.01蛋白胨的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，野生型細(xì)胞迅速地長(zhǎng)成蛋白胨的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，野生型細(xì)胞迅速地長(zhǎng)成大菌落，在平皿底部作好顏色標(biāo)記，而生長(zhǎng)緩慢的小菌落大菌落，在平皿底部作好顏色標(biāo)記，而生長(zhǎng)緩慢的小菌落可能是缺陷型，此稱可能是缺陷型，此稱限量培養(yǎng)限量培養(yǎng)。1. 鑒定方法鑒定方法營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定方法可分成兩大類：一種方法是在一營(yíng)養(yǎng)缺陷型

21、的鑒定方法可分成兩大類：一種方法是在一個(gè)子皿中加入一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以測(cè)定多株缺陷型菌株個(gè)子皿中加入一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以測(cè)定多株缺陷型菌株(10-50株株)對(duì)該生長(zhǎng)因子的需求情況。對(duì)該生長(zhǎng)因子的需求情況。第二種方法是在同一平皿上測(cè)定一種缺陷型菌株對(duì)許多第二種方法是在同一平皿上測(cè)定一種缺陷型菌株對(duì)許多種生長(zhǎng)因子的需求情況，稱為生長(zhǎng)譜法。種生長(zhǎng)因子的需求情況，稱為生長(zhǎng)譜法。 四、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定四、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定 2. 營(yíng)養(yǎng)缺陷型鑒定步驟：營(yíng)養(yǎng)缺陷型鑒定步驟： 測(cè)定缺陷型菌株所需生長(zhǎng)因子的類別測(cè)定缺陷型菌株所需生長(zhǎng)因子的類別 具體測(cè)缺陷該類別物質(zhì)中的哪種生長(zhǎng)因子具體測(cè)缺陷該類別物質(zhì)中的哪種生長(zhǎng)因子 用單一生

22、長(zhǎng)因子進(jìn)行復(fù)證試驗(yàn)。用單一生長(zhǎng)因子進(jìn)行復(fù)證試驗(yàn)。氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸類。氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸類。酵母浸出液，其中氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶均具有。酵母浸出液，其中氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶均具有。維生素混合物，代表維生素類。維生素混合物，代表維生素類。核酸堿基混合液或酵母核酸核酸堿基混合液或酵母核酸(0.1堿水解物堿水解物)，代表嘌呤、嘧啶類。，代表嘌呤、嘧啶類。通常分別用以下物質(zhì)來(lái)代表氨基酸、維生素、核酸堿基：通常分別用以下物質(zhì)來(lái)代表氨基酸、維生素、核酸堿基： (1)缺陷型類別的測(cè)定缺陷型類別的測(cè)定先選擇缺陷型菌株所需用的類別代表物質(zhì)：先選擇缺

23、陷型菌株所需用的類別代表物質(zhì)：用于營(yíng)養(yǎng)缺陷型測(cè)定的氨基酸有用于營(yíng)養(yǎng)缺陷型測(cè)定的氨基酸有 21種。一般用種。一般用L-型氨基酸，型氨基酸，而而DL-型氨基酸雖然也可以使用，但要增加型氨基酸雖然也可以使用，但要增加1倍的濃度。倍的濃度。D-型氨基酸由于微生物難以吸收利用，不能使用。型氨基酸由于微生物難以吸收利用，不能使用。用于鑒別缺陷型菌株的維生素約有用于鑒別缺陷型菌株的維生素約有15種。種。核酸堿基有核酸堿基有7種，包括腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、種，包括腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶。尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶。要鑒定單缺氨基酸或維生素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，較為簡(jiǎn)便的方

24、要鑒定單缺氨基酸或維生素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，較為簡(jiǎn)便的方法是分組測(cè)定法。把法是分組測(cè)定法。把21種氨基酸，組合種氨基酸，組合6組，每組，每6種不同氨種不同氨基酸歸為一組?；釟w為一組。(2) 缺陷型所需生長(zhǎng)因子的測(cè)定缺陷型所需生長(zhǎng)因子的測(cè)定 組別組別一一17891011二二2712131415三三3812161718四四4913161920五五51014171921六六61115182021組合生長(zhǎng)因子組合生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子的配制方法：生長(zhǎng)因子的配制方法：把同一組的氨基酸粉末混合置于潔凈的瓶中，加入滅菌的把同一組的氨基酸粉末混合置于潔凈的瓶中，加入滅菌的蒸餾水，充分溶解，置冰箱保存。蒸餾水，充分溶解，

25、置冰箱保存。配制濃度：配制濃度：用于放線菌測(cè)定的氨基酸約用于放線菌測(cè)定的氨基酸約1mgml 用于霉菌測(cè)定的約用于霉菌測(cè)定的約10mgml 維生素一般維生素一般0.1mgml 生物素、維生素生物素、維生素B12約約0.01mgml測(cè)定方法：測(cè)定方法：缺陷型菌株和基本培養(yǎng)基混合制成平板，把缺陷型菌株和基本培養(yǎng)基混合制成平板，把 6組組生長(zhǎng)因子直接點(diǎn)加于同一瓊脂平板上，或用濾紙片沾取后生長(zhǎng)因子直接點(diǎn)加于同一瓊脂平板上，或用濾紙片沾取后覆于瓊脂平板上，培養(yǎng)后，觀察哪一組或哪兩個(gè)組區(qū)產(chǎn)生覆于瓊脂平板上，培養(yǎng)后，觀察哪一組或哪兩個(gè)組區(qū)產(chǎn)生混濁生長(zhǎng)圈，即可確定該菌株缺陷的生長(zhǎng)因子?；鞚嵘L(zhǎng)圈，即可確定該菌株缺陷的生長(zhǎng)因子。 1. 生產(chǎn)上：微生物育種，協(xié)助解除代謝反饋調(diào)控機(jī)制，達(dá)到生產(chǎn)上：微生物育種，協(xié)助解除代謝反饋調(diào)控機(jī)制，達(dá)到大量積累終產(chǎn)物的目的大量積累終產(chǎn)物的目的 天冬氨酸天冬氨酸-半醛半醛 二氨基庚二酸二氨基庚二酸 賴氨酸賴氨酸 高絲氨酸高絲氨酸 甲硫氨酸甲硫氨酸 蘇氨酸蘇氨酸2. 作為雜交育種、重組育種的遺傳標(biāo)記作為雜交育種、重組育種的遺傳標(biāo)記3. 遺傳學(xué)研究中，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)