細(xì)菌的分離純化和接種實(shí)驗(yàn)

1、環(huán)工綜合實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的分離純化和接種實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)題目細(xì)菌的分離純化和接種實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)類別綜合實(shí) 驗(yàn) 室實(shí) 驗(yàn) 時(shí) 間實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度:濕度:同組人數(shù)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)；2.了解不同的微生物菌落在斜面上、固體培養(yǎng)基中的生長特征；3.進(jìn)一步熟練和掌握微生物無菌操作技術(shù)；4.掌握微生物培養(yǎng)方法。二、 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備儀器：無菌小試管8支、盛無菌水的錐形瓶1個(gè)、盛無菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基的錐形瓶1個(gè)、無菌玻璃涂棒、5ml無菌移液管1支、1ml無菌移液管4支、接種環(huán)、煤氣燈、無菌培養(yǎng)皿10套試劑：無菌水、無菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基、未知菌種、酵母菌、羽毛

2、溶解菌、湖水三、實(shí)驗(yàn)原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離、純化方法：單細(xì)胞挑取法，稀釋涂布平板法，稀釋混合平板法，平板劃線法。稀釋涂布平板法步驟：倒平板（標(biāo)記培養(yǎng)基名稱）制備湖水稀釋液涂布培養(yǎng)（平板倒置）挑菌落；平板劃線法步驟：倒平板（標(biāo)記培養(yǎng)基名稱）制備湖水稀釋液劃線培養(yǎng)（平板倒置）挑菌落。培養(yǎng)斜面：試管中加培養(yǎng)液（標(biāo)記培養(yǎng)基名稱）斜放試管制斜面選取菌種劃線培養(yǎng)（試管傾斜）挑菌落。 實(shí)驗(yàn)原理問答題：1.為什么湖水用104、105 、106稀釋液進(jìn)行平板稀釋分離而不用更高或者更低的濃度？答：因?yàn)樵谶@三個(gè)濃度范圍內(nèi)能盡量使樣品中的微生物分

3、散開，使其成單個(gè)個(gè)體/細(xì)胞存在，否則一個(gè)菌落就不只是代表一個(gè)個(gè)體生長而成的，從而方便計(jì)數(shù)。2.為什么平板培養(yǎng)皿要倒置放入恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)?答：第一，為了防止重力對(duì)菌落的生成產(chǎn)生影響；第二，為了防止培養(yǎng)基中的水分蒸發(fā)后凝結(jié)在壁上，滴落后影響菌的生長和形態(tài)觀察；第三，防止培養(yǎng)基干涸。3.微生物常用接種方式有哪些？進(jìn)行微生物接種應(yīng)該注意哪些方面？答：劃線接種，涂布接種，穿刺接種，三點(diǎn)接種，澆混接種，液體接種，注射接種，活體接種等。 接種用具及培養(yǎng)基等均需滅菌處理，接種過程必須在煤氣燈旁進(jìn)行，接種環(huán)、玻璃涂棒等器具要過火處理，把所要用到的器材和菌種培養(yǎng)基有序編號(hào)放置，操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具

4、與周圍的物品的接觸，往培養(yǎng)基是劃線或點(diǎn)菌時(shí)動(dòng)作要輕以防把培養(yǎng)基劃破等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.制備細(xì)菌稀釋液：使用5ml移液管加4.5ml無菌水放入貼有10-3、10-4、10-5、10-6標(biāo)簽的小試管中，用一根1ml的無菌移液管吸取10-2的湖水稀釋液0.5ml放入貼有10-3標(biāo)簽的小試管中，1ml的無菌移液管吸洗三次以混勻。然后用另外一支1ml的無菌移液管從貼有10-3標(biāo)簽的小試管中吸取10-3的湖水稀釋液0.5ml放入貼10-4標(biāo)簽的小試管中，吸洗三次以混勻。同法依次連續(xù)稀釋至10-5、10-6稀釋液。2.做平板（10個(gè)）：一人持盛培養(yǎng)基的錐形瓶置火焰旁邊，將瓶塞輕輕地?fù)艹觯靠诒３謱?duì)著火焰；另

5、一人拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。剩余培養(yǎng)基倒入4個(gè)無菌小試管中（每個(gè)小試管盛裝約1/4體積培養(yǎng)液），試管傾斜放置，做成斜面。3、湖水中微生物含量的測(cè)定：分別從10-4、10-5、10-6土壤稀釋液中，用各自潤洗過的移液管吸取0.2ml的菌液放在不同的平板上，搖晃并涂布均勻，平板平置在桌面，依法再做一組平行樣。4、空氣、自來水中細(xì)菌含量的測(cè)定：在一個(gè)平板中，加入0.2ml的自來水，搖晃并涂布均勻，并做一組平行樣；打開一平板蓋，使培養(yǎng)基暴露在空氣中10分鐘，蓋上皿蓋。再做一組平行

6、樣。5、微生物接種：將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基上，待冷卻后再從斜面上刮取少許菌苔取出，接種環(huán)不能通過火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上做s形劃線。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔細(xì)灼燒接種環(huán)后，放回原處，并塞緊棉塞。將接種管貼好標(biāo)簽或用玻璃鉛筆劃好標(biāo)記后再放入試管架，即可進(jìn)行培養(yǎng)。選擇兩個(gè)未知菌種、一個(gè)酵母菌菌種、一個(gè)羽毛溶解菌菌種接種到斜面上。6、培養(yǎng)：斜面以及倒置后的平板全部放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30培養(yǎng)。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.倒平板在培養(yǎng)基溫度為45度以上進(jìn)行。2.微生物實(shí)驗(yàn)盡量保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境在無菌狀態(tài)六、思考題1.氧化亞鐵硫

7、桿菌（ thiobacillusferrooxidans,t.f ）為生物冶金重要菌種，屬微生物中原核生物界、化能營養(yǎng)原核生物門、細(xì)菌綱、硫化細(xì)菌科、硫桿菌屬。廣泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉積硫內(nèi)，尤以金屬硫化礦和煤礦等酸性礦坑水（ph4）中最為常見。其化能自養(yǎng)，專性好氧，嗜酸，革蘭氏陰性，主要利用利用co2為碳源，并吸收氮、磷等無機(jī)營養(yǎng)來合成自身細(xì)胞。請(qǐng)思考其分離純化的方法和步驟。答：采取酸性礦坑水或?qū)嶒?yàn)室浸礦培養(yǎng)液作為菌液，在實(shí)驗(yàn)室用9k或leathen培養(yǎng)基反復(fù)分離純化。具體方法一：取菌液10ml，加入盛有100ml滅菌9k或leathen液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，在

8、30,120r/min的空氣浴恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，直至錐形瓶中的溶液變?yōu)榧t棕色，一般需4天。反復(fù)幾次。然后采用固體培養(yǎng)基稀釋涂布平板法分離純化菌種以獲得純培養(yǎng)。在9k固體培養(yǎng)基上710天出現(xiàn)圓形凸起狀小菌落（d1mm），將單獨(dú)小菌落挑起，每個(gè)小菌落分別接種到裝有5ml液體培養(yǎng)基的小試管中，以棉球封口，培養(yǎng)條件同上，直到小試管的液體顏色也變成紅棕色。重復(fù)在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)和在平板上反復(fù)分離，最后分離出優(yōu)良菌株。具體方法二：取菌液1ml，用ph=2.5的稀硫酸按每次稀釋10倍，依次稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6濃度的稀釋液。吸取稀釋度為10-4，10-5，10-6

9、稀釋樣各0.2ml，分別接種到三個(gè)事先準(zhǔn)備好的滅菌9k瓊脂固體培養(yǎng)基，涂布均勻，正置于30恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日倒置繼續(xù)培養(yǎng)，直至固體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)圓形凸起狀小菌落（d1mm），一般需兩周。將單獨(dú)小菌落挑起，每個(gè)小菌落分別接種到裝有5ml9k液體培養(yǎng)基的小試管中，以棉球封口，放在30搖床中振蕩培養(yǎng)，反復(fù)進(jìn)行直到純化為止。2.某果園業(yè)主想知道其果園土壤中的微生物數(shù)量，請(qǐng)幫助設(shè)計(jì)方案（詳細(xì)說明）。答：取一定重量的土壤，稱取1g，置于100ml無菌水中，振蕩、離心，取上清液得到土壤浸出液（看做土壤中的微生物全部轉(zhuǎn)移至水中）。對(duì)浸出液做梯度稀釋，取一定稀釋度的溶液，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上以平板涂布法培養(yǎng)后數(shù)菌落數(shù)，然后乘上稀釋倍數(shù)，就可得到1g土壤中該微生物的數(shù)量。3.某生物實(shí)驗(yàn)室需