凝膠過濾層析法分離血紅蛋白

1、凝膠過濾層析法分離血紅蛋白凝膠過濾層析法分離血紅蛋白化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)藥學(xué)院藥學(xué)院 化學(xué)生物學(xué)教研室化學(xué)生物學(xué)教研室1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?1 22.實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 層析法是利用混合物中各組分物理經(jīng)學(xué)性質(zhì)的差別（如吸附力、溶解度、分子形狀、大小和極性等），使各組分以不同的程度分布在兩相中，從而使各組分以不同的速度隨流動(dòng)相向前流動(dòng)而達(dá)到分離的目的。層析法可分為多種類型，包括分配層析，離子交換層析，凝膠過濾層析，親和層析等。 層析法層析法分配層析分配層析 離子交換層析離子交換層析凝膠過濾層析凝膠過濾層析 親和層析親和層析 2.實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理1 1待分離混合物（a、b）隨流動(dòng)相通過固定相由于理化性質(zhì)差

2、異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對(duì)比）不同與固定相相互作用力越弱的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯作用小，移動(dòng)速度快分步收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達(dá)到將各組分分離的目的2 23 34 4凝膠過濾層析，主要根據(jù)混合物中分子的大小及形狀不同，在通過凝膠（固定相）時(shí)，分子的擴(kuò)散速率各異而達(dá)到分離的目的。凝膠顆粒具有多孔性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流程長(zhǎng)而移動(dòng)速率慢（阻滯作用大）；而大分子則被排除在外，沿凝膠間空隙隨（流動(dòng)相）流動(dòng)，流動(dòng)短而移動(dòng)速率快（阻滯作用?。?，比小分子物質(zhì)先流出層析床，所以凝膠過濾層析又稱為排阻層析，分子

3、篩層析，凝膠過濾法操作簡(jiǎn)例，且操作條件溫和，不易引起生物樣品變性失活，分離效果好，故廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、核酸的分離提純（包括脫鹽、濃鹽及分子量的測(cè)定等）2.實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)通過本實(shí)驗(yàn)通過sephadexg50層析柱，以蒸餾水為流動(dòng)相，分離血紅蛋層析柱，以蒸餾水為流動(dòng)相，分離血紅蛋白（紅色，分子量約白（紅色，分子量約64,500）與二硝基氟苯）與二硝基氟苯-魚精蛋白（魚精蛋白與魚精蛋白（魚精蛋白與二硝基氟苯結(jié)合后為黃色，分子量為二硝基氟苯結(jié)合后為黃色，分子量為2,000-12,000）的混合物，從顏）的混合物，從顏色的不同即可觀察到血紅蛋白洗脫較快，魚精蛋白洗脫較慢。色的不同即可觀察到血

4、紅蛋白洗脫較快，魚精蛋白洗脫較慢。2.實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理3.實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)用品 4.操作步驟操作步驟1 1、凝膠準(zhǔn)備：、凝膠準(zhǔn)備：取sephadex g-50 3g置于錐形瓶中，加蒸餾水90ml，于沸水浴中煮沸2小時(shí)(或放于水中浸泡6小時(shí))，充分膨脹凝膠。取出，冷卻至室溫后備用。2 2、裝柱：、裝柱：關(guān)閉下口，向玻璃柱內(nèi)加入蒸餾水達(dá)柱總長(zhǎng)度約1/3處，把膨脹好的糊狀凝膠邊攪拌、邊自柱的頂端沿管內(nèi)壁緩緩加入柱中至柱頂部，待柱底部凝膠沉積至1-2cm時(shí)，開啟柱底部出水口，并控制一定的流速，使柱中的凝膠一直處在溶液中。再慢慢地繼續(xù)加入凝膠，直至凝膠體積至柱頂2.5cm左右，最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，

5、需用玻璃棒輕輕攪動(dòng)柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。裝柱長(zhǎng)度至少8cm。最后放入略小于層析柱內(nèi)徑的圓形小濾紙片，以防將來加樣時(shí)凝膠被沖起。4.操作步驟操作步驟3 3、平衡：、平衡：用10ml左右的蒸餾水流洗整個(gè)柱床。操作過程中嚴(yán)防出現(xiàn)氣泡和分層，如床面不平，可用玻璃棒輕輕攪動(dòng)表面，是凝膠重新自然沉降。整個(gè)過程中勿使液面低于床面，以免氣體進(jìn)入，使柱床干裂。4 4、加樣：、加樣：待柱床面以下的蒸餾水流出，且剛好與床面相切時(shí)(切不可使床面完全暴露于空氣中)，關(guān)閉下口。用滴管取血紅蛋白及魚精蛋白混合液（血紅蛋白稀釋液3滴加dnp-魚精蛋白溶液3滴），十分小心地并緩緩沿內(nèi)壁加入(注意切勿破壞柱床面)，打開柱底

6、部出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，至床面重新露出時(shí)，先加入少量的蒸餾水，沖洗床面1-2次，然后再加入足量蒸餾水。4.操作步驟操作步驟5 5、洗脫和標(biāo)定：、洗脫和標(biāo)定：用試管收集洗脫液體。調(diào)節(jié)流速使液體均勻流出（約1ml/min），同時(shí)記錄如下數(shù)據(jù)：起始、紅始、紅終、黃始、黃終、終止(1.5倍柱體積)。觀察血紅蛋白與魚精蛋白的洗脫次序并記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象(注意洗脫過程中隨時(shí)添加蒸餾水，以免干柱)。6 6、清洗：、清洗：待所有色帶流出層析柱后，繼續(xù)加入蒸餾水并加快流速，清洗層析柱至凝膠潔凈呈白色為止。7 7、凝膠的回收：、凝膠的回收：將清洗干凈的sephadex g-50凝膠回收至回收容器中。8 8、結(jié)果處理：、

7、結(jié)果處理：觀察記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并加以分析。5.注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)膠膨脹必須徹底，否則會(huì)影響層析的均一性，甚至有使柱破裂的危險(xiǎn)。裝柱前加入1cm洗脫液，檢查柱子。凝膠裝柱過程中嚴(yán)防出現(xiàn)氣泡和分層，要使液面高于床面，以免氣體進(jìn)入柱床，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終血紅蛋白及核黃素混合物質(zhì)的分離效果。凝膠裝柱要一次完成。裝凝膠的燒杯不能清洗。（看似臟的東西都是凝膠）。柱中的凝膠一定要浸沒在洗脫液中。加樣一定要極其小心而緩慢，以免凝膠被沖起，造成層析結(jié)果不佳。上樣時(shí)滴管末端一定要靠近凝膠柱表面(1cm)、沿柱內(nèi)壁緩緩滴加，不能沖擊凝膠柱表面。樣品上柱后應(yīng)在凝膠柱表面形成一層薄液層。收集要及時(shí)，不能等紅褐色物質(zhì)流

8、出之后再收集(13滴/管)。流速不可太快(約10滴/min)。層析前及層析中要絕對(duì)避免干柱現(xiàn)象。始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)，導(dǎo)致分離效果變壞，不得不重新裝柱。洗脫完成后凝膠要回收，勿丟棄。6.思考題在向凝膠柱加入樣品時(shí)，為什么必須保持膠面平整？上樣體積在向凝膠柱加入樣品時(shí)，為什么必須保持膠面平整？上樣體積為什么不能太大？為什么不能太大？請(qǐng)解釋為什么在洗脫樣品時(shí)，流速不能太快或者太慢？請(qǐng)解釋為什么在洗脫樣品時(shí)，流速不能太快或者太慢？某樣品中含有某樣品中含有1 mg a蛋白（蛋白（mr 10,000da），），1 mg b蛋白蛋白（mr 30,000da），），4 mg c蛋白（蛋白（mr 60,000da），），1 mg d蛋白