酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn)

1、第二章第二章 酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn)酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn) 提取分離法提取分離法 微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 酶的生產(chǎn)方法酶的生產(chǎn)方法 生物合成法生物合成法 植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 化學(xué)合成法化學(xué)合成法 動物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶動物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 第一節(jié)第一節(jié) 酶生物合成及調(diào)節(jié)酶生物合成及調(diào)節(jié)一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遺傳信息傳遞的中心法則遺傳信息傳遞的中心法則轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄傳傳遞遞給給rna，再再由由rna 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制dnarna （一）（一）rnarna的生物合成的生物合成-轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(transcription)(transcrip

2、tion) 定義定義 以以dnadna為模板，以核苷三磷酸為底物，在為模板，以核苷三磷酸為底物，在rnarna聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成rnarna分子分子的過程。的過程。. .轉(zhuǎn)錄模板轉(zhuǎn)錄模板啟動子（啟動子（promotor) 終止子終止子(terminator)模板鏈（模板鏈（template strand）反意義鏈反意義鏈(antisense strand)編碼鏈編碼鏈 (coding strand)有意義鏈有意義鏈(sense strand)5 5 3 3 反意義鏈反意義鏈: :指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用的一條指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用的一條dnadna鏈鏈有意義鏈有意義鏈: :

3、無轉(zhuǎn)錄功能的一條無轉(zhuǎn)錄功能的一條dnadna鏈鏈. .t c g a g t a ca g c t c a t gc g a g u a cg c a urna聚合酶聚合酶有意義鏈有意義鏈反意義鏈反意義鏈rnappi555533gtputpctpatputprna在在dna模板上的生物合成模板上的生物合成333355rna的轉(zhuǎn)錄過程的轉(zhuǎn)錄過程( (三步三步) )1.1.起始起始2.2.延長延長3.3.終止終止 原核生物的原核生物的rna聚合酶聚合酶(ddrp)e. colie. coli的的rnarna聚合酶是由四種亞基組成的五聚體聚合酶是由四種亞基組成的五聚體（ 2 2 ）核心酶（core

4、enzyme）全酶（holoenzyme）起始因子rnarna合成過程合成過程起始起始雙鏈雙鏈dna局部解開局部解開磷酸二酯磷酸二酯鍵形成鍵形成終止階段終止階段解鏈區(qū)到達(dá)解鏈區(qū)到達(dá)基因終點基因終點延長階段延長階段5 3 rna 啟動子（啟動子（promotor) 終止子終止子(terminator)5 rna聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 離開離開rna鏈的延伸圖解鏈的延伸圖解3 5 rna-dna雜交螺旋雜交螺旋聚合酶的移動方向聚合酶的移動方向新生新生rna復(fù)鏈復(fù)鏈解鏈解鏈有義鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）模板鏈（反義鏈）延長部位延長部位 定義定義 以以mrnamrna為模板，以氨基酸為

5、底物，在核糖為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種體上通過各種trnatrna、酶和輔助因子的作用，合、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程。成多肽鏈的過程。（二）蛋白質(zhì)的生物合成（二）蛋白質(zhì)的生物合成-翻譯翻譯(translation)(translation) 酪酪555533augguu uac aca酪氨酰酪氨酰- trna反密碼反密碼mrna密碼與反密碼的堿基配對密碼與反密碼的堿基配對aug aca55蛋蛋蘇蘇uguguu33受受 位位(a位位)給給 位位(p位位)大亞基大亞基小亞基小亞基 蛋白質(zhì)的合成過程蛋白質(zhì)的合成過程 （大腸桿菌）大腸桿菌）v 氨基酸的活化氨基酸的活化v 肽

6、鏈合成的起始肽鏈合成的起始v 肽鏈的延伸肽鏈的延伸v 肽鏈合成的終止與釋放肽鏈合成的終止與釋放氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運反應(yīng)式：反應(yīng)式：aa + trna + atpaa + trna + atp氨酰氨酰-trna-trna合成酶合成酶氨酰氨酰-trna-trna+amp+ppi +amp+ppi 對于對于e.colie.coli而言，肽鏈合成時的第一而言，肽鏈合成時的第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fmetfmet）。）。在核糖體上合成多肽（三階段）在核糖體上合成多肽（三階段）1 1、起始階段、起始階段2 2、延伸階段、延伸階段3 3、終止階段、終止階段肽鏈

7、合成的起始階段肽鏈合成的起始階段1.1.mrnamrna與小亞基結(jié)合：與小亞基結(jié)合：形成形成30s-mrna-if30s-mrna-if3 3復(fù)合物復(fù)合物2.2.augaug與蛋氨酰與蛋氨酰- -trnatrna結(jié)合：結(jié)合： 30s-mrna-if30s-mrna-if3 3 fmet-trna-iffmet-trna-if2 2-gtp-gtp fmet-trna fmet-trna正好位于正好位于mrnamrna的起始密碼子上（的起始密碼子上（augaug）。）。3.3.大小亞基結(jié)合大小亞基結(jié)合if130s30s起始復(fù)合物起始復(fù)合物aug aca5533aug aca5533uacuaca

8、ug aca5533小亞基小亞基mrna蛋氨酰蛋氨酰trna gtp大亞基大亞基gdp+pi受位受位給位給位蛋蛋蛋蛋肽鏈合成的起始階段肽鏈合成的起始階段肽鏈合成的延伸階段肽鏈合成的延伸階段1.1.進(jìn)位進(jìn)位: :氨基酰氨基酰-trna-trna進(jìn)入受位進(jìn)入受位; ;2.2.轉(zhuǎn)肽轉(zhuǎn)肽: :形成肽鍵形成肽鍵, ,在轉(zhuǎn)肽酶作用下在轉(zhuǎn)肽酶作用下, ,給位與給位與 受位結(jié)合受位結(jié)合; ;3.3.移位移位: :核蛋白體向核蛋白體向33端移動一個密碼子的端移動一個密碼子的 位置位置, ,空出受位空出受位, ,不斷地進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、不斷地進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、 移位移位, ,使肽鏈延長。使肽鏈延長。aug aca5533ua

9、c蛋蛋蘇蘇uguaug aca55uac蛋蛋蘇蘇uguguuaug aca55uac蛋蛋蘇蘇uguguuaug aca55蛋蛋蘇蘇uguguu333333gtp gdp+pigdp+pigtp起始復(fù)合體起始復(fù)合體進(jìn)位進(jìn)位轉(zhuǎn)肽轉(zhuǎn)肽移位移位mg+k+肽鏈合成的終止階段肽鏈合成的終止階段1.1.出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合; ;2.2.肽鍵水解肽鍵水解, ,多肽釋放多肽釋放; ;3.3.trna,mrnatrna,mrna, ,大小亞基解離大小亞基解離. . aug uaa55uacaug uaa55uac3333終終終終aug uaa55uac33終終5533uac終終

10、肽鏈肽鏈二、酶生物合成的調(diào)節(jié)二、酶生物合成的調(diào)節(jié)定義：定義：通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。進(jìn)行的。意義：意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。 操縱子基因表達(dá)的協(xié)同單位操縱子操縱子結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì)（編碼蛋白質(zhì), structural gene, s）控制部位控制部位操縱基因（操縱基因（operator gene, o）啟動子（啟動子（promotor gene, p）jacob and monod的的基因操

11、縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因 啟動基因啟動基因 操縱基因操縱基因 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 dna 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 （-） rna聚合酶聚合酶 （+） 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 mrna 翻譯翻譯 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑 控制區(qū)控制區(qū) 信息區(qū)信息區(qū)操縱子操縱子 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因(regulator gene)(regulator gene)： 可產(chǎn)生一種組成型可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白(regulatory (regulatory protein)protein) （一種（一種變構(gòu)蛋白變構(gòu)蛋白），通過與效應(yīng)，通過與效應(yīng)物物(effector) (effe

12、ctor) （包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）（包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。操縱基因的結(jié)合力。 調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。rposd n ac rp-ca m p復(fù) 合 物c rp+ca m p camp-crp復(fù)合物的作用示意圖 啟動基因（啟動基因（promotor genepromotor gene）（啟動子）：）（啟動子）： 有兩個位點：有兩個位點： （1 1）rnarna聚合酶的結(jié)合位點聚合酶的結(jié)合位點（2 2）camp-capcamp-cap的結(jié)合位點。的結(jié)合位點。capcap

13、：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolite gene catabolite gene activator proteinactivator protein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(camp (camp receptor proteinreceptor protein，crpcrp）。）。 只有只有camp-crpcamp-crp復(fù)合物結(jié)合到啟動子的位點上，復(fù)合物結(jié)合到啟動子的位點上，rnarna聚合酶才能結(jié)合到其在啟動子的位點上，酶的合成才聚合酶才能結(jié)合到其在啟動子的位點上，酶的合成才能開始。能開始。 操縱基因（操縱基因（operate

14、r geneoperater gene）: : 位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時機(jī)與速度。蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時機(jī)與速度。結(jié)構(gòu)基因（結(jié)構(gòu)基因（structural genestructural gene）: : 決定某一多肽的決定某一多肽的dnadna模板，與酶有各自模板，與酶有各自的對應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為的對應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mrnamrna，再翻譯為蛋白質(zhì)。再翻譯為蛋白質(zhì)。( (二二) ) 酶合成調(diào)節(jié)的類型酶合成調(diào)節(jié)的類型 1.1.

15、誘導(dǎo)誘導(dǎo) (induction)(induction) 組成酶：細(xì)胞固有的酶類。組成酶：細(xì)胞固有的酶類。 誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似 物而臨時合成的一類酶。物而臨時合成的一類酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) (repression) 分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏(catabolite repression)(catabolite repression) 反饋阻遏反饋阻遏(feedback repression)(feedback repression) 酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象：酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利

16、用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； -半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實驗：實驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細(xì)胞）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成；內(nèi)無上述三種酶合成； （2）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時，細(xì)胞內(nèi)有）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；上述三種酶合成； （3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：）表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時才合成需要時才合成。調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結(jié)構(gòu)基因乳糖結(jié)構(gòu)基因placzlacylacamrna 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因

17、 關(guān)關(guān) 閉閉啟啟動動子子orplaczlacylaca調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結(jié)構(gòu)基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟啟動動子子ormrnazmrnaymrnaa 阻遏蛋白阻遏蛋白（無活性）（無活性） 基基 因因 表表達(dá)達(dá)mrnaa、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)b、乳糖酶的誘導(dǎo)、乳糖酶的誘導(dǎo) 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）誘導(dǎo)誘導(dǎo) 2. 2.末端產(chǎn)物阻遏末端產(chǎn)物阻遏 由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。 酶合成阻遏的現(xiàn)象：酶合成阻遏的現(xiàn)象： 實驗：實驗： （1）大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時，）大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖

18、的培養(yǎng)基上時， 檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長的經(jīng)濟(jì)原則體現(xiàn)了菌體生長的經(jīng)濟(jì)原則:不需要就不合成不需要就不合成。 色氨酸操縱子色氨酸操縱子酶的阻遏酶的阻遏調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因mrnamrna酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表

19、達(dá)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基基因不能表達(dá)因不能表達(dá)酶酶的的誘誘導(dǎo)導(dǎo)和和阻阻遏遏操操縱縱子子模模型型b.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑a.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白c.無活性阻遏蛋白無活性阻遏蛋白d.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因操縱基因啟動基因啟動基因調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)

20、誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白酶蛋白mrna阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合, 結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白阻遏蛋白(無活性無活性)酶蛋白酶蛋白mrna代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物調(diào)控方式 阻遏蛋白 添加物 與操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng)舉例酶的誘導(dǎo)有活性不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘導(dǎo)物轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活

21、性阻遏物不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比3.3.分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏n指細(xì)胞內(nèi)同時有兩種分解底物（碳源或氮指細(xì)胞內(nèi)同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。n分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝

22、物所引起的阻遏作用。產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏現(xiàn)象：分解代謝物阻遏現(xiàn)象： 實驗：實驗：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期的生了兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期的“二二次生長現(xiàn)象次生長現(xiàn)象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。02468020406080 細(xì)胞 濃 度(od)時 間(h) 這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，這一現(xiàn)象又稱葡萄

23、糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（受體蛋白（crpcrp）, ,亦稱亦稱降解物降解物基因活化蛋白（基因活化蛋白（capcap）。）。分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏rlaczlacylacamrnamrnazmrnaymrnaa基基 因因 表表達(dá)達(dá)cap基因基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因tcapocap結(jié)結(jié)合部位合部位 rna聚合酶聚合酶tcamp -capp葡萄糖葡萄糖分解代分解代謝產(chǎn)物謝產(chǎn)物腺苷酸腺苷酸環(huán)化酶環(huán)化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶atpcamp5-amp抑制

24、抑制激活激活葡萄糖降解物與葡萄糖降解物與camp的關(guān)系的關(guān)系campcap：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）降低降低camp濃度濃度使使cap呈失活狀態(tài)呈失活狀態(tài)三、提高酶產(chǎn)量的策略三、提高酶產(chǎn)量的策略（一）菌種選育（一勞永逸）（一）菌種選育（一勞永逸） 1.1.誘變育種誘變育種 (1) 使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型選育組成型突變株選育組成型突變株(2)(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜褪棺瓒粜妥優(yōu)槿プ瓒粜?選育營養(yǎng)缺陷型突變株選育營養(yǎng)缺陷型突變株解除反饋阻遏解除反饋阻遏 選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突

25、變株解除分解代謝物阻遏解除分解代謝物阻遏選育抗分解代謝阻遏突變株選育抗分解代謝阻遏突變株 2. 基因工程育種基因工程育種 （二）條件控制（二）條件控制1. 1. 添加誘導(dǎo)物添加誘導(dǎo)物 酶的底物類似物最有效。酶的底物類似物最有效。2. 2. 降低阻遏物濃度降低阻遏物濃度 除去終產(chǎn)物除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏產(chǎn)物阻遏 添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑 避免使用葡萄糖避免使用葡萄糖分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏 避免培養(yǎng)基過于豐富避免培養(yǎng)基過于豐富 添加一定量的添加一定量的campcamp3.3.添加表面活性劑添加表面活性劑 離子型離子型 對細(xì)胞有毒害作用對細(xì)胞有毒害作用表面活性劑表面活性劑

26、tweentween8080 非離子型非離子型 增加細(xì)胞通透性增加細(xì)胞通透性 tritonxtritonx1001004. 4. 添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑 第二節(jié)第二節(jié) 酶發(fā)酵動力學(xué)酶發(fā)酵動力學(xué) 一、細(xì)胞生長動力學(xué)一、細(xì)胞生長動力學(xué) 在分批培養(yǎng)在分批培養(yǎng)(batch culture)(batch culture)過程中，細(xì)胞過程中，細(xì)胞生長一般要經(jīng)歷延遲期、指數(shù)生長期、減速期、生長一般要經(jīng)歷延遲期、指數(shù)生長期、減速期、靜止期和衰亡期靜止期和衰亡期5 5個階段。個階段。 edcbao細(xì) 胞濃度 (g/l)培 養(yǎng) 時 間 (h ) 細(xì)胞生長曲線細(xì)胞生長曲線 o-a 延遲期延遲期 a-b指數(shù)生長

27、期指數(shù)生長期 b-c減速期減速期 c-d 靜止期靜止期 d-e 衰亡期衰亡期 營養(yǎng)物濃度（生長限制基質(zhì)濃度）和生長速率營養(yǎng)物濃度（生長限制基質(zhì)濃度）和生長速率之間的動力學(xué)關(guān)系：之間的動力學(xué)關(guān)系：monodmonod模型模型n:比生長速率（比生長速率（1/h） （specific growth rate）nmax：最大比生長速率（：最大比生長速率（1/h）ns：營養(yǎng)物濃度（生長限制基質(zhì)濃度）：營養(yǎng)物濃度（生長限制基質(zhì)濃度） 克克/lnks：莫諾德常數(shù)或莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營養(yǎng)物利用常數(shù)飽和常數(shù)或營養(yǎng)物利用常數(shù) 克克/l，或或 mol/lsksxdtdxsm1 二、產(chǎn)酶動力學(xué)二、產(chǎn)酶動力學(xué) （一

28、）（一） 酶生物合成的模式酶生物合成的模式 根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長之間的關(guān)系，可將酶根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為的生物合成分為3 3種模式，即：種模式，即： 同步合成型同步合成型 生長偶聯(lián)型生長偶聯(lián)型 中期合成型中期合成型 部分生長偶聯(lián)型部分生長偶聯(lián)型延續(xù)合成型延續(xù)合成型 非生長偶聯(lián)型非生長偶聯(lián)型 滯后合成型滯后合成型1. 1. 生長偶聯(lián)型（又稱同步合成型）生長偶聯(lián)型（又稱同步合成型） 酶的生物合成與細(xì)胞生長同步。酶的生物合成與細(xì)胞生長同步。特點：特點：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。 當(dāng)去除

29、誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對應(yīng)的立即停止，表明這類酶所對應(yīng)的mrnamrna很不穩(wěn)定。很不穩(wěn)定。a 酶細(xì) 胞細(xì)胞 或酶濃 度時間生長偶聯(lián)型中的特殊形式生長偶聯(lián)型中的特殊形式中期合成型中期合成型 酶的合成在細(xì)胞生長一段時間后才開始，而在細(xì)酶的合成在細(xì)胞生長一段時間后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點：特點：酶的合成受產(chǎn)物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏。酶的合成受產(chǎn)物的反饋阻遏或分解代謝物阻遏。 所對應(yīng)的所對應(yīng)的mrnamrna是不穩(wěn)定的。是不穩(wěn)定的。02468100

30、.00.10.20.30.40.5 細(xì) 胞濃度 酶 濃度細(xì)胞 濃 度 (od500)酶濃 度(u/ml)時間 (h) 枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線 2.2.部分生長偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型）部分生長偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型） 酶的合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)酶的合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時間。入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長一段時間。特點：特點：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏?？墒苷T導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。 所對應(yīng)的所對應(yīng)的mrnamrna相當(dāng)穩(wěn)定。相當(dāng)穩(wěn)定。b酶細(xì)胞 細(xì)胞 或酶濃 度時 間0408

31、01200204060 細(xì) 胞濃度 酶濃度酶濃度 (單位/ml)時 間 (h)0.012.525.037.550.0細(xì) 胞濃度 (g/l) 黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線3. 3. 非生長偶聯(lián)型（又稱滯后合成型）非生長偶聯(lián)型（又稱滯后合成型） 只有當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶才開始合成只有當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點特點：受分解代謝物的阻遏作用。：受分解代謝物的阻遏作用。 所對應(yīng)的所對應(yīng)的mrnamrna穩(wěn)定性高。穩(wěn)定性高。c酶細(xì)胞細(xì)胞 或酶濃 度時 間0204

32、0608001020304050 酶濃 度 細(xì)胞 濃 度細(xì)胞 濃 度 (g/l)時 間 (h)01020304050酶濃 度 (u) 黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線 總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素 高：可在細(xì)胞停止生長后繼 1）mrna的穩(wěn)定性 續(xù)合成酶 差：隨著細(xì)胞停止生長而終 止酶的合成 2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在 不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長而開始酶的合成。 受阻遏：細(xì)胞生長一段時間或平衡期后，酶才開始 合成。 酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開始生長

33、就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長進(jìn)差別。細(xì)胞開始生長就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時間。入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時間。 對于：對于：同步合成型：同步合成型：提高對應(yīng)的提高對應(yīng)的mrnamrna的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵 溫度溫度 。滯后合成型：滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使 酶的合成提早開始。酶的合成提早開始。中期合成型：中期合成型：要在提高要在提高mrnamrna穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方 面努力面努力。( (二二) ) 產(chǎn)酶動力學(xué)產(chǎn)酶動力學(xué)一般產(chǎn)酶動力學(xué)方程可表達(dá)為：一般產(chǎn)酶動

34、力學(xué)方程可表達(dá)為：xdtde式中式中 x x細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度(g /l)(g /l) 細(xì)胞比生長速率細(xì)胞比生長速率(h(h-1-1) ) 生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(iu/g)(iu/g) 非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(iu/(g(iu/(g h)h) e e酶濃度酶濃度(iu/l)(iu/l) t t時間時間(h)(h)生長偶聯(lián)型生長偶聯(lián)型xdtde部分生長偶聯(lián)型部分生長偶聯(lián)型 xxdtde非生長偶聯(lián)型非生長偶聯(lián)型 xdtde 第三節(jié)第三節(jié) 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶 一、產(chǎn)酶微生物的分離和選育一、產(chǎn)酶微生物的分離和選育 1.1.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的條件優(yōu)良產(chǎn)

35、酶菌種應(yīng)具備的條件 （1 1）酶產(chǎn)量高）酶產(chǎn)量高 （2 2）易培養(yǎng)（生長速率高、營養(yǎng)要求低）易培養(yǎng)（生長速率高、營養(yǎng)要求低） （3 3）遺傳性能穩(wěn)定，不易退化）遺傳性能穩(wěn)定，不易退化 （4 4）易分離提純）易分離提純 （5 5）安全可靠（不是致病菌）安全可靠（不是致病菌）2.2.常用的產(chǎn)酶微生物常用的產(chǎn)酶微生物escherichia coli pseudomonas bacillus subtilis micrococcus streptococcus streptomycesaspergillus nigeraspergillus oryzaemonascuspenicilliumtrich

36、oderma rhizopus mucor absidia saccharomyces cerevisiae candida 3. 3. 產(chǎn)酶微生物的分離和篩選產(chǎn)酶微生物的分離和篩選 1)1)樣品的采集樣品的采集: :從富含該酶作用底物的場所采集樣品從富含該酶作用底物的場所采集樣品 2)2)富集培養(yǎng)富集培養(yǎng): : 投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗 3)3)分離獲得微生物的純培養(yǎng)（分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pure culturepure culture）。）。 4)4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。 5)5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質(zhì)為主。復(fù)篩：選出

37、產(chǎn)酶水平相對較高的菌株，以質(zhì)為主。 - -淀粉酶的篩選淀粉酶的篩選蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基基4.4.產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育 誘變育種誘變育種 原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合育種 基因工程育種基因工程育種 二二. .微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方法微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方法 1.1.固體培養(yǎng)固體培養(yǎng): :特別適合于霉菌培養(yǎng)特別適合于霉菌培養(yǎng) 2.2.液體培養(yǎng)液體培養(yǎng): :目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式 3.3.固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞 : :需要特殊的固定化細(xì)胞反應(yīng)器需要特殊的固定化細(xì)胞反應(yīng)器 三三. .微生物酶的類型微生

38、物酶的類型 1.1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環(huán)境中的纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環(huán)境中的大分子而釋放到細(xì)胞外的，即使胞外濃度很高，胞大分子而釋放到細(xì)胞外的，即使胞外濃度很高，胞內(nèi)也能維持較低水平，受到的調(diào)節(jié)控制少。內(nèi)也能維持較低水平，受到的調(diào)節(jié)控制少。 2.2.胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶，胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶，酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調(diào)控。酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調(diào)控。試管菌種培養(yǎng)茄瓶菌種培養(yǎng)搖瓶菌種培養(yǎng)孢子（菌體）懸液制備種子罐菌種培養(yǎng)發(fā)

39、酵罐發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理酶的分離純化精制酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程 第四節(jié)第四節(jié) 動、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 與微生物細(xì)胞相比，動物細(xì)胞與微生物細(xì)胞相比，動物細(xì)胞和植物細(xì)胞具有各自不同的特性，和植物細(xì)胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。 動物細(xì)胞模式圖植物細(xì)胞結(jié)構(gòu) 植物、動物、微生物細(xì)胞的特性比較植物、動物、微生物細(xì)胞的特性比較細(xì)胞種類細(xì)胞種類植物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞動物細(xì)胞動物細(xì)胞細(xì)胞大小細(xì)胞大小/um20030011010100倍增時間倍增時間/h120.3-615營養(yǎng)要求營養(yǎng)要求簡單簡單簡單簡單復(fù)雜復(fù)雜光照

40、要求光照要求大多數(shù)要求大多數(shù)要求不要求不要求不要求不要求對剪切力對剪切力敏感敏感大多數(shù)不敏感大多數(shù)不敏感非常敏感非常敏感主要產(chǎn)物主要產(chǎn)物色素、藥物、色素、藥物、香精、酶等香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫苗、激素、疫苗、激素、單克隆抗體、單克隆抗體、酶等酶等三者之間的差異主要有：三者之間的差異主要有：植物細(xì)胞植物細(xì)胞 動物細(xì)胞動物細(xì)胞 微生物細(xì)胞。微生物細(xì)胞。動物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長。動物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營養(yǎng)要求較簡單。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營養(yǎng)要求較簡單。植物細(xì)胞的生長以及次級代

41、謝物的生產(chǎn)要求一定的植物細(xì)胞的生長以及次級代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。光照。植物細(xì)胞和動物細(xì)胞對剪切力敏感。植物細(xì)胞和動物細(xì)胞對剪切力敏感。植物、微生物和動物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。植物、微生物和動物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。一、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶一、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 1.1.植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點 2.2.培養(yǎng)基特點培養(yǎng)基特點 應(yīng)用最廣的是應(yīng)用最廣的是msms培養(yǎng)基和培養(yǎng)基和lsls培養(yǎng)基培養(yǎng)基 msms培養(yǎng)基是培養(yǎng)基是19621962年由年由murashingemurashinge和和skoogskoog為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計的培養(yǎng)基。為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計的培養(yǎng)基。lsls

42、培養(yǎng)基是培養(yǎng)基是在其基礎(chǔ)上演變而來的。在其基礎(chǔ)上演變而來的。3.3.培養(yǎng)方法：培養(yǎng)方法：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞株的建立；外植體與愈傷組織細(xì)胞株的建立；外植體與愈傷組織擴(kuò)大培養(yǎng)；擴(kuò)大培養(yǎng)；大罐培養(yǎng)；大罐培養(yǎng)；外植體：外植體： 從植株取出，經(jīng)過預(yù)處理后，用于植物組從植株取出，經(jīng)過預(yù)處理后，用于植物組織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實、種子等）的片段或小塊。果實、種子等）的片段或小塊。愈傷組織：愈傷組織： 將上述外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于將上述外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于2525左右培養(yǎng)一段時間，從外植體的切口部位長出左右培養(yǎng)一段時間，從外植

43、體的切口部位長出小細(xì)胞團(tuán)。小細(xì)胞團(tuán)。水稻的外植體（幼水稻的外植體（幼胚）和愈傷組織胚）和愈傷組織外植體外植體愈傷組織愈傷組織4. 4. 培養(yǎng)條件的影響與控制培養(yǎng)條件的影響與控制（1 1）溫度）溫度（2 2）phph（3 3）通氣與攪拌）通氣與攪拌（4 4）光照的控制）光照的控制（5 5）前體的添加（飼喂）前體的添加（飼喂）（6 6）誘導(dǎo)子（）誘導(dǎo)子（elicitorselicitors）的應(yīng)用）的應(yīng)用5.5.植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實例植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實例 以大蒜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（以大蒜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（sodsod）為例）為例(1)(1)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo) 選取結(jié)實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，選取結(jié)實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用去除外皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升升汞消毒汞消毒10min10min，然后無菌水漂洗，然后無菌水漂洗3 3次。次。 在無菌條件下，切成在無菌條件下，切成0.5cm0.5cm3 3的小塊，植入的小塊，植入含有含有3mg/l 2,4-d3mg/l 2,4-d和和1.2mg/l 6-ba 1.2mg/l 6-ba 的半固體的半固體ms