實(shí)驗(yàn)十血液轉(zhuǎn)氨酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定教學(xué)內(nèi)容

1、實(shí)驗(yàn)十、血液轉(zhuǎn)氨酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）活力的測(cè)定（實(shí)驗(yàn)：肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定）（本實(shí)驗(yàn)分2個(gè)實(shí)驗(yàn)完成：一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 二、測(cè)酶活力和總結(jié)?；蚓妥龆涂梢裕灸康暮鸵蟆?、 了解轉(zhuǎn)氨酶在代謝過(guò)程中的重要作用及其在臨床診斷中的意義，2、 學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定的原理和方法。3、 熟悉分光光度計(jì)的使用。【原理】生物體內(nèi)廣泛存在的氨基移換酶也稱(chēng)轉(zhuǎn)氨酶，能催化-氨基酸的-氨基與-酮基酸的-酮基互換，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中間代謝過(guò)程中有重要作用。轉(zhuǎn)氨酶的最適ph接近7.4，它的種類(lèi)甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（簡(jiǎn)稱(chēng)谷草轉(zhuǎn)氨酶）和谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（簡(jiǎn)稱(chēng)谷丙轉(zhuǎn)氨酶）的活力最強(qiáng)。它們催

2、化的反應(yīng)如下。正常人血清中只含有少量轉(zhuǎn)氨酶。當(dāng)發(fā)生肝炎，心肌梗死等病患時(shí)，血清中轉(zhuǎn)氨酶活力常顯著增加，所以在臨床診斷上轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定有重要意義。測(cè)定轉(zhuǎn)氨酶活力的方法很多，本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法。谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用于丙氨酸-酮戊二酸后，生成的丙酮酸與2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。丙酮酸2，4-二硝基苯腙加堿處理后呈棕色，其吸收光譜的峰為439530nm，因此在波長(zhǎng)520nm處吸光度度增加的程度與反應(yīng)體系中丙酮酸與-酮戊二酸的摩爾比基本呈線性關(guān)系，故可藉可用分光光度法測(cè)定。從丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可計(jì)算酶的活力?！驹噭┖推鞑摹恳弧⒃噭?.試管及試管架2.吸管3.恒溫水

3、浴4.分光光度計(jì)5、移液管6、電子天平7、研缽8、容量瓶9、冰箱二、器材1、標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸溶液標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸（500g/ml）：準(zhǔn)確稱(chēng)取純化的丙酮酸鈉62.5mg，溶于ph7.4 0.1m 的pbs中，定容到100ml。現(xiàn)用現(xiàn)配。2、谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物：0.90g l-丙氨酸，29.2mg -酮戊二酸，先溶于ph7.4 0.1m 的pbs中。然后用1 m naoh調(diào)節(jié)ph到7.4，再用ph7.4 0.1mol/l的pbs定容到100ml，貯存于冰箱中，可使用1周。3、0.1mol/l ph7.4 pbs：稱(chēng)取13.97g k2hpo4和2.69g kh2po4溶于蒸餾水中，定容到1000ml。4、0.02

4、% 2.4-二硝基苯肼溶液：稱(chēng)取20mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/l hcl中。把錐形瓶放在暗處并不時(shí)搖動(dòng)（或加熱溶解），待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，用1mol/l hcl定容到100ml。濾入棕色玻璃瓶?jī)?nèi)置 冰箱內(nèi)保存。5、0.4mol/l naoh ：稱(chēng)取16g naoh定容到1000ml。6、0.9%生理鹽水：稱(chēng)取0.9gnacl，定容到100ml?！静僮鞣椒ā恳弧?biāo)準(zhǔn)曲線的給制：取6支試管，分別標(biāo)上0，1，2，3，4，5六個(gè)號(hào)。按下表所列的次序添加各試劑。2,4-硝基苯肼可與有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的-酮戊二酸與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)，生成-酮戊二酸苯腙。因

5、此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，須加入一定量的底物，（內(nèi)含-酮戊二酸）以抵消由-酮戊二酸產(chǎn)生的消光影響。先將試管置于37恒溫水浴中保溫10min以平衡內(nèi)外溫度。向各管內(nèi)加入0.5ml2，4-二硝基苯肼溶液后再保溫20min，最后，分別向各管內(nèi)加入0.4mol/l氫氧化鈉溶液5ml。在室溫下靜置30min，以0號(hào)管作空白，測(cè)定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩爾數(shù)為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。（總圖如下）二、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定（學(xué)生只做這個(gè)）1、樣品的制備（集體制備）將雞處死，取肝臟后用生理鹽水沖洗，濾紙吸干后，稱(chēng)取0.5g 肝臟，剪成小塊，加入預(yù)冷（冰水或冰箱中）的ph7.4的pbs 4

6、.5ml，在冰水浴中制成10%的勻漿， 4000rpm冷凍離心10分鐘后保存在冰水中備用。（一組按10ml算：10ml*n）2、酶活力的測(cè)定：取6支試管，按下表操作：測(cè)定管（a）標(biāo)準(zhǔn)管（s）對(duì)照管（b）空白管谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物（ml）0.50.537水浴5min肝勻漿（或血清）（ml）0.1丙酮酸0.1ml0.1水0.1ml混勻后，37水浴準(zhǔn)確保溫30min2,4-二硝基苯肼（ml）0.50.50.50.5谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物（ml）0.50.5混勻后，37水浴準(zhǔn)確保溫20minnaoh（ml）5.05.05.05.0混勻后，靜置10mina5203、計(jì)算：每毫升肝臟勻漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位： d=(a-

7、b) 500/s2.5=(a-b) 200/s d:每毫升肝臟勻漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位(u/ml) 式中 a:樣品管吸光度值 b:對(duì)照管吸光度值 s:標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值 500:標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸溶液 2.5濃度谷丙轉(zhuǎn)氨酶的換算單位系數(shù)【注意事項(xiàng)】1. 在測(cè)定sgpt時(shí)，應(yīng)事先將底物、血清在37水浴中保溫，然后在血清管中加入底物，準(zhǔn)確記時(shí)。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)值在20500u是準(zhǔn)確可靠的，超過(guò)500u時(shí)，需將樣品稀釋。3. 轉(zhuǎn)氨酶只能作用于l氨基酸，對(duì)d氨基酸無(wú)作用。實(shí)驗(yàn)室多用dl氨基酸（較l氨基酸價(jià)廉），若用l氨基酸，則用量減半。4. 溶血標(biāo)本不宜使用，因血細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶活力較高，會(huì)影響測(cè)定效果。5. 血清樣

8、品的測(cè)定需在顯色后30分鐘內(nèi)完成。6 酶在37下與底物作用30min后，以能產(chǎn)生2.5g的丙酮酸為一個(gè)活力單位。7 -酮戊二酸也能產(chǎn)生苯腙，但在520nm下遠(yuǎn)較丙酮酸的低。8 -酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼對(duì)顯色有一定干擾，注意添加量瓊州學(xué)院實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目卡生命科學(xué) 系 生化 實(shí)驗(yàn)室 開(kāi)設(shè)日期_年_月_日實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目血液轉(zhuǎn)氨酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）活力的測(cè)定面向?qū)I(yè)課程性質(zhì)1、必修2、選修實(shí)驗(yàn)類(lèi)型1、還未開(kāi)設(shè)的新實(shí)驗(yàn)2、手段更新的實(shí)驗(yàn)3、已開(kāi)設(shè)過(guò)的實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)數(shù)4實(shí)驗(yàn)分組概況所用主要儀器名 稱(chēng)型號(hào)規(guī)格數(shù)量名 稱(chēng)型號(hào)規(guī)格數(shù)量試管及試管架若干冰箱1移液管各規(guī)格若干恒溫水浴箱1分光光度計(jì)6所用主要藥品名 稱(chēng)純度級(jí)別數(shù)量名 稱(chēng)純度級(jí)別數(shù)量0.1mol/l磷酸緩沖液ph7.4磷酸氫二鉀30ml*n氯化鈉0.9%500ml磷酸二氫鉀2，4-二硝基苯肼0.02%20ml*n丙酮酸鈉2.