8目的基因的克隆

1、基因克隆的一般流程基因的獲得基因的獲得pcrrt-pcr載體載體連接連接準(zhǔn)備感受態(tài)細(xì)胞準(zhǔn)備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化重組子篩選重組子篩選下游工作下游工作載體的選擇n基因工程載體一般要求：基因工程載體一般要求： 能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖，有較高的自主復(fù)制能力。 易進(jìn)入宿主細(xì)胞，進(jìn)入效率越高越好。 合適的多克隆位點(diǎn)（mcs）可接受外源片段，且不影響其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制。 易從宿主細(xì)胞中分離純化出來， 便于重組操作。 有篩選標(biāo)志，當(dāng)其進(jìn)入宿主細(xì)胞、或攜帶著外源序列進(jìn)入宿主細(xì)胞都能容易被辨認(rèn)和分離出來。便于克隆操作。n常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和病毒等常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和病毒等重組 dna 技術(shù)的

2、一般流程 目的目的dnadna的獲得的獲得 目的目的dnadna與載體的連接與載體的連接 重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞 重組子的篩選和鑒定重組子的篩選和鑒定實(shí)驗(yàn)一:pegfp-ngf質(zhì)粒載體的構(gòu)建nngf 基因的克隆(t-a克隆)ngf-sense: a gagctc aagatgctgtgcctcaagccagtngf-antisense: at gggccc gtctagatcc agagtgtctg5 56 6pegfp 熒光質(zhì)粒表達(dá)載體質(zhì)粒dna的酶切反應(yīng)結(jié)果質(zhì)粒質(zhì)粒 m m 酶切反應(yīng)酶切反應(yīng) m m 酶切反應(yīng)酶切反應(yīng)pegfp pt-ngf酶切產(chǎn)物凝膠回收操作步驟（gel e

3、xtraction kit）仔細(xì)切下含dna的凝膠，置一稱重的1.5ml離心管中。稱重。按300ls1溶液/100mg凝膠加入的比例加入s1溶液，置50水浴10分鐘，使凝膠完全溶化，每2分鐘顛倒混勻一次。將溶化后的凝膠溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g30秒，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱中加入500l w1溶液，9000g15秒，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一收集管中。重復(fù)一次洗柱。將吸附柱放入同一收集管中。9000g1分鐘。將吸附柱放入一新1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30lddh2o，靜置1分鐘，9000g1分鐘。備用。重組子的篩選n耐藥性基因

4、 外源質(zhì)粒賦予宿主抗生素抗性n藍(lán)白斑篩選（互補(bǔ)現(xiàn)象） lacz plasmid 和 m15 cell strain 關(guān)于連接酶定義：定義：atp存在下，在存在下，在3oh和和5 p之間形成磷酸二酯鍵。之間形成磷酸二酯鍵。特性：連接粘端的效率遠(yuǎn)高于平端。特性：連接粘端的效率遠(yuǎn)高于平端。策略：策略：1.首選不匹配粘端首選不匹配粘端2.次選匹配粘端，載體脫磷次選匹配粘端，載體脫磷3.平端連接，延長(zhǎng)時(shí)間，提高酶量平端連接，延長(zhǎng)時(shí)間，提高酶量平端連接圖示匹配粘端連接圖示 不匹配粘端連接圖示連接反應(yīng)的建立 連接反應(yīng)的溫度：連接反應(yīng)的溫度：v 粘性末端，按a-t，g-c含量計(jì)算，5。v 如 pst i（ct

5、gcag，12 ），ecori（gaattc，8）。v 平末端，如ecor（gatatc），可在室溫進(jìn)行，不超過30，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍 。 dna量：量：v 摩爾數(shù)之比 載體:目的 dna 1 : ( 13 ) 載體摩爾數(shù) 目標(biāo)基因片段堿基數(shù)載體重量 目標(biāo)dna摩爾數(shù) 目標(biāo)基因片段重量載體堿基數(shù) 載體和目標(biāo)基因的連接反應(yīng) 如未定量可以按回收效率75計(jì)算dna濃度，按載體與目的基因摩爾數(shù)比1:3進(jìn)行連接。 連接反應(yīng)在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。15 l體積反應(yīng)體系中： 加ddh2o使終體積為 15 l liner vector 50-100 ng target gene fragment 15- 30 ng 10ligase buffer (已含有atp) 1.5 l t4 dna ligase 1.o l 輕輕混勻，稍加離心, 14-16或4,o/n 。重組子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 體外重組的體外重組的dnadna引入受體細(xì)胞引入受體細(xì)胞 感受態(tài)感受態(tài): :受體細(xì)胞處于易于接受外源受體細(xì)胞處于易于接受外源 dna dna 的狀態(tài)的狀態(tài) 原理原理: :（1 1）遺傳物質(zhì)的傳遞）遺傳物質(zhì)的傳遞 （2 2）受體菌的選擇與改造）受體菌的選擇與改造重組質(zhì)粒的酶切鑒定重組子的鑒定n插