細(xì)菌學(xué)檢驗技術(shù)

1、細(xì)菌實驗室完成標(biāo)本的接種、孵育、分離鑒定和藥敏試驗等。蘇敬良中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院1. 安裝嚴(yán)密的門窗，以防止外部污濁的空氣和昆蟲進(jìn)入室內(nèi)污染環(huán)境。室內(nèi)禁用電扇（根據(jù)需要可安裝空調(diào)）。2. 必須安裝有供空氣消毒的紫外線燈，置于離工作臺面1m 的高度，每天開始工作前照射20分鐘。3. 分別備有洗手和標(biāo)本處理水源及消毒劑水盆。4. 常備消毒劑，對菌液污染的臺面和地面進(jìn)行消毒處理。5. 室內(nèi)臺面每天用消毒劑進(jìn)行消毒，地面每周至少消毒1次。6. 室內(nèi)對接收的標(biāo)本和消毒過的器具要分別指定地點放置，特別是對無菌和有菌器具要明顯隔開。用過的試管、平皿必須及時高壓滅菌處理。7. 不能或不便高壓滅菌的標(biāo)本和廢棄

2、物品必須焚化處理8. 配備必要的消防設(shè)備 溫箱、高壓滅菌設(shè)備、CO2培養(yǎng)設(shè)備 厭氧培養(yǎng)設(shè)備 冰箱、顯微鏡、離心機、天平、 pH計、 接種器具、火焰燈 各種玻璃器皿、各種塑料器皿孵育溫箱 可調(diào)溫度范圍為室溫至60，真菌則為25- 26顯微鏡 普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、熒光顯微鏡CO2培養(yǎng)設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱 燭罐（缸 ）3%-5% CO2 化學(xué)試劑產(chǎn)氣法：按每升體積加枸櫞酸0.33g、碳酸氫鈉0.37g 兩試劑混合于小燒杯置于罐中加入10ml蒸餾水立即將罐封閉。 基本設(shè)備和器具厭氧培養(yǎng)設(shè)備厭氧箱、厭氧罐和厭氧袋 造成無氧環(huán)境有物理方法和化學(xué)方法： 物理方法抽氣-換氣： 真空泵將厭氧罐抽氣至負(fù)壓

3、80-93Pa，然后充入混合氣體（CO2 10%、H210% 、N2 80%）或氮氣，再抽氣換氣，反復(fù)3次，最后充入混合氣體即為無氧環(huán)境。 化學(xué)方法：在厭氧罐內(nèi)放盛催化劑的容器，內(nèi)裝化學(xué)試劑為硼氫化鈉和碳酸氫鈉-枸櫞酸合劑。在封閉厭氧罐之前，加水到化學(xué)試劑中，立即封閉，化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生氫氣和CO2。 l物理和化學(xué)方法提供的氫氣經(jīng)催化劑鈀的作用，與氧氣化合成水，把氧除去，造成無氧環(huán)境。l厭氧設(shè)備中放置氧化還原指示劑，提示是否為無氧狀態(tài)，如美藍(lán)指示劑，無氧時，指示劑不顯顏色，有氧時，為藍(lán)色。接種器具 接種環(huán)和接種針：鎳鉻絲或300W電爐絲制備 火焰燈：煤氣燈或酒精等 平皿：60、90、100mm 高壓

4、滅菌設(shè)備 冰箱和冷藏柜革蘭氏染色抗酸染色 堿性復(fù)紅法（Ziehl-Neelsen法）鞭毛染色墨汁莢膜染色培養(yǎng)基按其性質(zhì)和用途不同，可以分為以下幾類： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(basic medium) 含有細(xì)菌所需的基本營養(yǎng)成分，可供大多數(shù)細(xì)菌生長。最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是肉浸液，即新鮮的牛肉浸出液，加入適當(dāng)?shù)牡鞍纂?、氯化鈉、磷酸鹽，調(diào)節(jié)pH7.2-7.6。 營養(yǎng)培養(yǎng)基營養(yǎng)培養(yǎng)基(Nutrient medium)(Nutrient medium)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一些其它營養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏、生長因子等可供營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌生長。又稱增菌培養(yǎng)基(Enrichment medium)。 鑒別

5、培養(yǎng)基（鑒別培養(yǎng)基（Differential mediumDifferential medium）利用各種細(xì)菌分解糖類和蛋白質(zhì)的能力及其代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物，觀察細(xì)菌在其生長后分解底物的作用如何，從而鑒別細(xì)菌。 選擇性培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)基（selective mediumselective medium）在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，使之抑制某一類細(xì)菌生長，而有利于另一類細(xì)菌生長，從而將后者選擇出來。 厭氧培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基(anaerobic medium) (anaerobic medium) 專供厭氧菌的分離、培養(yǎng)和鑒別用 進(jìn)行厭氧培養(yǎng)的辦法，一是將普通培養(yǎng)基放在無氧

6、環(huán)境中培養(yǎng)，或者在培養(yǎng)基中加入還原劑以降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢，并在培養(yǎng)基表面用凡士林或石蠟封住，與空氣隔絕，使培養(yǎng)基本身成為無氧的環(huán)境，這就是厭氧培養(yǎng)基。如皰肉培養(yǎng)基（cooked meat medium）生化鑒定試驗l氨基酸或含氮物質(zhì)的分解試驗l糖類的分解試驗l有機酸鹽利用試驗l生長抑制試驗基本診斷血清 沙門氏菌診斷血清 致病性大腸桿菌診斷血清 鏈球菌Lancefield診斷血清一、建立正確、快速的檢驗方法 建立正確快速的分離和鑒定方法為達(dá)到這一目的，臨床細(xì)菌室應(yīng)作到以下幾點：1.選擇國際公認(rèn)的分離及鑒定參考方法和試劑作為實驗室的常規(guī)試驗2. 在分離和鑒定的各步驟設(shè)立完整的室內(nèi)質(zhì)量監(jiān)控體系

7、3 建立臨床菌庫 建立正確的藥敏試驗方法 選擇正確的方法 藥敏結(jié)果的審核和藥敏規(guī)則的標(biāo)準(zhǔn)化 二、與臨床建立密切聯(lián)系 建立帶有評論和注釋的細(xì)菌學(xué)報告 制定標(biāo)本采集指南和規(guī)則 參與治療方案的制定 獲取臨床資料 及時將開展新試驗、新技術(shù)與臨床人員溝通。三、 不斷提高細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)理論水平實驗室前的質(zhì)量控制 制定標(biāo)本采集指南 包括標(biāo)本的采集、運送和采集時間等。 標(biāo)本接種培養(yǎng)前的質(zhì)量控制 檢查采集的標(biāo)本是否合格 分離培養(yǎng)的質(zhì)量控制 標(biāo)本采集、運送、分離培養(yǎng)基的質(zhì)量和是否及時接種 培養(yǎng)基的質(zhì)量控制 常用儀器的質(zhì)量控制 培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、血液分析系統(tǒng) 藥物敏感試驗的質(zhì)量控制 染色液及染色方法的質(zhì)

8、量控制 l校正pH l分裝l質(zhì)量檢查 無菌檢驗、效果檢驗l保存（1周內(nèi)）高壓蒸汽滅菌壓力與溫度的關(guān)系壓力kg/cm2 磅 溫度（） 0.35 5 108 0.70 10 116 1.05 15 121 1.40 20 127一、重視標(biāo)本送檢申請單 記錄標(biāo)本的來源、送檢的目的、臨床診斷（主要癥狀等），認(rèn)真做好登記工作。 二、正確采集和處理標(biāo)本 注意事項 采取血液、腦脊髓液或穿刺液時應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，避免雜菌污染。 糞便、肛拭子、鼻咽拭子應(yīng)放置與滅菌容器內(nèi)盡可能避免標(biāo)本外細(xì)菌混入。 應(yīng)在使用抗菌素前采集標(biāo)本。 盛標(biāo)本的容器不得用消毒劑或酸堿類消毒處理。 盡快送檢，或根據(jù)分離病原的不同保存于適當(dāng)?shù)臏囟?/p>

9、條件下，如冷凍等。 采集、包裝和送檢過程中要注意安全采集、包裝和送檢過程中要注意安全三、選擇適宜的培養(yǎng)基是分離出病原菌的重要環(huán)節(jié)四、認(rèn)真區(qū)分污染菌觀察菌落是否在劃線上每次培養(yǎng)需要做無菌對照 結(jié)合擬培養(yǎng)的細(xì)菌生長特點去對照判斷（菌落的形狀、大小、色澤、邊緣、透明度、濕潤度、溶血現(xiàn)象等）注意觀察培養(yǎng)時間，如布魯氏菌、支原體、鉤體、結(jié)核分枝桿菌的生長緩慢。涂片染色檢查，觀察是否與目的菌一樣。分類學(xué)的目的分類學(xué)的目的在于將所有的生物按其相似性進(jìn)行歸群，并依據(jù)各群間的親緣關(guān)系的密切程度排列成一個等級系統(tǒng)，這個系統(tǒng)應(yīng)盡可能反映各生物種群間自然的系統(tǒng)演化關(guān)系，每個種群在這個系統(tǒng)中都應(yīng)有正確位置。命名命名是按

10、照國際準(zhǔn)則給每個物種一個（唯一的）公認(rèn)的名稱鑒定鑒定則是確定一個新分離物的特征，并將其歸屬于已存在的分類單位的過程Bacteria domain has been subdivided into 23 phyla (28 classes) with the exception of Cyanobacteria and Actinobacteria 獲得并確論細(xì)菌的純培養(yǎng)； 按照從大（如科或?qū)伲┑叫。ㄈ绶N）及至特異性的范疇順序測定細(xì)菌的各種特性； 正確分析所有有價值的結(jié)果以便確定所鑒定細(xì)菌的屬種可能性； 自始至終用相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實驗操作和判斷結(jié)果； 以盡可能少的實驗及結(jié)果作出細(xì)菌鑒定； 必要時通

11、過比較自己分離得到的菌株與標(biāo)準(zhǔn)的參考菌株的實驗結(jié)果，驗證本實驗室所作實驗條件是否可靠和鑒定方案是否正確。lPURE CULTURES why? if the culture is not pure the results will be a composite from all of the different organisms in the culture and thus can be very misleading.lCriterions of purity similar colonies exception: S-R variation, capsular variation, p

12、igmented/nonpigmented variation Morphological similarity Purity of culturesRough and smooth colony types of P. luteola after 48 hours. Smooth and Rough Colony Variants of Shigella sonneiGolden pigment-producing staphylococci (left) Pseudomonas aeruginosa colonies on agar Capsule surrounding cells of

13、 Streptococcus species 根據(jù)生物的共性和特性進(jìn)行分門別類。將生物的基本特性分為主要和次要，然后依據(jù)主次順序編制雙岐圖表和檢索表，一次一次往下分，指導(dǎo)最小區(qū)分單位。由于分類中選擇將定力強的生化特征為基礎(chǔ)，所以傳統(tǒng)分類也成為偏重性鑒定方法。主要一形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性等表觀分類學(xué)指征對微生物分類單位進(jìn)行描述分類細(xì)菌的生理、生化特征 1. 細(xì)菌的著色性和形態(tài)： G-，G+ 球菌、桿菌、弧菌、螺菌等 2. 生物化學(xué)特征 根據(jù)細(xì)菌的營養(yǎng)方式、代謝產(chǎn)物特點和對分子氧的需求，分別將細(xì)菌分為氧化型、發(fā)酵型和氧化兼發(fā)酵型； 厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌 與傳統(tǒng)分類不同，樹枝分類以“

14、等重要原則”為理論基礎(chǔ)，細(xì)菌的生化特征不分主次、總體比較全面分析。選擇100-200項生理生化指標(biāo)，比較結(jié)果以相似系數(shù)或相似百分?jǐn)?shù)表示。 相似系數(shù)=相同特征數(shù)/（相同特征數(shù)特征+不同特征數(shù) 根據(jù)相似系數(shù)大小，判斷細(xì)菌種間的親緣性 數(shù)值分類4Numerical taxonomic methods further improved the validity of phenotypic identification by further increasing the numberof tests used, usually to 100200, and by calculating coeffici

15、entsof similarity between strains and speciesl Although there is no similarity value that defines a taxospecies (species determined by numerical taxonomy), 80% similarity is commonly seen among strains in a given taxospecies.l分子分類 DNA堿基組成（G+C mol%)分析 DNA-DNA分子雜交 DNA指紋技術(shù)l1. G+C含量測定l Tm值測定 DNA熔解溫度，指把D

16、NA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中GC含量越高，Tm值越高，成正比關(guān)系。 l評價標(biāo)準(zhǔn)是核酸所吸收的光線量達(dá)到其所增加吸收260nm光線的量的兩倍達(dá)到的溫度， l當(dāng)核酸達(dá)到Tm值時，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量隨解體程度而增加，直至完全解體。0.1SSC G+C mol%=2.44Tm-69.31 SSC G+C mol%=2.08Tm-106.4 Ribotyping is a method that can identify and classify bacteria based upon differences in rRNA(16S

17、 and 23S rRNA). DNA is extracted from a colony of bacteria and then restricted into discrete-sized fragments. The DNA is then transferred to a membrane and probed with a region of the rRNA operon to reveal the pattern of rRNA genes. The pattern is recorded, digitized and stored in a database. It is

18、variations that exist among bacteria in both the position and intensity of rRNA bands that can be used for their classification and identification. Random insertion of transposon confirmed by Southern blotDiagram of Southern blot脈沖場凝膠電泳(PFGE)分析大分子DNA在電場作用下通過孔徑小于分子大小的凝膠時，將會改變卷曲的構(gòu)象，沿電場方向伸直，與電場平行從而才能通過

19、凝膠。此時，大分子通過凝膠的方式相同，遷移率無差別(也稱“極限遷移率”)，不能分離。脈沖場凝膠電泳技術(shù)解決了這一難題，它應(yīng)用于分離純化大小在10-2000kb 之間的DNA 片段。這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進(jìn)行的，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間顯著地依賴于分子大小，DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時間越長，重新定向的時間也越長，于是在每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少，因而在凝膠中移動越慢。反之，較小的DNA 移動較快，于是不同大小的分子被成功分離。利用微生物多種不同的信息，包括表型的、基因型的和系統(tǒng)發(fā)育的信息，綜合研究微生物分類和系統(tǒng)進(jìn)化的過程。幾乎包

20、括現(xiàn)代分類中所有方面，如傳統(tǒng)分類、化學(xué)分類、分子分類、數(shù)值分類等。 可用于所有水平上的分類單位的描述和定義。l屬通常包含具有某些共同特征或關(guān)系密切的種。lDNA的G+C mol%10%-12%及16S rRNA的序列同源性95%的種可歸為一個屬。種和屬是一個物種必須具有的屬性，一個生物體的名稱則是屬名加種名的形容詞。選擇16S rRNA gene 的理由： 1、核糖體作為蛋白質(zhì)合成的必要場所 ， 16S rRNA gene 存在于所有生物的細(xì)胞之中并執(zhí)行相同的功能； 2、具有分子鐘特點，分子序列變化緩慢，能跨越整個生命進(jìn)化過程. 3、分子中含有進(jìn)化速度不同的區(qū)域，可用于進(jìn)化程度不同的生物的系統(tǒng)

21、發(fā)育研究 Woese等根據(jù)16SrRNA序列構(gòu)建的無根宇宙生命進(jìn)化樹ArchaebacteriaBacteriaEukaryaThree Domains ProposallThe rate of change of 16S rRNA gene may not be identical for all organisms (different taxonomic groups could have different rates of change), and the rates could be different at different sites throughout the 16S r

22、RNA gene. There are so-called “hot spots” which show larger numbers of mutationslThe 16S rRNA gene sequence has been determined for a large number of strains. GenBank, the largest databank of nucleotide sequences, has over 20 million deposited sequences, of which over 90,000 are of 16S rRNA gene. Th

23、is means that there are many previously deposited sequences against which to compare the sequence of an unknown strain.5316S (1.54 kb)The precursor of rRNAtRNA23S(2.9kb)5S(0.12kb)spacersl原核和真核生物的核糖體比較 特性 原核生物 真核生物 大小 70S 80S 小亞基 30S 40S 蛋白質(zhì)數(shù)量 約21 約30 RNA堿基數(shù) 16S (1500bp) 18S(2300bp) 大亞基 50S 60S 蛋白質(zhì)數(shù)量

24、 約34 約50 RNA堿基數(shù) 23S (2900bp) 28S(4200bp) 5S (120bp) 5.8S(160bp) 5S(120bp)Phylogenetic neighbour-joining tree of the 16 S rRNA gene sequences Bacterial identification based on the phylogenetic analysis lUniversal primers are usually chosen as complementary to the conserved regions at the beginning of

25、 the gene and at either the 540-bp region or at the end of the whole sequence (about the 1,550-bp region), and the sequence of the variable region in between is used for the comparative taxonomy. l化學(xué)分類 研究微生物細(xì)胞不同的化學(xué)特性，并利用這些特性進(jìn)行分類和鑒定包括細(xì)胞壁化學(xué)組分、脂肪酸、磷酸類脂、甲基萘醌、全細(xì)胞蛋白及核糖體蛋白電泳分析等Gas chromatography-mass spect

26、rometry lUniversal Systems for Identifying a Pure Cultureautomated cellular fatty acid (CFA) analysis 4 saponifying the fatty acids 4 converting them to their volatile methyl esters 4 separating and quantifying each fatty acid by gas-liquid chromatography. 4 computer compare and calculates the best

27、match or matches for the isolate.Drawbacks:分子分型舉例：禽多殺性巴氏桿菌基因分型多位點串聯(lián)重復(fù)序列分析脈沖場凝膠電泳分型和流行病學(xué)分析l病毒的分離l 要分離到病毒，首先要采集到含有足夠量活病毒的標(biāo)本，并且要找到敏感的組織或動物。 l 標(biāo) 本 的 采 集 和 運 送 標(biāo) 本 的 采 集 和 運 送 s p e c i m e n s p e c i m e n collection,transport collection,transport l 為了保證采集足夠量活病毒標(biāo)本，必須注意三個問題：l1.采集何種標(biāo)本l一般是根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)進(jìn)行分析、

28、初步推斷可能是哪一種病，再決定采集何種標(biāo)本。l用拭子采集到的標(biāo)本，應(yīng)立即浸泡于肉湯中，有的病毒不穩(wěn)定，如單純皰疹病毒、流感病毒等，應(yīng)盡可能早地接種到敏感動物和組織中。l 血液標(biāo)本有的須加抗凝劑，有的不加，如乙腦病毒主要存在于血清中，全血或血清接種均可；有的病毒主要吸附在白細(xì)胞上或紅細(xì)胞上，因此采血時加抗凝劑可提高分離率。應(yīng)避免用檸檬酸鈉之類的抗凝劑，因動物接種不易耐受。一般是1/1000 的肝素少許或把血液放入含有消毒玻璃球的瓶內(nèi)震蕩脫纖維。l2.采集標(biāo)本時間l 一般在發(fā)病的早期(acute phase),越早越好，晚期體內(nèi)易產(chǎn)生抗體，病毒成熟釋放減少, 分離病毒比較困難。同時晚期可能發(fā)生交叉

29、感染，增加判斷困難。尸體標(biāo)本最好在死后6小時內(nèi)采集，否則病毒容易死亡。l3.標(biāo)本的運送l由于大多數(shù)病毒對熱不穩(wěn)定，以立即接種為好，如需運送或保存,必須在冷的環(huán)境,48小時內(nèi)能送至實驗室，一般在50%中性甘油中，4保存最好, 由于凍化過程能使病毒破壞，如需要保存較長時間才能進(jìn)行檢查，最好放在-20以下,干冰或液氮保存。l標(biāo)本的處理主要有兩方面：除菌和將組織標(biāo)本中的病毒游離出來。 l1.除菌處理l采集標(biāo)本應(yīng)盡可能無菌操作，但有些標(biāo)本，如大便、鼻拭子等，本身常帶雜有大量的細(xì)菌必須除菌。l抗生素處理?？股氐臐舛燃白饔脮r間視標(biāo)本而定，4過夜。l可以10000r/min離心20分鐘，大部分細(xì)菌和雜質(zhì)可以

30、去除l對乙醚有抵抗的病毒如腸病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、痘病毒等可以加等量乙醚4過夜除菌。 l2.研磨和稀釋l 用腦、脊髓等組織作為分離病毒的標(biāo)本時，為了游離細(xì)胞內(nèi)病毒，應(yīng)該在研磨器充分研磨。稀釋液常用pH7.2-7.6的肉湯、10%脫脂奶生理鹽水、0.5%水解乳蛋白Hanks液，將組織制成10%懸液，中性甘油保存的標(biāo)本，如果需要作腦內(nèi)注射，應(yīng)以生理鹽水洗2-3次在研磨，磨好的標(biāo)本2000r/min離心20分鐘，用上清液接種動物和細(xì)胞。如果懷疑有細(xì)菌污染，應(yīng)該在除菌處理。 l 標(biāo)本接種于哪一種動物、雞胚或細(xì)胞，以及選擇哪一種途徑，主要決定于病毒的嗜性。一般嗜神經(jīng)性病毒主要動物腦內(nèi)接種；嗜

31、呼吸道病毒接種動物鼻腔及雞胚尿囊腔；嗜皮膚性病毒接種動物皮內(nèi)、皮下或雞胚絨毛尿囊膜；嗜內(nèi)臟病毒可接種動物的腹腔、靜脈、肌肉等。近年來，由于組織培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，多數(shù)病毒都能夠用組織培養(yǎng)進(jìn)行分離鑒定。l1.動物接種l 主要觀察有無發(fā)病癥狀。l 用動物分離病毒，要注意動物本身的病毒被分到的可能，即應(yīng)該排除動物自發(fā)性病毒的可能。所以對實驗動物的健康狀況應(yīng)該有所了解。盡量選用級別較高的實驗動物。l2.雞胚接種l 雞胚羊膜腔和尿囊腔分離病毒，一般是測定其血凝素的產(chǎn)生，如流感病毒、新城疫病毒；絨毛尿囊膜接種主要觀察其痘斑。卵黃囊接種主要觀察雞胚的死亡。 l3.組織培養(yǎng)上的表現(xiàn)l 病毒感染可以引起特殊的細(xì)胞病變可以歸納為5種類型l腸道病毒 細(xì)胞圓縮、小、分散、不聚集、全部細(xì)胞受破壞l 腺病毒 細(xì)胞腫大、顆粒增多、病變細(xì)胞聚集成葡萄狀l 蟲媒病毒 細(xì)胞圓縮、聚集、