溫敏突變株的分離生工班第一小組

1、溫度敏感突變株的分離溫度敏感突變株的分離定義定義l在誘變處理后的群體中能分離到這樣一類突變株:它們?cè)谠S可的溫度下能正常生長(zhǎng)，其表型和野生型沒(méi)有區(qū)別，在非許可溫度條件下不能生長(zhǎng)或微弱生長(zhǎng)，表型與野生型不同，這種條件致死突變株即溫度敏感突變株溫度敏感突變株溫敏突變株的特性溫敏突變株的特性lts突變株主要由必需基因的突變導(dǎo)致某些基因產(chǎn)物（某種酶）的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而引起的，即突變體的酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列發(fā)生了改變，而酶的活性中心并未發(fā)生改變。有時(shí) 非必需基因的突變也可產(chǎn)生溫敏突變株。l溫敏突變株的突變位置，就谷氨酸而言，據(jù)推測(cè)，發(fā)生在與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)基因上。這種基因突變，最常見(jiàn)的事

2、錯(cuò)義突變，主要是結(jié)構(gòu)上的堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換引起氨基酸序列的改變。其次，還有二次移碼突變、結(jié)構(gòu)基因末端缺失突變等。溫敏突變株的篩選方法溫敏突變株的篩選方法l（1）溫敏突變株的誘發(fā)）溫敏突變株的誘發(fā)l（2）富集）富集l（3）分離篩選）分離篩選（一）溫敏突變株的誘發(fā)（一）溫敏突變株的誘發(fā)l根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇出發(fā)菌株，用合格的誘發(fā)因子進(jìn)行誘變處理。由于這種突變株主要由基因錯(cuò)義突變所致，所以使用誘變劑時(shí)，要選擇易于引起堿基置換的亞硝基類、磺酸脂類化合物，或亞硝基、紫外線等誘變劑。誘變處理方法和劑量同常規(guī)育種基本相同。（二）富集（二）富集lts突變株的出現(xiàn)頻率極低，僅有0.1%左右。為了提高篩選概率，誘變后

3、的菌懸液先要進(jìn)行富集。富集方法有抗生素法、物理方法、h3-前體法等。1.抗生素法抗生素法l這是常用的方法，其原理與營(yíng)養(yǎng)缺陷型抗生素濃縮法相同。細(xì)菌類采用青霉素法,真菌類采用制霉菌素法。方法是：將誘變后的菌體在非許可溫度下，培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入抗菌素，此時(shí)可殺死或殺傷在該溫度下生長(zhǎng)的野生菌，不可能殺死在同樣溫度條件下未曾生長(zhǎng)的ts突變株，離心去除抗生素，進(jìn)行分離。2.過(guò)濾或離心法過(guò)濾或離心法l某些ts突變株是dna復(fù)制缺損或孢子萌發(fā)缺損的突變株，它們?cè)诜窃S可溫度下培養(yǎng)到一定時(shí)期，細(xì)胞伸長(zhǎng)成絲狀，或芽枝不脫離母細(xì)胞，致使比重增加，因而可用薄膜過(guò)濾或密度梯度離心等方法富集達(dá)到與野生菌株分開(kāi)的目的。3

4、.h3-前體法前體法l如果要富集某種大分子合成缺損的ts突變株，可以加入相應(yīng)的h3-前體物質(zhì)即可達(dá)到目的。例如篩選rna合成缺損的ts突變株是，可以把誘變后的菌體在非許可溫度下培養(yǎng)，并加入h3-尿嘧啶。此時(shí)rna缺損的ts突體不能合成，也不吸收h3-尿嘧啶，而野生型菌株或其他大分子合成缺損ts都可吸收h3-尿嘧啶，并摻入rna。含有h3-rna的細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間低溫保存過(guò)程中由于射線損傷而死亡，但rna合成缺損的ts突變株則保存下來(lái)。（三）分離篩選（三）分離篩選l1.常規(guī)法常規(guī)法l2.特殊分離篩選方法特殊分離篩選方法l菌體經(jīng)過(guò)富集以后，可以制成一定的稀釋度，分離于平板。ts突變株的篩選方法比較簡(jiǎn)單

5、，主要根據(jù)菌體在高于或低于最適生長(zhǎng)溫度515的生長(zhǎng)狀態(tài)。各類微生物突變株的溫度范圍大約為：細(xì)菌為3040（30為許可溫度，40為非許可溫度，下同）。放線菌為3038，酵母菌為2336。可用常規(guī)法和特殊法進(jìn)行篩選。l經(jīng)過(guò)富集后的菌體細(xì)胞分離在完全培養(yǎng)基上，置于許可溫度下培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)出菌落之后，用平板影印法（見(jiàn)圖6.17）將菌落分別復(fù)印到一個(gè)完全培養(yǎng)基上和兩個(gè)基本培養(yǎng)基各一皿，置于非許可溫度下培養(yǎng)，另一組取完全培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基各一皿，置于非許可溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)后根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況，可以分為兩大類： l一類是非必需基因突變形成的溫敏突變株，在許可溫度下的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明該類突變株從完全培養(yǎng)基中補(bǔ)

6、充了某種生長(zhǎng)因子后才得以生長(zhǎng)，是一類突變引起失去單一酶但可以補(bǔ)償功能的ts突變株。l另一類是由必需基因突變引起的ts突變株，在許可溫度的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而非許可溫度的基本培養(yǎng)基上都不生長(zhǎng)，說(shuō)明該類突變株即使從完全培養(yǎng)基內(nèi)提供了某種生長(zhǎng)因子也無(wú)法補(bǔ)償失去的功能。通常ts突變株是指后一類。假如在許可與非許可溫度下基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上全部生長(zhǎng)，則為野生菌株。l將誘變處理后的菌體直接涂布于，先在非許可溫度下培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落作記號(hào)，即為野生型菌株，然后再置于許可溫度下培養(yǎng)，長(zhǎng)出新的菌落，即為ts突變株。l通過(guò)以上方法檢出的ts突變株要進(jìn)一步復(fù)征，然后純化。2.特殊分離篩選方法特殊分離篩選方法l 如要

7、具體獲得具有特定性能ts突變株，要靈活巧妙的設(shè)計(jì)富集方法和平板培養(yǎng)基組成。l 例如:1要獲得由甲醇和甘氨酸合成高產(chǎn)的絲氨酸菌株，先通過(guò)誘變因子處理，從中篩選出絲氨酸降解代謝障礙的ts突變株，但要排除c4二羧酸分解代謝障礙ts突變株。為此，moringga先用甲醇為碳源，篩選得到有關(guān)的ts突變株，然后從中進(jìn)一步篩選絲氨酸突變菌株，即把以上溫敏突變株移接到含有琥珀酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，淘汰在琥珀酸上生長(zhǎng)良好的突變株，以提高篩選效率。 l2造成單細(xì)胞蛋白質(zhì)中蛋氨酸含量高的ts突變株的主要原因：第一是遺傳密碼翻譯期間發(fā)生錯(cuò)誤的內(nèi)在因素；第二是高溫引起堿基錯(cuò)配的外界因素。因此，篩選這種突變株時(shí)，可以在分離培養(yǎng)基中增加蛋氨酸的濃度，增加錯(cuò)誤轉(zhuǎn)譯機(jī)會(huì)。 l具體方法:把菌體涂布于基本培養(yǎng)基上，限置于許可溫度下培養(yǎng)，而后在轉(zhuǎn)移到0.2%蛋氨酸的基本培養(yǎng)基上,放置于非許可溫度下培養(yǎng),這時(shí)