第六章外源目的基因表達與調控

1、第六章第六章 外源目的基因表達與調控外源目的基因表達與調控 生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編碼的形式儲存在遺傳物質碼的形式儲存在遺傳物質dna上上, 基因表達基因表達是目的基因是目的基因dna在導入的細胞內轉錄成在導入的細胞內轉錄成mrna, 再以再以mrna指導翻譯成蛋白質。基指導翻譯成蛋白質?；虻谋磉_依賴于有效的轉錄和因的表達依賴于有效的轉錄和mrna的正的正確翻譯以及翻譯后的加工處理等各個環(huán)節(jié)確翻譯以及翻譯后的加工處理等各個環(huán)節(jié)的調節(jié)作用，其中轉錄最為關鍵，原核的的調節(jié)作用，其中轉錄最為關鍵，原核的基因表達過程和方式與真核細胞有顯著不基因表達過程和方

2、式與真核細胞有顯著不同。同。 外源基因在受體細胞中的表達包括轉錄和翻譯外源基因在受體細胞中的表達包括轉錄和翻譯兩個重要環(huán)節(jié)。兩個重要環(huán)節(jié)。 基因的轉錄是在基因的轉錄是在rna聚合酶的作用下合成聚合酶的作用下合成mrna，原核生物，原核生物mrna一般不需要轉錄后加工。一般不需要轉錄后加工。 真核生物真核生物mrna在細胞內合成，且需要經(jīng)過一在細胞內合成，且需要經(jīng)過一繁殖加工過程：繁殖加工過程：rna剪接、剪接、5端加帽、端加帽、 3端加上端加上poly(a)尾巴。尾巴。 原核生物一般沒有翻譯后加工，真核生物有較原核生物一般沒有翻譯后加工，真核生物有較復雜的翻譯后加工。復雜的翻譯后加工。第一節(jié)第

3、一節(jié) 外源基因表達機制外源基因表達機制一、外源基因的起始轉錄一、外源基因的起始轉錄 外源基因的起始轉錄是基因表達的關鍵步驟。外源基因的起始轉錄是基因表達的關鍵步驟。選擇可調控的啟動子和相關的調控序列，是構建選擇可調控的啟動子和相關的調控序列，是構建一個表達系統(tǒng)首先要考慮的問題。一個表達系統(tǒng)首先要考慮的問題。 理想的可調控的啟動子在細胞生長的初期不理想的可調控的啟動子在細胞生長的初期不表達或低水平表達，當細胞增殖達到一定的密度表達或低水平表達，當細胞增殖達到一定的密度后，在某種特定誘導后，在某種特定誘導因子的誘導下，因子的誘導下，rna聚合酶聚合酶開始啟動轉錄，合成開始啟動轉錄，合成mrna。二

4、、二、mrna的延伸與穩(wěn)定性的延伸與穩(wěn)定性 外源基因起始轉錄后，保持外源基因起始轉錄后，保持mrna的有效延伸、的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達的關鍵。終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達的關鍵。 為了防止為了防止mrna在轉錄過程中的非特異性終止，在轉錄過程中的非特異性終止，可以在構建表達載體時加入抗終止的序列元件?？梢栽跇嫿ū磉_載體時加入抗終止的序列元件。 在表達載體中加入正常轉錄終止序列，可以防在表達載體中加入正常轉錄終止序列，可以防止產(chǎn)生不必要的轉錄產(chǎn)物，使止產(chǎn)生不必要的轉錄產(chǎn)物，使mrna的長度限制的長度限制在一定的范圍內，增加外源基因表達的穩(wěn)定性。在一定的范圍內，增加外源基

5、因表達的穩(wěn)定性。三、外源基因三、外源基因mrna的有效翻譯的有效翻譯 外源基因在原核生物中的有效翻譯需要考慮：外源基因在原核生物中的有效翻譯需要考慮： 1. aug(atg)是首選的密碼子；是首選的密碼子； 2. sd序列為與核糖體序列為與核糖體16s rrna互補結合的位互補結合的位點，該序列至少含有點，該序列至少含有aggagg序列中的序列中的4個堿基；個堿基； 3. sd序列與翻譯起始密碼子之間的距離為序列與翻譯起始密碼子之間的距離為39個堿基；個堿基； 4. 在翻譯起始區(qū)的周圍的序列不易形成明顯的在翻譯起始區(qū)的周圍的序列不易形成明顯的二級結構。二級結構。 真核細胞真核細胞mrna的的5

6、非翻譯區(qū)不存在非翻譯區(qū)不存在sd序列，序列，但絕大多數(shù)但絕大多數(shù)mrna的起始序列含有共同序列。的起始序列含有共同序列。 不同生物使用密碼子具有不同的偏好性。如果不同生物使用密碼子具有不同的偏好性。如果外源基因的外源基因的mrna密碼子使用受體的偏好密碼子，密碼子使用受體的偏好密碼子，則表達效率高。則表達效率高。 mrna上的終止密碼對正確翻譯的效率有很大上的終止密碼對正確翻譯的效率有很大影響。在原核細胞中，影響。在原核細胞中，uaa為最常用的終止密碼為最常用的終止密碼子。子。四、表達蛋白質在細胞中的穩(wěn)定性四、表達蛋白質在細胞中的穩(wěn)定性 外源基因的表達產(chǎn)物在宿主細胞中的穩(wěn)定積累，外源基因的表達

7、產(chǎn)物在宿主細胞中的穩(wěn)定積累，不被宿主蛋白酶所降解，可有效提高表達量。不被宿主蛋白酶所降解，可有效提高表達量。 避免外源蛋白被宿主蛋白酶降解的措施避免外源蛋白被宿主蛋白酶降解的措施: 1.構建融合蛋白表達系統(tǒng)。構建融合蛋白表達系統(tǒng)。 2.構建分泌蛋白表達系統(tǒng)。構建分泌蛋白表達系統(tǒng)。 3.構建包涵體表達系統(tǒng)。構建包涵體表達系統(tǒng)。 4.選擇蛋白酶缺陷型的受體系統(tǒng)。選擇蛋白酶缺陷型的受體系統(tǒng)。五、基因沉默五、基因沉默 基因沉默是導致外源基因不能正常表達的重要基因沉默是導致外源基因不能正常表達的重要因素，主要出現(xiàn)在轉基因動物和轉基因植物中。因素，主要出現(xiàn)在轉基因動物和轉基因植物中。 目的基因沉默是在核酸

8、水平上目的基因沉默是在核酸水平上dna與與dna、dna與與rna、rna與與rna相互作用的結果。重相互作用的結果。重復序列或同源序列是基因沉默的普遍原因之一，復序列或同源序列是基因沉默的普遍原因之一，在構建表達載體時，應盡可能避免與內源序列有在構建表達載體時，應盡可能避免與內源序列有較高的同源性。較高的同源性。 第二節(jié)第二節(jié) 基因表達的調控元件基因表達的調控元件一、啟動子一、啟動子 啟動子是一段提供啟動子是一段提供rna聚合酶識別和結合的聚合酶識別和結合的dna序列，一般位于表達基因的上游。序列，一般位于表達基因的上游。 1.序列特異性。在啟動子的序列特異性。在啟動子的dna序列中，通常序

9、列中，通常含有幾個保守的序列框。含有幾個保守的序列框。 2.方向性。啟動子是一種有方向性的順式調控方向性。啟動子是一種有方向性的順式調控元件。元件。 3.位置特性。一般啟動子只能啟動其下游基因位置特性。一般啟動子只能啟動其下游基因的轉錄。的轉錄。 4.種屬特異性。種屬特異性。二、增強子二、增強子 增強子是能夠增強啟動子轉錄活性的增強子是能夠增強啟動子轉錄活性的dna順式順式作用序列。作用序列。 1.雙向性。正反兩個方向調節(jié)活性。雙向性。正反兩個方向調節(jié)活性。 2.重復序列。增強子一般含有能獨立行使功能重復序列。增強子一般含有能獨立行使功能的重復序列。的重復序列。 3.功能與位置無關。功能與位置

10、無關。 4.特異性。組織特異性，或在特定細胞階段。特異性。組織特異性，或在特定細胞階段。 5.對異源基因也有調節(jié)功能。對異源基因也有調節(jié)功能。三、終止子三、終止子 終止子是提供終止信號使終止子是提供終止信號使rna聚合酶停止轉聚合酶停止轉錄的錄的dna序列。序列。 本征終止子指不需要其他蛋白輔助因子便可在本征終止子指不需要其他蛋白輔助因子便可在特殊的特殊的rna結構區(qū)內實現(xiàn)終止作用。屬于強終止結構區(qū)內實現(xiàn)終止作用。屬于強終止子。子。 依賴型終止子需要依賴型終止子需要因子的輔助，屬于弱終止因子的輔助，屬于弱終止子。子。四、衰減子四、衰減子 衰減子是基因表達調控的精細調節(jié)裝置，利用衰減子是基因表達

11、調控的精細調節(jié)裝置，利用原核生物轉錄與翻譯相偶聯(lián)的特性，依賴自身巧原核生物轉錄與翻譯相偶聯(lián)的特性，依賴自身巧妙的特征序列和相應的妙的特征序列和相應的rna二級結構，對基因轉二級結構，對基因轉錄進行地開關式的微調作用，從而保證原核生物錄進行地開關式的微調作用，從而保證原核生物在相關操縱子處于阻遏的狀態(tài)下仍能以一個本底在相關操縱子處于阻遏的狀態(tài)下仍能以一個本底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。五、絕緣子五、絕緣子 絕緣子長約幾百個核苷酸，是通常位于啟動絕緣子長約幾百個核苷酸，是通常位于啟動子同正調控元件子同正調控元件(增強子增強子)或負調控因子之間的一或負調控因子

12、之間的一種調控序列。絕緣子本身對基因的表達既沒有正種調控序列。絕緣子本身對基因的表達既沒有正效應，也沒有負效應，其作用只是不讓其他調控效應，也沒有負效應，其作用只是不讓其他調控元件對基因的活化效應或失活效應發(fā)生作用。元件對基因的活化效應或失活效應發(fā)生作用。六、反義子六、反義子 反義反義rna是一類與特定是一類與特定dna序列互補的小分序列互補的小分子子rna。編碼反義。編碼反義rna的的dna稱為反義子。反義稱為反義子。反義rna廣泛存在于原核生物和真核生物中，在廣泛存在于原核生物和真核生物中，在dna的復制、轉錄和翻譯三個水平對基因的表達起著的復制、轉錄和翻譯三個水平對基因的表達起著調節(jié)作用

13、，其中以對蛋白質合成的抑制最普遍。調節(jié)作用，其中以對蛋白質合成的抑制最普遍。第三節(jié)第三節(jié) 外源基因表達與調控外源基因表達與調控 外源基因表達包括目的基因與表達載體重組后，外源基因表達包括目的基因與表達載體重組后，導入合適的受體細胞，并能在其中有效表達，產(chǎn)導入合適的受體細胞，并能在其中有效表達，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物生目的基因產(chǎn)物(目的蛋白目的蛋白)。 外源基因表達系統(tǒng)由基因表達載體和相應的受外源基因表達系統(tǒng)由基因表達載體和相應的受體細胞兩部分組成。體細胞兩部分組成。外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理 啟動子 終止子 核糖體結合位點 密碼子 質?？截悢?shù)轉錄翻譯一、大腸桿菌表達系統(tǒng)一、大腸桿菌表達系統(tǒng)

14、r3510sd編碼序列編碼序列oritcrtt啟動子啟動子起始密碼子起始密碼子aug、gug、uug終止密碼子終止密碼子uaau、uga、uag 大腸桿菌基因表達系統(tǒng)的表達載體一般是質粒表達載體，大腸桿菌基因表達系統(tǒng)的表達載體一般是質粒表達載體，含有大腸桿菌內源質粒復制起始位點和有關序列組成的能在大含有大腸桿菌內源質粒復制起始位點和有關序列組成的能在大腸桿菌中有效復制的復制子。腸桿菌中有效復制的復制子。( (一一) )大腸桿菌基因表達載體大腸桿菌基因表達載體核糖體結合位點核糖體結合位點啟動子啟動子轉錄終止子轉錄終止子復制復制起點起點1. 復制子是一段包含復制子起始位點和反式因子復制子是一段包含

15、復制子起始位點和反式因子靶序列在內的靶序列在內的dna片段。片段。 大腸桿菌基因表達系統(tǒng)的表達載體一般是質粒大腸桿菌基因表達系統(tǒng)的表達載體一般是質粒表達載體，含有大腸桿菌內源質粒復制起始位點表達載體，含有大腸桿菌內源質粒復制起始位點和有關序列組成的能在大腸桿菌中有效復制的復和有關序列組成的能在大腸桿菌中有效復制的復制子。制子。2.啟動子和終止子啟動子和終止子 啟動子是調控外源基因轉錄的重要順式元件。啟動子是調控外源基因轉錄的重要順式元件。理想的啟動子應該具備以下性質：理想的啟動子應該具備以下性質： 第一第一, 必須是強啟動子，能夠克隆基因的蛋白必須是強啟動子，能夠克隆基因的蛋白質產(chǎn)物的表達量占

16、細胞總蛋白的質產(chǎn)物的表達量占細胞總蛋白的10%-30%以上以上 第二第二, 這個啟動子應能呈現(xiàn)出一種低限的基礎轉這個啟動子應能呈現(xiàn)出一種低限的基礎轉錄水平，因為在表達毒性蛋白質或是有損于寄主錄水平，因為在表達毒性蛋白質或是有損于寄主細胞生長的蛋白質的情況下，使用高度抑制型的細胞生長的蛋白質的情況下，使用高度抑制型的啟動子是一種極為重要的條件啟動子是一種極為重要的條件 第三第三, 這種啟動子應是誘導型的，能通過簡單這種啟動子應是誘導型的，能通過簡單的方式使用廉價的誘導物而得以的方式使用廉價的誘導物而得以誘導誘導。外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉錄過頭現(xiàn)象，即 rna 聚合酶滑過終止子結

17、構繼續(xù)轉錄質粒上鄰近的 dna 序列，形成長短不一的 mrna 混合物過長轉錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下： 轉錄產(chǎn)物越長，rna聚合酶轉錄一分子 mrna 所需的時間就相應增加，外源基因本身的轉錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 dna功能區(qū)域，如選擇性標記基因和復制子結構等，則 rna聚合酶在此處的轉錄可能干擾質粒的復制及其它生物功能，甚至導致重組質粒的不穩(wěn)定性； 過長的 mrna 往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質，增加工程菌無謂的能量消耗； 更為嚴重的是，過長的轉錄物往往不能形成理想的二級結構， 從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。終止子強終

18、止子的選擇與使用 目前外源基因表達質粒中常用的終止子是來自大腸桿菌 rrna 操縱子上 的 rrnt1t2 以及 t7 噬菌體 dna 上的 tf。 對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特 殊結構，以增強其轉錄終止作用3.核糖體結合位點核糖體結合位點 外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻 率，而且在很大程度上還與 mrna 的翻譯起始效率密切相關。 大腸桿菌細胞中結構不同的 mrna分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。 mrna 翻譯的起始效率主要由其 5 端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（rbs）。 大腸桿菌核糖體結合位點

19、包括下列四個特征結構要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 68 個核苷酸序列 5 uaaggagg 3 即shine-dalgarno（sd）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞 基中的 16s rrna 3 端區(qū)域 3 auuccucc 5 并與之專一性結合 將mrna 定位于核糖體上，從而啟動翻譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以 aug作為閱讀框架的 起始位點，有些基因也使用 gug 或 uug 作為翻譯起始密碼子 sd 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5 端若干密碼子的堿基序列4.密碼子密碼子 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白

20、質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。相同，具有一定的偏愛性。外源基因在大外源基因在大腸桿菌中的表達需考慮密碼子的偏好性。腸桿菌中的表達需考慮密碼子的偏好性。5.選擇標記選擇標記 大腸桿菌的選擇標記一般采用抗生素抗大腸桿菌的選擇標記一般采用抗生素抗性基因。性基因。(二二)宿主菌宿主菌 外源基因表達產(chǎn)物在大腸桿菌細胞內容易被降外源基因表達產(chǎn)物在大腸桿菌細胞內容易被降解，為了避免降解，需要構建與表達載體相適應解，為了避免降解，需要構建與表達載體相適應的大腸桿菌宿主菌。如的大腸桿菌宿主菌。如bl21。（三）常見的大腸桿菌表達系統(tǒng)（三）常見的大

21、腸桿菌表達系統(tǒng) 目前應用廣泛的目前應用廣泛的大腸桿菌表達系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達系統(tǒng)主要有l(wèi)ac和和tac表達系統(tǒng)，表達系統(tǒng)，pl和和pr表達系統(tǒng)，表達系統(tǒng)，t7表達系統(tǒng)。表達系統(tǒng)。 lac和和tac表達系統(tǒng)是以表達系統(tǒng)是以lac操縱子調控機制為操縱子調控機制為基礎構建的表達系統(tǒng)。基礎構建的表達系統(tǒng)。p tac = 3 p trp = 11 p lac啟動子 p lac p trp p tac p traa p ll p reca-35 區(qū)序列t t t a c a t t g a c at t g a c at a g a c a t t g a c a t t g a t a -10 區(qū)序列

22、t a t a a tt t a a c tt a t a a t t a a t g t g a t a c t t a t a a t 啟動子 轉錄調控機理 具有多順反子結構，基因排列次序為： 啟動子（lacp）- 操縱基因（laco） - 結構基因（lacz-lacy-laca） 正調節(jié)因子 cap 負調節(jié)因子 lac i lac 表達系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調控機理為基礎設計、構建的表達系統(tǒng) laci plac laco lacz lacy laca高效轉錄campcap laci plac laco lacz lacy lacarna聚合酶本底水平轉錄lac 表達系統(tǒng) 正調節(jié)

23、因子 cap camp激活cap，capcamp復合物與 lac 操縱子上專一位點結合 后，能促進 rna 聚合酶與 35、10 序列的結合，進而促進 plac 介導的轉錄。rna聚合酶rna聚合酶基因工程中使用的 lac 啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即 plac uv5 camp葡萄糖代謝camp濃度降低campcapcaplac 表達系統(tǒng) lac uv5 突變體 plac uv5 突變體能夠在沒有 cap 存在的情形下非常有效的起始 轉錄，受它控制的基因在轉錄水平上只受 laci 的調控，因此用它 構建的表達載體在使用時比野生型 plac 更易操作。lac 表達系統(tǒng) 負調節(jié)因子 l

24、ac i 在無誘導物情形下， laci 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動 子下游的操縱基因緊密結合，阻止轉錄的起始。 laci plac laco lacz lacy lacarna聚合酶本底水平轉錄 laci plac laco lacz lacy laca高效轉錄rna聚合酶iptgmrnatac 表達系統(tǒng) tac 啟動子是由 trp 的 35 序列和 lacuv5 的 10 序列拼接而成的雜 合啟動子。 調控模式與 lacuv5 相似，但 mrna 轉錄水平高于 trp 和 lacuv5 啟動子（p tac = 3 p trp = 11 p lac），因此在要求有較高基因表達 水平的情

25、況下，選用 tac 啟動子比用 lacuv5 啟動子更優(yōu)越。啟動子 p lac p trp p tac-35 區(qū)序列t t t a c a t t g a c at t g a c a-10 區(qū)序列t a t a a tt t a a c tt a t a a t lac、tac 啟動子對宿主菌的要求 在普通大腸桿菌中， laci 阻遏蛋白僅能滿足細胞染色體上 lac 操縱子 轉錄調控的需要。 當多拷貝的 laco 隨著帶有 lacuv5、tac 啟動子的表達質粒轉化進入 大腸桿菌后，laci 阻遏蛋白與 laco 的比例顯著下降，無法保證每一 個 laco 都能獲得足夠的 laci 阻遏蛋白

26、參與轉錄調控。表現(xiàn)為在無誘 導物存在的情形下， lacuv5、tac 啟動子有較高的本底轉錄。lac、tac 啟動子對宿主菌的要求 為了使以 lac、tac 表達系統(tǒng)具有嚴緊調控外源基因轉錄的能力，一 種能產(chǎn)生過量的 laci 阻遏蛋白的 laci 基因的突變體 laciq 被應用于表 達系統(tǒng)。 大腸桿菌 jm109 等菌株的基因型均為 laciq ，常被選用為 lac、tac 表達系統(tǒng)的宿主菌。 但是這些菌株也只能對低拷貝的表達載體實現(xiàn)嚴緊調控，在使用高拷 貝復制子構建表達載體時，仍能觀察到較高水平的本底轉錄。 需在表達載體中插入 laciq 基因以保證有較多的 laci 阻遏蛋白產(chǎn)生。la

27、c、tac 表達系統(tǒng)存在的問題 iptg 用于誘導 lac、tac 啟動子的轉錄，但由于 iptg 本身具有一定的 毒性。從安全角度，對表達和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。 一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質的生產(chǎn)工藝中不能使用 iptg 解決方法 lac 和 tac 啟動子的轉錄受溫度嚴緊調控 乳糖替代 iptg 誘導 lac 和 tac 啟動子的轉錄lac、tac 表達系統(tǒng)存在的問題 lac 和 tac 啟動子的轉錄受溫度嚴緊調控 把阻遏蛋白 laci 的溫度敏感突變體laci(ts)、laciq(ts)插入表達載體或 整合到染色體后，均能使 lac 和 tac 啟動子的轉錄受到溫度嚴

28、緊調控 在較低溫度（30）時抑制，在較高溫度（42）時開放。 用乳糖替代 iptg 誘導 lac 和 tac 啟動子的轉錄 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導劑的作用 這一過程涉及乳糖的轉運和轉化，其效率受到多種因素的影響和制約 因此乳糖誘導的有效劑量大大高于iptg。 乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也 會導致菌體生理及生長特性變化。乳糖替代 lptg 作為誘導劑的研究 要與發(fā)酵工藝結合起來，才能顯示其良好的前景。 t7 表達系統(tǒng) 大腸桿菌 t7 噬菌體具有一套專一性非常強的轉錄體系，利用這一 體系中的元件為基礎構建的表達系統(tǒng)稱為 t7 表達系統(tǒng)

29、。 t7 表達系統(tǒng) t7 噬菌體基因 1 編碼的 t7 rna 聚合酶選擇性的激活 t7 噬菌體啟 動子的轉錄。 t7 rna 聚合酶活性高，其合成 rna 的速度比大腸桿菌 rna 聚合 酶快 5倍左右。并可以轉錄某些不能被大腸桿菌 rna聚合酶有效轉 錄的序列。 在細胞中存在 t7 rna聚合酶和 t7噬菌體啟動子的情形下，大腸桿 菌宿主本身基因的轉錄競爭不過 t7 噬菌體轉錄體系，最終受 t7噬 菌體啟動子控制的基因的轉錄達到很高的水平。t7 表達系統(tǒng) 轉錄調控的機理 t7 噬菌體啟動子的轉錄完全依賴于 t7 rna 聚合酶，因此 t7 rna 聚合酶的轉錄調控模式就決定了表達系統(tǒng)的調控

30、方式。 化學誘導型 溫度誘導型 雙質粒系統(tǒng)t7 rna 聚合酶t7 啟動子 目的基因 t7 rna 聚合酶基因？啟動子 t7 表達系統(tǒng) 轉錄調控的機理 化學誘導型 噬菌體 de3 是 l 噬菌體的衍生 株，一段含有 laci、lacuv5 啟 動子和 t7 rna 聚合酶基因的 dna 片段被插入其 int 基因中 用噬菌體 de3 的溶源菌作為表 達載體的宿主菌，調控方式為 化學誘導型，類似于 lac 表達 系統(tǒng)。 t7 rna 聚合酶基因 lac 啟動子e.coli （de3）t7 啟動子 目的基因t7 rna 聚合酶iptg誘導t7 表達系統(tǒng)存在的問題 t7 表達系統(tǒng)表達目的基因的水平是

31、目前所有表達系統(tǒng)中最高的，但 也不可避免出現(xiàn)相對較高的本底轉錄，如果目的基因產(chǎn)物對大腸桿 菌宿主有毒性，會影響細胞的生長。 解決辦法之一 在表達系統(tǒng)中低水平表達 t7 溶菌酶基因。 因為 t7 溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上肽聚糖外，還能與 t7 rna 聚合酶結合抑制其轉錄的活性。 目前 t7 溶菌酶基因都通過共轉化質拉導入表達系統(tǒng)，它能明顯 降低本底轉錄，但對誘導后目的基因的表達水平無明顯影響。 1.包涵體蛋白包涵體蛋白 在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（inclusion bodie

32、s，ib）。 富含蛋白質的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。 由高效表達質粒構建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內。 除此之外，包涵體中還含有少量的dna、rna和脂多糖等非蛋白分子。（四）外源基因在大腸桿菌表達的形式（四）外源基因在大腸桿菌表達的形式以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 包涵體表達形式的優(yōu)點 在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結構穩(wěn)定 能夠避免細胞內蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集 簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操

33、作 包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌 體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細 菌裂解物中分離出來 能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應的目標蛋白。以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 包涵體表達形式的缺點 以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過 有效的變性復性操作，才能回收得到具有正確空間構象（因而具 有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變復性操作的效率對目標 產(chǎn)物的收率至關重要。 經(jīng)過復性處理的目標蛋白不一定能完全恢復原來的生物學活性， 有時甚至完全得不到有活性的蛋白質，尤其當目標蛋白分子中的 cys殘基數(shù)目較高時，體外復性蛋白質的成功

34、率相當?shù)停?一般不 超過 30% 復性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。2.融合蛋白融合蛋白 將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的開放閱讀框，以這種方式表起，但不改變兩個基因的開放閱讀框，以這種方式表達的蛋白質稱為融合蛋白。達的蛋白質稱為融合蛋白。 外源蛋白與菌體自身蛋白融合表達后穩(wěn)定性大大外源蛋白與菌體自身蛋白融合表達后穩(wěn)定性大大增加，避免受到菌體蛋白酶的降解。增加，避免受到菌體蛋白酶的降解。 與純化包涵體相比，細胞質中以可溶性形式表達蛋白質與純化包涵體相比，細胞質中以可溶性形式表達蛋白質的分離純化過程比較復雜，一般要通

35、過親合層析才能達到的分離純化過程比較復雜，一般要通過親合層析才能達到比較高的純度。比較高的純度。 目標蛋白與有親合配基的序列融合表達既可以提高分離目標蛋白與有親合配基的序列融合表達既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過程中得到?jīng)]有附加純化的效率，又能在融合蛋白切離的過程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標蛋白。甲硫氨酸目標蛋白。 金黃色葡萄球菌蛋白金黃色葡萄球菌蛋白g、a和衍生物和衍生物z，日本血吸蟲谷胱，日本血吸蟲谷胱甘肽甘肽-s-轉移酶，大腸桿菌麥芽糖結合蛋白，轉移酶，大腸桿菌麥芽糖結合蛋白，his-tag 等是目等是目前常用的與目標基因融合表達的序列。前常用的與目標基因融合表達的序列。3.寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白 在構建表達載體時，將多個外源基因串聯(lián)在一起，