愈傷組織誘導(dǎo)及觀察

1、實(shí)驗(yàn)二 愈傷組織誘導(dǎo)及觀察一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^愈傷組織誘導(dǎo)的操作，使同學(xué)們了解進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)的一些關(guān)鍵操作技術(shù)和方法，如外植體的選擇、培養(yǎng)基母液配制、使用液配制、分裝滅菌、外植體表面消毒、接種、培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)原理和方法以及接種后污染率，愈傷組織誘導(dǎo)率的統(tǒng)計(jì)與觀察。使同學(xué)們能夠親身體會(huì)、了解激素對(duì)外植體的作用，還使同學(xué)們了解無菌培養(yǎng)的無菌操作，清楚植物體的帶菌部位等。二.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）、實(shí)驗(yàn)原理植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下，對(duì)離體植物組織（器官或細(xì)胞）分離并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生長，甚至分化發(fā)育成一完整的植株的一門實(shí)驗(yàn)技術(shù)。組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細(xì)胞的全能性，即植物體的每個(gè)細(xì)胞攜帶

2、著一套完整的基因組，因此具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。植物組織當(dāng)中原本已經(jīng)分化的細(xì)胞，一旦脫離原有的機(jī)體環(huán)境，成為離體狀態(tài)，在適宜的營養(yǎng)和外界條件下，就會(huì)表現(xiàn)出全能性，從已經(jīng)分化定型的細(xì)胞，脫分化，成為恢復(fù)分裂能力的細(xì)胞，并能重新生長發(fā)育成完整的植株。愈傷組織就是指一個(gè)離體的細(xì)胞、一塊組織或一個(gè)器官的細(xì)胞，通過脫分化不斷分裂、增生子細(xì)胞，這些細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明，逐漸形成了無序結(jié)構(gòu)的一團(tuán)細(xì)胞。在植物組織培養(yǎng)中，主要目標(biāo)是誘導(dǎo)愈傷組織形成和形態(tài)發(fā)生，使一個(gè)離體的細(xì)胞、一塊組織或一個(gè)器官的細(xì)胞，通過脫分化形成愈傷組織，并由愈傷組織再分化形成植物體。愈傷組織的形成 從一塊外植體形成典型

3、的愈傷組織，大致要經(jīng)歷三個(gè)時(shí)期：起動(dòng)期、分裂期和形成期。推薦精選起動(dòng)期是指細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。用于接種的外植體的細(xì)胞，通常都是成熟細(xì)胞，處在靜止?fàn)顟B(tài)。起動(dòng)期是通過一些刺激因素(如機(jī)械損傷、改變光照強(qiáng)度、增加氧等)和激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝活動(dòng)加強(qiáng)，迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的合成。機(jī)械損傷能誘導(dǎo)植物體細(xì)胞開始分裂，如傷口上會(huì)出現(xiàn)愈傷組織。在植物組織培養(yǎng)中沿用了愈傷組織這一名詞，但是植物組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)外植體細(xì)胞分裂形成的愈傷組織，大都不是損傷的結(jié)果。外源的生長素類物質(zhì)對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂效果很好，因此生長素類物質(zhì)在植物組織培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙

4、酸和細(xì)胞分裂素等。分裂期是指外植體細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)以后脫分化，不斷分裂、增生子細(xì)胞的過程。處于分裂期的愈傷組織的特點(diǎn)是：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明。外植體的脫分化因植物種類、器官來源及其生理狀況的不同而有很大差別。例如，煙草、胡蘿卜等植物的脫分化比較容易，禾本科植物的脫分化比較難；花的脫分化比較容易，莖、葉的脫分化比較難；幼嫩組織的脫分化比較容易，成熟的老組織脫分化比較難。分化期是指在分裂期的末期，細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)一系列形態(tài)和生理上的變化，從而使愈傷組織內(nèi)產(chǎn)生不同形態(tài)和功能的細(xì)胞。這些細(xì)胞類型有薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞、纖維細(xì)胞，等等。外植體的細(xì)胞經(jīng)過起動(dòng)、分裂和分化等一系列變化，形成了

5、無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織。如果在原來的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)愈傷組織，會(huì)由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)不足或有毒代謝物的積累，導(dǎo)致愈傷組織停止生長，甚至老化變黑、死亡。如果要讓愈傷組織繼續(xù)生長增殖，必須定期地(如24周)將它們分成小塊，接種到新鮮的培養(yǎng)基上，這樣愈傷組織就可以長期保持旺盛的生長。愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式 經(jīng)過起動(dòng)、分裂和分化期產(chǎn)生的愈傷組織，其中雖然發(fā)生了細(xì)胞分化，但是并沒有器官發(fā)生。只有滿足某些條件，愈傷組織的細(xì)胞才會(huì)發(fā)生再分化，產(chǎn)生芽和根，進(jìn)而發(fā)育成完整植株。愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式主要有不定芽方式和胚狀體方式兩種。不定芽方式是在某些條件下，愈傷組織中的分生細(xì)胞發(fā)生分化，形成不同的器官原基，再逐漸形成芽

6、和根。胚狀體方式是由愈傷組織細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具有胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株。這種由愈傷組織中的薄壁細(xì)胞不經(jīng)過有性生殖過程，直接產(chǎn)生類似于胚的結(jié)構(gòu)，叫做胚狀體。在植物組織培養(yǎng)中，不定芽方式和胚狀體方式是愈傷組織形態(tài)發(fā)生的兩種最常見和最重要的方式。胚狀體方式比不定芽方式有更多的優(yōu)點(diǎn)，如胚狀體產(chǎn)生的數(shù)量比不定芽多，胚狀體可以制成人工種子，等等。推薦精選（二）實(shí)驗(yàn)材料和用具1植物材料銀杏種子2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑1）儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、微波爐、人工氣候箱、電子天平、移液器、恒溫磁力攪拌器、酸度計(jì)、手術(shù)刀、手術(shù)剪、稱量紙、皮筋、封口膜、三角瓶、量筒、燒杯（1000ml）、試劑瓶（

7、1000ml、100ml）、長鑷子、記號(hào)筆（或標(biāo)簽紙）、培養(yǎng)皿、酒精燈等。2）試劑 75% 酒精、氯化汞、植物生長激素（NAA、BA1）、蔗糖、瓊脂粉、HCl、NaOH、WS母液配方見表1。（三）實(shí)驗(yàn)方法1 培養(yǎng)基配制1）. 培養(yǎng)基的選擇 植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用的培養(yǎng)基，一般由無機(jī)營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)劑和有機(jī)附加物等五類物質(zhì)組成。無機(jī)營養(yǎng)物包括大量元素和微量元素。大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等，微量元素：Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般為蔗糖。 維生素中只有硫胺素是必需的，而煙酸、維生素B6和肌醇對(duì)生長之起促進(jìn)作用。常用的生長調(diào)節(jié)劑有IAA （吲哚乙

8、酸）、IBA（吲哚-3-丁酸）、 NAA（萘乙酸）、NOA（萘氧乙酸）、 P-CPA（對(duì)氯苯氧乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）、2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）；BA P（芐氨基嘌呤）、6-BA（芐基腺嘌呤）、2-Zi（異戊烯氨基嘌呤）、 KT（激動(dòng)素推薦精選）等。有機(jī)附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促進(jìn)分化，但如培養(yǎng)基配方適當(dāng)，則大多數(shù)組織是不需要的。培養(yǎng)基的種類、成份直接影響到培養(yǎng)材料的生長發(fā)育，故應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)植物的種類和部位，選擇適宜的培養(yǎng)基。 2）. 培養(yǎng)基的配制 先按表1配制WS培養(yǎng)基貯液。再將貯液與其他成分按比例混合。加入3%的蔗糖作為碳源，起支持作用的瓊脂粉8 g/L，愈

9、傷組織培養(yǎng)基配方為WS培養(yǎng)基+NAA1 mg/L +BA1 mg/L。 將上述培養(yǎng)基加熱溶解后，加蒸餾水使培養(yǎng)基達(dá)到終體積。 再用0.1mol/L NaOH 或0.1mol/L HCl 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至56-5.8。 分裝至三角瓶內(nèi)，封口膜封口，等待滅菌后使用。2滅菌1）培養(yǎng)基及器具滅菌 培養(yǎng)基、無菌水需要在高壓滅菌鍋中滅菌。滅菌作用取決于溫度，常用的滅菌溫度為121，所需時(shí)間20分鐘，滅菌結(jié)束后待溫度下降到50以下，才能取出已滅菌的培養(yǎng)基。 可用同樣方法對(duì)器具同時(shí)進(jìn)行滅菌，包括：培養(yǎng)皿、解剖刀、剪子、濾紙、鑷子等。2）工作環(huán)境滅菌 接種前1打開超凈工作臺(tái)和棚面的紫外燈照射40min。殺菌

10、結(jié)束后，先關(guān)掉棚面的紫外燈，再打開風(fēng)機(jī)，最后關(guān)掉超凈工作臺(tái)上的紫外燈。在接種后休息時(shí)，要先打開臺(tái)面的紫外燈，再關(guān)風(fēng)機(jī)，最后打開棚面紫外燈。不能將風(fēng)機(jī)與臺(tái)面上的紫外燈同時(shí)關(guān)閉或先關(guān)閉風(fēng)機(jī)再開紫外燈。3） . 植物材料的滅菌 植株各部分的表面攜帶著各種微生物，他們是植物組培的污染源，所以在接種培養(yǎng)前必須進(jìn)行徹底的表面消毒；組織內(nèi)部侵染的真菌或細(xì)菌很難消除，這些組織一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用無菌潔凈濾紙吸干水分。推薦精選 植物材料的滅菌需在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，可選擇不同的滅菌劑進(jìn)行植物組織表面消毒。同時(shí)注意，表面消毒劑對(duì)植物組織也是有毒的。因此，應(yīng)當(dāng)選擇消毒劑的濃度和時(shí)間，

11、盡量減少組織的死亡。滅菌后，需用無菌水反復(fù)沖洗，徹底洗去表面消毒劑。如：銀杏種子消毒：將銀杏種子去外種皮。進(jìn)超凈工作臺(tái)后，在0.1%氯化汞中浸泡10分鐘，用無菌水沖洗3-5次，無菌濾紙吸干，在無菌濾紙上，用解剖刀取出種胚。準(zhǔn)備工作就緒后，可以進(jìn)行接種。3接種1）. 進(jìn)臺(tái) 工作人員進(jìn)入接種室前，需要洗凈手和手腕。進(jìn)入超凈工作臺(tái)內(nèi)需用75%酒精紗布擦拭手、手腕，再擦培養(yǎng)基瓶和超凈工作臺(tái)。2）. 接種(1) 剪、鑷消毒：接種前剪、鑷、解剖刀應(yīng)插入75%酒精瓶中，取出后置于酒精燈外焰上徹底灼燒，灼燒時(shí)應(yīng)將鑷口張開，燒至剪、鑷上火焰熄滅為止，冷卻后方可進(jìn)行接種。接種后仍需灼燒并插回75%酒精的磨口瓶待用

12、。注意每次取出時(shí)鑷子不可接觸瓶口和其它器皿。(2) 插植外植體：左手拿三角瓶，解開封口膜，將三角瓶幾乎水平拿著，靠近酒精燈焰，將瓶口外部在酒精燈火焰上燎數(shù)秒鐘，使瓶口的水氣散發(fā)掉。用右手拇指、食指、中指拿消毒過的鑷子夾一塊外植體（銀杏種胚）送入瓶內(nèi)輕輕的插入培養(yǎng)基上，再把封口膜在酒精燈火焰上燎數(shù)秒，灼燎時(shí)應(yīng)旋轉(zhuǎn)，避免燒壞，蓋好封口膜，扎緊皮筋，便完成了第一瓶的操作，接著再做第二瓶，如此直到外植體全部接完。3） 注意事項(xiàng)(1) 操作人員的頭、胳膊等不得進(jìn)入臺(tái)內(nèi)。(2) 操作人員不得隨意談話、說笑，以免造成污染。(3) 用酒精對(duì)雙手消毒時(shí)，務(wù)必待酒精徹底揮發(fā)后再靠近酒精燈火焰，以免火焰?zhèn)帧?4)

13、 臺(tái)外人員走動(dòng)要輕、動(dòng)作要小。 推薦精選4.培養(yǎng)接種后置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度232，適當(dāng)光照強(qiáng)度和光周期。10天計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率和污染率。培養(yǎng)過程如果有的培養(yǎng)物被微生物污染，應(yīng)當(dāng)馬上將其清理，以免影響其它培養(yǎng)物，并做好記錄。WS培養(yǎng)基MS 1：20*（20倍濃）g/LKNO3 ：38； NH4NO3：33MS2：100* g/LCaCl2.2H2O：44（CaCl2：33.2）W3：100* g/LMgSO47H2O：37；甘油磷酸鈉：27MS4：100* g/LH3BO3：0.62； MnS044H20：2.23 （MnS04H20：1.69）；ZnSO47H20：0.86MS5：1000* g/LNa2MoO42H20：0.2