受體配體結(jié)合研究課件

1、受體配體結(jié)合研究 課程網(wǎng)址受體配體結(jié)合研究構(gòu)型(configuration)和構(gòu)象(conformation)nConfiguration：The geometrical arrangement in polymers arising from the order of atoms determined by chemical bonds.nConformation：The geometrical arrangement in polymers arising from rotation about adjacent carbon-carbon single bonds.n構(gòu)型的改變，分子中一

2、定會(huì)有共價(jià)鍵的斷裂和新的共價(jià)鍵的生成；而構(gòu)象的改變不需要共價(jià)鍵的變換受體配體結(jié)合研究構(gòu)型異構(gòu)體還是構(gòu)象異構(gòu)體？Isotactic Syndiotactic 受體配體結(jié)合研究構(gòu)型異構(gòu)體還是構(gòu)象異構(gòu)體？受體配體結(jié)合研究 Techniques in receptor research 尹長(zhǎng)城尹長(zhǎng)城北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物物理學(xué)系北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物物理學(xué)系受體配體結(jié)合研究 3. 受體與配基結(jié)合的動(dòng)力學(xué)受體與配基結(jié)合的動(dòng)力學(xué)受體配體結(jié)合研究3.1 受體放射配基結(jié)合分析n60年代初在受體研究中采用放射性標(biāo)記核素 并建立了受體放射配基結(jié)合分析 (radioligand binding assay, RBA)，它的

3、理論基礎(chǔ)是占領(lǐng)學(xué)說(shuō)n該理論認(rèn)為n受體與配基以單分子相互結(jié)合(分子比為1:1)n反應(yīng)服從質(zhì)量作用定律, 反應(yīng)是可逆的n配基在結(jié)合和解離后不被代謝，也不與其它類型受體結(jié)合n受體與配基結(jié)合后產(chǎn)生的生物效應(yīng)的強(qiáng)度與受體被占領(lǐng)的量成正比受體配體結(jié)合研究3.1 單位點(diǎn)受體與配基結(jié)合反應(yīng)的數(shù)學(xué)表達(dá)n受體與配基結(jié)合作用的反應(yīng)式如下:n根據(jù)質(zhì)量作用定律，結(jié)合反應(yīng)速率為 v1= k1RL, 解離反應(yīng)速率為 v2= k2RLn當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí), v1= v2，所以n n （1）nR、L、RL分別為游離受體、游離配基、受體-配基復(fù)合物的摩爾濃度nk1、k2分別是結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)nKd是解離平衡常數(shù)，單位為m

4、ol/L; Kd值的大小作為衡量配基與受體相互結(jié)合能力的一個(gè)重要物理量: Kd值愈小結(jié)合能力愈大; Kd又稱為親和常數(shù) 12RLLRkkKdR+LRLk1k2受體配體結(jié)合研究3.1 單位點(diǎn)受體與配基結(jié)合反應(yīng)的數(shù)學(xué)表達(dá)n設(shè)：RT為受體的初始濃度 n （2）n重排并整理得：n （3）n上式即Scatchard方程 ，以RL/L為縱軸，以RL為橫軸作圖得一直線n直線斜率為-1/Kd, 橫軸截距為RT, 縱軸截距為RT/KdRLRTRRLLRLRTRLLRKd1RLKKRTKRLRTLRLddd受體配體結(jié)合研究 Scatchard圖受體配體結(jié)合研究3.1 單位點(diǎn)受體與配基結(jié)合反應(yīng)的數(shù)學(xué)表達(dá)n同理可推出

5、：n （4）n上式為Woolf方程：以L/RL為縱軸，以L為橫軸作圖得一直線n直線的斜率為1/RT, 橫軸截距為-1/Kd, 縱軸截距為Kd/RT1LRTRTKRLLd受體配體結(jié)合研究 Woolf圖受體配體結(jié)合研究3.1 單位點(diǎn)受體與配基結(jié)合反應(yīng)的數(shù)學(xué)表達(dá)n同理還可推出：n （5）n上式為L(zhǎng)ineweaver-Burk方程，亦稱雙倒數(shù)方程：以1/RL為縱軸，以1/L為橫軸作圖得一直線n直線的斜率為Kd/RT, 橫軸截距為1/Kd, 縱軸截距為1/RT111LRTKRTRLd受體配體結(jié)合研究 Lineweaver-Burk圖受體配體結(jié)合研究3.1 單位點(diǎn)受體與配基結(jié)合反應(yīng)的數(shù)學(xué)表達(dá)n設(shè)：LT是總

6、配基濃度, L = LT RL, 將 L = LT RL 和 R = RT RL代入(2)式，經(jīng)整理得：n （6）n上式為以RL為變量的雙曲線一元二次方程n當(dāng)RT、Kd固定時(shí)，RL隨LT的變化而變化，開(kāi)始上升很快，以后逐漸趨向水平，這就是飽和曲線02LTRTKLTRTRLRLd受體配體結(jié)合研究受體與配基結(jié)合曲線nSB為特異性結(jié)合，NSB為非特異性結(jié)合，TB為總結(jié)合nSB= TB NSB受體配體結(jié)合研究3.1 單位點(diǎn)受體與配基結(jié)合反應(yīng)的數(shù)學(xué)表達(dá)n將(1)式重排變成下式：n （7） n設(shè)RL = RT, L=L1/2, 帶入上式，得n整理，得 Kd = L1/2n結(jié)論：在50受體結(jié)合配基時(shí),體系中

7、游離配基的濃度就是受體的解離平衡常數(shù)Kd值 LKLRTRLd212121LKLRTRTd受體配體結(jié)合研究3.2 雙位點(diǎn)系統(tǒng)n一種配基可以和兩種受體結(jié)合，這兩種受體往往是某類受體的兩種亞型n選用某種放射配基，進(jìn)行飽和實(shí)驗(yàn)， 用Scatchard 作圖法得到的不是直線而是向上凹的曲線；這條曲線是由高低親和性不同的兩條直線加合成的受體配體結(jié)合研究雙位點(diǎn)系統(tǒng)飽和曲線飽和曲線Scatchard曲線曲線 受體配體結(jié)合研究雙位點(diǎn)系統(tǒng)n 近年來(lái)發(fā)展了很多方法用來(lái)進(jìn)行雙位點(diǎn)系統(tǒng)受體亞型的研究n用選擇性放射配基進(jìn)行多點(diǎn)飽和實(shí)驗(yàn)n用非選擇性放射配基和選擇性非放射配基進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性取代實(shí)驗(yàn)n 原則上它們也可以用于多種亞型

8、的分析，但是由于配基選擇性的限制及實(shí)驗(yàn)誤差的存在等原因, 多數(shù)成功的例子僅限于雙位點(diǎn)系統(tǒng)受體配體結(jié)合研究3.2.1選擇性放射配基的飽和曲線n 選擇性放射配基，對(duì)一種亞型有高親和力, 而對(duì)另一種亞型則為低親和力n 多點(diǎn)飽和實(shí)驗(yàn)顯示，隨著LT加大，RL先是因高親和力的大部分結(jié)合趨向飽和，然后由于低親和力亞型結(jié)合增多，曲線又住上翹n 用Scatchard作圖得到的不是直線而是向上凹的曲線，也就是說(shuō)，隨著LT增加，曲線前部分斜率很陡 (高親和力亞型結(jié)合)，然后斜率平坦 (低親和力亞型結(jié)合)受體配體結(jié)合研究3.2.1選擇性放射配基的飽和曲線n應(yīng)該指出，即使LT很小時(shí)，低親和力亞型也不是完全不結(jié)合，所以不

9、能把飽和曲線或Scatchard 曲線截然分成兩段，前一段是高親和力亞型結(jié)合，后一段是低親和力亞型結(jié)合。實(shí)際上每段曲線都是兩種亞型結(jié)構(gòu)的總和，只是每種亞型所占比率多少不等而言n在實(shí)際分析數(shù)據(jù)工作中，首先需用合理的受體結(jié)合反應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，然后是運(yùn)用計(jì)算機(jī)程序處理，才能得到兩種亞型受體的RT和Kd值受體配體結(jié)合研究雙位點(diǎn)飽和實(shí)驗(yàn)法 n運(yùn)用Scatchard方程分兩種受體亞型，由于系統(tǒng)中放射配基L是相同的, 它們各自的結(jié)合方程為n實(shí)際上，實(shí)驗(yàn)中測(cè)量得到的是RL,而不是RL1和RL2,由于RL=RL1+RL2,所以 n （8）n上式中RL,L是實(shí)測(cè)值,RL1、RL2、Kd1、Kd2為四個(gè)待測(cè)參數(shù)。只要

10、有足夠多的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，就可以用最小二乘回歸法去求四個(gè)參數(shù)，并根據(jù)參數(shù)再擬合成兩種亞型的圖形 111LKRTLRLd222LKRTLRLd2211LKRTLKRTLRLdd受體配體結(jié)合研究3.2.2 非選擇性放射配基和選擇性非放射配基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 n選用放射配基對(duì)兩種亞型受體的親和力相同，選用非放射配基對(duì)一種亞型有高的親和力，對(duì)另一種亞型則是低親和力n在一定濃度的放射配基和受體系統(tǒng)中加入不同濃度的選擇性非放射配基作競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。高親和力的配基容易與受體結(jié)合而取代放射配基，表現(xiàn)為部分結(jié)合位點(diǎn)在低濃度競(jìng)爭(zhēng)劑即明顯喪失放射性，而另一部分受體在高濃度競(jìng)爭(zhēng)劑時(shí)對(duì)放射配基有明顯抑制作用n和雙位點(diǎn)飽和曲線一樣，這種區(qū)

11、分不是絕對(duì)的。必須通過(guò)計(jì)算機(jī)擬合才能得到兩種亞型的各自參數(shù)受體配體結(jié)合研究3.2.2 非選擇性放射配基和選擇性非放射配基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合n如果只有一種亞型受體系統(tǒng)，放射配基和選擇性非放射配基(抑制劑)與受體反應(yīng)，則n體系中R是共同的，解上述聯(lián)立方程，得：n如果體系中有兩種亞型受體，則 n n （9）RLLRKdRIIRKiRIRLRRTIKIRTRIi221121IKIRTIKIRTRIRIRIii受體配體結(jié)合研究3.2.3 正負(fù)協(xié)同作用正負(fù)協(xié)同作用 n何謂正負(fù)協(xié)同作用？它是指當(dāng)一部分受體與配基結(jié)合后使相鄰的受體的親和力發(fā)生改變的現(xiàn)象n親和力下降稱之為負(fù)協(xié)同作用；親和力增大稱之為正協(xié)同作用n在Scat

12、chard圖中，曲線斜率變小為負(fù)協(xié)同作用；曲線斜率變大為正協(xié)同作用受體配體結(jié)合研究Scatchard 圖與正負(fù)協(xié)同作用 受體配體結(jié)合研究Hill方程與正負(fù)協(xié)同作用方程與正負(fù)協(xié)同作用 n用Hill作圖法可判別協(xié)同作用的性質(zhì)。其原理如下： 倘若一個(gè)受體可以和n個(gè)配基結(jié)合，并且Kd值相同, 則n移項(xiàng)，得n兩邊取對(duì)數(shù)，得n （10） RLLRLRTKnddnKLRLRTRLlglglglgLnKKLRLRTRLddn受體配體結(jié)合研究Hill方程與正負(fù)協(xié)同作用方程與正負(fù)協(xié)同作用n以 為縱坐標(biāo)，lgL為橫坐標(biāo)作圖：n直線的斜率為n，稱為Hill系數(shù)lgRLRTRL受體配體結(jié)合研究Hill系數(shù)與正負(fù)協(xié)同作用

13、系數(shù)與正負(fù)協(xié)同作用n令 , 則n由于kd值不變，如果：nn=1, L1/2 = Kd , 簡(jiǎn)單單位點(diǎn)系統(tǒng)nn Kd , 體系中游離配基，受體親和力，負(fù)協(xié)同作用nn1, L1/2 RT,在反應(yīng)過(guò)程中LT變化很小，則n （12） 21RLkLRkdtRLd21RLkRLLTRLRTkdtRLd21RLkLTRLRTkdtRLdR+LRLk1k2受體配體結(jié)合研究結(jié)合速率常數(shù) n當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，dRL/dt = 0，設(shè)此時(shí)復(fù)合物的濃度為RLe ,則n n n （13）n將（13）式帶入（12）式，得n n整理，得n （14）021eeRLkLTRLRTkdtRLd12eeRLLTRLRTkk11RL

14、RLLTRLRTkLTRLRTkdtRLdeedtRLRTLTkRLRLRLdee1受體配體結(jié)合研究結(jié)合速率常數(shù)n（14）式積分，得n （15）n（13）式整理，得n （16）n將（16）式帶入（15）式，得n （17）n令k表=k2+k1LT 為表觀速率常數(shù)(復(fù)合物凈生成速率常數(shù))，則n （18）tRLRTLTkRLRLRLeeln121LTkkRLRTLTetLTkktLTkkkRLRLRLe)()(ln12121tkRLRLRLe表ln受體配體結(jié)合研究解離速率常數(shù) n當(dāng)受體與配基的結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，加入大于100倍量的非標(biāo)記配基，使標(biāo)記配基與受體不再結(jié)合而且平衡破壞，受體標(biāo)記配基復(fù)合物

15、發(fā)生解離，其速率為n （19）n重排，得n （20）2RLkdtRLddtkRLRLd2受體配體結(jié)合研究解離速率常數(shù)tkeeRLRL2n（20）式積分，得n （21a)n或n (21b)n當(dāng)RL= RLe時(shí), t=T1/2（復(fù)合物解離一半的時(shí)間）n所以n （22）tkRLRLe2ln2/122lnTk 受體配體結(jié)合研究受體-放射配基反應(yīng)復(fù)合物時(shí)相曲線 RLeT1/2t=0受體配體結(jié)合研究速率常數(shù)測(cè)定n根據(jù)(B)曲線求復(fù)合物解離一半所需時(shí)間即T1/2 ，由（22）式求出k2n根據(jù)(A)曲線不同時(shí)間測(cè)得RL，以lnRL/RLeRL為縱坐標(biāo)，t為橫坐標(biāo)作圖，圖中直線斜率由(18)式知其為k表值n由k

16、表=k2+k1LT，便可求得k1值 2/1T受體配體結(jié)合研究3.2.5 受體的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性受體的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)結(jié)合反應(yīng) n在一個(gè)受體和放射配基的反應(yīng)系統(tǒng)中加入另一個(gè)化合物，它若能和受體結(jié)合,則會(huì)抑制放射配基與受體的結(jié)合反應(yīng)n加入的化合物稱為受體反應(yīng)的抑制劑,抑制劑可以是激動(dòng)劑，也可以是拮抗劑n拮抗劑按其作用機(jī)制又可分為競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑和非競(jìng)爭(zhēng)性的拮抗劑 受體配體結(jié)合研究3.2.5 受體的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性受體的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)結(jié)合反應(yīng)n競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的抑制作用是它與激動(dòng)劑競(jìng)爭(zhēng)受體的相同或鄰近的部位，競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑與激動(dòng)劑對(duì)受體結(jié)合作用是相互排斥，競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑與受體結(jié)合只減少激動(dòng)劑與

17、受體的結(jié)合數(shù)量n競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑與受體結(jié)合后，不改變受體分子的結(jié)構(gòu),受體仍可與激動(dòng)劑繼續(xù)結(jié)合,而且可完全排除競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，表現(xiàn)出可逆反應(yīng)的特性n非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑與受體結(jié)合后, 則改變受體分子的結(jié)構(gòu)，激動(dòng)劑不能排除拮抗劑，表現(xiàn)為不可逆反應(yīng)特性n對(duì)拮抗劑競(jìng)爭(zhēng)類型的鑒別是十分重要的, 鑒別的方法通常用雙倒數(shù)作圖法, 或Scatchard 作圖法受體配體結(jié)合研究受體的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性受體的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)結(jié)合反應(yīng)R + LRL+IRIKdKiKi競(jìng)爭(zhēng)性Competitiveinhibition非競(jìng)爭(zhēng)性NoncompetitiveinhibitionRIIRKiRLLRKdRLIIRLKi+IRLI受

18、體配體結(jié)合研究競(jìng)爭(zhēng)性拮抗的數(shù)學(xué)表達(dá)RIRLRRTRLLRKdLRLKRdRIIRKiLKIRLKKIRRIidi(a)(b)(c)將b,c帶入a, 得11idKILKRLRT重排，得1LKIKLRTRLid受體配體結(jié)合研究競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑雙倒數(shù)圖 n圖中的圖中的I0是抑制劑濃是抑制劑濃度為零度為零, ,I1是是拮抗劑拮抗劑濃濃度為度為I1n直線的斜率為直線的斜率為n橫軸截距為橫軸截距為n縱軸截距為縱軸截距為1/RTn競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的特點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的特點(diǎn)是隨拮抗劑濃度的增是隨拮抗劑濃度的增加受體的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)加受體的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)不變不變, ,而親和性變小而親和性變小 1111RTKIRTKLRLidid

19、KIRTK1idKIRTK1idKIK11idKIK111/RT受體配體結(jié)合研究競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的Ki值 n拮抗劑Ki值稱拮抗劑的抑制常數(shù),或稱拮抗劑的解離平衡常數(shù)n有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在的平衡常數(shù)Kd表稱為表觀解離平衡常數(shù), Kd表與Kd的關(guān)系如下: n n所以n （23）nKi值是表征拮抗劑與受體結(jié)合能力的物理常數(shù),不受實(shí)驗(yàn)條件而變化 iddKIKK1表1ddiKKIK表受體配體結(jié)合研究非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗的數(shù)學(xué)表達(dá)RLIRIRLRRTRLIIRLKi11iidiiddKIKILKRLKIRLKLIRLKRLLRLKRTRLLRKdRIIRKi11iidKILKIKLRTRL重排，得受體配體結(jié)合研究非競(jìng)爭(zhēng)

20、性拮抗劑雙倒數(shù)圖 n直線的斜率為直線的斜率為n橫軸截距為橫軸截距為n縱軸截距為縱軸截距為n如果如果Ki=Ki, 則隨拮則隨拮抗劑濃度的增加受體抗劑濃度的增加受體的親和性不變的親和性不變,而受體而受體的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)變小的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)變小/ 1111RTKILRTKIKRLiid1RTKIKid1RTKIKiddiiKKIKI111diiKKIKI1111RTKIi1RTKIi受體配體結(jié)合研究非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的Ki值n拮抗劑濃度I1時(shí),雙倒數(shù)圖曲線的斜率為n拮抗劑濃度I0時(shí),雙倒數(shù)圖曲線的斜率為n所以n n （24）/)1 (RTKIKaid/RTKadiKIaa11aaIKi受體配體結(jié)合研究拮抗劑的I

21、C50值 n表征拮抗劑抑制作用強(qiáng)弱的另一個(gè)常用指標(biāo)是IC50值(或稱I50), IC50定義為抑制50受體結(jié)合反應(yīng)時(shí)所用抑制劑的濃度n IC50值大，表明拮抗劑抑制作用小，但它不是特征常數(shù)，隨實(shí)驗(yàn)所用的RT，放射配基含量不同而變化,不同抑制劑只能在同批實(shí)驗(yàn)條件下可作比較nIC50值只表明拮抗劑抑制作用大小,它不能指出抑制劑是屬于什么性質(zhì)的抑制作用 受體配體結(jié)合研究IC50值求解的實(shí)驗(yàn)方法 受體配體結(jié)合研究IC50與Ki的關(guān)系 n對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制而言，結(jié)合放射配基的表達(dá)式為n （25）nI=0時(shí)，nI=I50時(shí)，n即n整理，得n （26）)1 (LKIKLRTRLid0LKLRTRLRLd50 20

22、IRLRL)1 (250LKIKLRTLKLRTidddiKLIK150受體配體結(jié)合研究IC50與Ki的關(guān)系n由(26)式可知,當(dāng)Kd、L相同條件下，Ki正比于IC50。因此，在同一實(shí)驗(yàn)條件下，可以比較不同拮抗劑的IC50值，來(lái)判斷受體親和作用大小n(26)式中的L是反應(yīng)平衡時(shí)游離標(biāo)記配基的濃度, 如果RT值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于總標(biāo)記配基濃度LT, 結(jié)合配基濃度RL很少,那么LT近似等于L, 式中的L即可用LT代替受體配體結(jié)合研究IC50與Ki的關(guān)系利用利用IC50值確定值確定Ki值時(shí)必須注意值時(shí)必須注意: n(1) 受體的濃度受體的濃度RT遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于總標(biāo)記配基濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于總標(biāo)記配基濃度LT,否則會(huì)引起較大

23、誤差否則會(huì)引起較大誤差n(2) 拮抗劑屬于競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合拮抗劑屬于競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合, 才能利用才能利用(26)式式,所所以當(dāng)不知道拮抗劑抑制性質(zhì)時(shí)是不能利用以當(dāng)不知道拮抗劑抑制性質(zhì)時(shí)是不能利用IC50求求Ki值值n值得注意的是值得注意的是,Ki與與IC50都可判斷受體親和作用大小都可判斷受體親和作用大小,但是但是IC50只有在同一實(shí)驗(yàn)條件下只有在同一實(shí)驗(yàn)條件下,比較各拮抗劑的抑比較各拮抗劑的抑制作用制作用;而抑制劑的而抑制劑的Ki值不隨實(shí)驗(yàn)條件變化而變化值不隨實(shí)驗(yàn)條件變化而變化,只要是同一個(gè)抑制劑只要是同一個(gè)抑制劑, 即使在不同實(shí)驗(yàn)條件求得的即使在不同實(shí)驗(yàn)條件求得的仍可比較仍可比較nIC50值只表明

24、抑制作用大小，不表示拮抗劑的抑制值只表明抑制作用大小，不表示拮抗劑的抑制性質(zhì)；而雙倒數(shù)作圖法由曲線與縱橫軸相交部位或性質(zhì)；而雙倒數(shù)作圖法由曲線與縱橫軸相交部位或不相交不相交, 即可判斷拮抗劑的抑制性質(zhì)即可判斷拮抗劑的抑制性質(zhì)受體配體結(jié)合研究3.2.6 雜質(zhì)污染放射配基對(duì)結(jié)合雜質(zhì)污染放射配基對(duì)結(jié)合參數(shù)的影響參數(shù)的影響 n放射配基結(jié)合研究，通常能提供結(jié)合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如受體密度，受體親和性，結(jié)合反應(yīng)的解離速率常數(shù)等等n人們習(xí)慣的思維是只要看到密度和親和性的改變，就馬上聯(lián)想到它是否因?yàn)槭荏w生理調(diào)節(jié)功能而造成的，很少會(huì)從雜質(zhì)污染放射配基而帶來(lái)的影響受體配體結(jié)合研究3.2.6 雜質(zhì)污染放射配基對(duì)結(jié)合雜

25、質(zhì)污染放射配基對(duì)結(jié)合參數(shù)的影響參數(shù)的影響n假定: 在單位點(diǎn)受體系統(tǒng)中, 放射配基為L(zhǎng)，結(jié)合濃度為L(zhǎng)；未標(biāo)記雜質(zhì)為C，結(jié)合濃度為C；抑制劑為I，結(jié)合濃度為I。它們都屬競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用，雜質(zhì)污染比率為F ，圖a,b為理論的飽和曲線和抑制曲線，曲線中的每一點(diǎn)按下述公式計(jì)算：n n （飽和曲線）n （抑制曲線）n式中 KL=1/Kd, K=1/Ki)1/(%FLKLKLKBLLL)1/(%IKFLKLKLKBLLL受體配體結(jié)合研究雜質(zhì)污染放射配基所作的理論飽和曲線(a)和抑制曲線(b) 受體配體結(jié)合研究 擬合動(dòng)力學(xué)參數(shù) 污染比率污染比率 F放射配基放射配基 (logM) 實(shí)測(cè)實(shí)測(cè)Kd 抑制劑抑制劑 (l

26、ogM) IC50 1/Ki 0.0 () 0.25() 0.5 () 1.0 () 2.0 () 4.0 () -9.00 -9.10 -9.17 -9.28 -9.48 -9.69-5.70 -6-5.65 -6-5.60 -6-5.52 -6-5.40 -6-5.22 -6受體配體結(jié)合研究雜質(zhì)污染放射配基對(duì)結(jié)合參數(shù)雜質(zhì)污染放射配基對(duì)結(jié)合參數(shù)的影響的影響從圖a、b和上表資料可知： n1.表觀最大結(jié)合值（表觀Bmax）隨雜質(zhì)污染程度增加而減小n2.放射配基表觀Kd值隨雜質(zhì)污染程度增加而減小, 親和性變強(qiáng)n3.抑制劑IC50值隨雜質(zhì)污染程度增加而增加, 但是抑制劑的抑制常數(shù)Ki保持不變 n4.

27、雜質(zhì)污染對(duì)結(jié)合反應(yīng)的速率常數(shù)的影響關(guān)系比較復(fù)雜，純放射配基的結(jié)合反應(yīng)屬于時(shí)間一級(jí)指數(shù)函數(shù),實(shí)測(cè)結(jié)合速率常數(shù)(kobs)隨放射配基濃度增加,呈線性增加關(guān)系 受體配體結(jié)合研究實(shí)測(cè)結(jié)合速率常數(shù)對(duì)放射配基濃度依賴關(guān)系 12LTkkkobs受體配體結(jié)合研究雜質(zhì)對(duì)放射配基結(jié)合的影響取決于每個(gè)配基的相對(duì)解離速率n當(dāng)雜質(zhì)的解離速率比放射配基快得多時(shí)，放射配基當(dāng)雜質(zhì)的解離速率比放射配基快得多時(shí)，放射配基結(jié)合反應(yīng)仍然是一級(jí)指數(shù)函數(shù)關(guān)系結(jié)合反應(yīng)仍然是一級(jí)指數(shù)函數(shù)關(guān)系, 但是實(shí)測(cè)結(jié)合但是實(shí)測(cè)結(jié)合速率常數(shù)不再是線性依賴放射配基濃度速率常數(shù)不再是線性依賴放射配基濃度n當(dāng)雜質(zhì)的解離速率常數(shù)接近放射配基時(shí)，實(shí)測(cè)速率當(dāng)雜質(zhì)的解

28、離速率常數(shù)接近放射配基時(shí)，實(shí)測(cè)速率常數(shù)值仍然是不依賴于放射配基濃度，但是曲線也常數(shù)值仍然是不依賴于放射配基濃度，但是曲線也不再是一級(jí)指數(shù)函數(shù)不再是一級(jí)指數(shù)函數(shù)n當(dāng)雜質(zhì)的比率小于當(dāng)雜質(zhì)的比率小于0.2時(shí)，實(shí)測(cè)結(jié)合速率常數(shù)時(shí)，實(shí)測(cè)結(jié)合速率常數(shù)(kobs)對(duì)放射配基濃度曲線呈線性或近乎線性，此時(shí)含雜對(duì)放射配基濃度曲線呈線性或近乎線性，此時(shí)含雜質(zhì)與不含雜質(zhì)的表觀質(zhì)與不含雜質(zhì)的表觀Kd和最大結(jié)合率和最大結(jié)合率(Bmax)差別是差別是難以區(qū)別的難以區(qū)別的n這些結(jié)果對(duì)放射配基結(jié)合分析帶來(lái)影響，但也為實(shí)這些結(jié)果對(duì)放射配基結(jié)合分析帶來(lái)影響，但也為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析有更多的選擇。如果實(shí)驗(yàn)所得的驗(yàn)結(jié)果的分析有更多的選擇

29、。如果實(shí)驗(yàn)所得的Kd和和Bmax值比期望的要低，特別是實(shí)測(cè)的結(jié)合速率常數(shù)值比期望的要低，特別是實(shí)測(cè)的結(jié)合速率常數(shù)變成不依賴于放射配基濃度時(shí)，此時(shí)可考慮放射配變成不依賴于放射配基濃度時(shí)，此時(shí)可考慮放射配基中是否存在未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性雜質(zhì)基中是否存在未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性雜質(zhì)受體配體結(jié)合研究3.3 受體與配基相互結(jié)合的受體與配基相互結(jié)合的二態(tài)模型二態(tài)模型 n 隨受體結(jié)構(gòu)、藥理學(xué)及分子生物學(xué)知識(shí)不斷更新和發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的占領(lǐng)理論顯得過(guò)于簡(jiǎn)單化, 不能適應(yīng)現(xiàn)代藥理學(xué)的需要n 近些年來(lái)受體領(lǐng)域中最引人關(guān)注的概念是固有受體活性 (constitutive receptor activation)和反向激動(dòng)劑效應(yīng) (inv

30、erse agonism)的發(fā)現(xiàn)，所以需要建立新的理論模型和實(shí)踐加以解釋和證明受體配體結(jié)合研究3.3.1 受體活化的二態(tài)模型受體活化的二態(tài)模型 n 借用Monod-Wyman-Chaneux酶的別構(gòu)理論解釋受體和配基結(jié)合后引起受體構(gòu)象改變導(dǎo)致受體活化的機(jī)制 受體配體結(jié)合研究反應(yīng)式 R + L R L k 1 k 2 單態(tài)單態(tài)二態(tài)二態(tài)受體配體結(jié)合研究受體分子的構(gòu)象 n 反應(yīng)系統(tǒng)中天然受體允許存在兩種狀態(tài)受體, 即非活化態(tài)受體(R)和活化態(tài)受體(R*)n 多 數(shù) 受 體 處 于 非 活 性 態(tài) 組 成 的 靜 息 態(tài)(quiescent or resting state)系統(tǒng), 少數(shù)受體處于活性態(tài)

31、組成的是活性態(tài)(active state)系統(tǒng)n 控制這兩種狀態(tài)受體數(shù)量分布的常數(shù)稱平衡常數(shù)(亦稱別構(gòu)常數(shù))L。n 激動(dòng)劑A對(duì)R的親和常數(shù)(或解離平衡常數(shù))是KA, 激動(dòng)劑A對(duì)R*的親和常數(shù)是KA*受體配體結(jié)合研究二態(tài)模型的數(shù)學(xué)表達(dá)*RRL ARARKA*ARARKA體系中的受體總量由4種形式組成：*ARARRRRt活性受體的分?jǐn)?shù)（fR*)為：)1 ()1 (*AKKLLKAKRARRfAAAAtR(27)受體配體結(jié)合研究根據(jù)方程（27），以fR*對(duì)激動(dòng)劑A濃度作圖曲線中點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的配基濃度代表配基結(jié)合的表觀親和常數(shù)AAAappKLKLKK/1)1 (*受體配體結(jié)合研究如何估算受體的KA 和KA

32、*值n曲線的最大值fmax ：A, fA* = fmaxfmax=1/(1+L KA*/ KA)n曲線的最小值fmin ：A0, fA* = fmin fmin=1/(1+L)n表觀親和性： Kapp = KA* (1+L)/(1+L KA*/ KA)n因此 Kapp = KA* fmax / fmin受體配體結(jié)合研究如何估算受體的KA 和KA*值n由實(shí)驗(yàn)曲線求得曲線的最大值fmax和最小值fminn根據(jù)下列公式計(jì)算KA* = Kapp fmin / fmaxL = (1 fmin)/ fminKA = KA*L fmax /(1 fmax )受體配體結(jié)合研究受體二態(tài)模型n激動(dòng)劑的親和性和效能

33、之間有十分密切的關(guān)系，激動(dòng)劑效應(yīng)的強(qiáng)度直接取決于KA*/ KA值n激動(dòng)劑按其性質(zhì)可分為n完全激動(dòng)劑(full agonist)n部分激動(dòng)劑n休止激動(dòng)劑(silent agonist)n部分反向激動(dòng)劑n完全反向激動(dòng)劑（inverse agonist)受體配體結(jié)合研究受體二態(tài)模型n完全激動(dòng)劑對(duì)活性態(tài)受體有優(yōu)先親和結(jié)合作用n休止激動(dòng)劑對(duì)非活性態(tài)和活性態(tài)受體有相同的親和性n反向激動(dòng)劑對(duì)非活性態(tài)受體有優(yōu)先親和結(jié)合作用 受體配體結(jié)合研究3.3.2 受體的固有活性受體的固有活性(constitutive activity) n一些天然受體在無(wú)激動(dòng)劑的情況下, 表現(xiàn)出相當(dāng)高的生化反應(yīng)行為如Na+的移動(dòng),此受體的活性稱天然受體的固有活性 n受體的固有活性是天然自發(fā)產(chǎn)生的 受體配體結(jié)合研究受體的固有活性受體的固有活性nLefkowitz實(shí)驗(yàn)