高效液相色譜_2012

1、分析化學(xué)分析化學(xué)(下，第三版下，第三版)高效液相色譜法：高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法色譜實驗和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、概述一、概述二、基本理論及條件選擇二、基本理論及條件選擇三、各類高效液相色譜法三、各類高效液相色譜法四、影響分離的因素四、影響分離的因素五、高效液相色譜儀五、高效液相色譜儀六、超效液相色譜技術(shù)簡介六、超效液相色譜技術(shù)簡介七、七、hplc定量分析方法學(xué)考察定量分析方法學(xué)考察八、八、hplc應(yīng)用應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、一、hplc與經(jīng)典與經(jīng)典lc區(qū)別區(qū)別二、二、hpl

2、c與與gc差別差別三、高效液相色譜儀流程圖三、高效液相色譜儀流程圖四、特點四、特點一、一、hplchplc與經(jīng)典與經(jīng)典lclc區(qū)別區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段1經(jīng)典經(jīng)典lc：僅做為一種分離手段：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動相 柱效低（h，n） 分析周期長 無法在線檢測2hplc：分離和分析：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑10m（球形，勻漿裝柱） 高壓輸送流動相 柱效高（h，n） 分析時間大大縮短 可以在線檢測二、二、hplchplc與與gcgc差別差別相同：兼具分離和分析功能，均可

3、以在線檢測相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測 主要差別：分析對象的差別和流動相的差別主要差別：分析對象的差別和流動相的差別1分析對象分析對象 gc：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品， 高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及 高聚物的樣品不可檢測高聚物的樣品不可檢測 占有機物的占有機物的20% hplc：溶解后能制成溶液的樣品，：溶解后能制成溶液的樣品， 不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制 分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子 和離子型樣品均可檢測

4、和離子型樣品均可檢測 用途廣泛，占有機物的用途廣泛，占有機物的80%續(xù)前2流動相差別流動相差別vgc：流動相為惰性氣體：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用 vhplc：流動相為液體：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、 改善分離度增加了因素，對分離起很大作用改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和流動相極性和phph值的選擇也對分離起到重要作用值的選擇也對分離起到重要作用 選用不同比例的兩種或兩種以上液體

5、作為流動相選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相 可以增大分離選擇性可以增大分離選擇性3操作條件差別操作條件差別 gc：加溫操作：加溫操作 hplc：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。菏覝?；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┤?、高效液相色譜儀流程圖三、高效液相色譜儀流程圖1貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2高壓泵（輸液泵）高壓泵（輸液泵）3進樣裝置進樣裝置4色譜柱色譜柱分離分離5檢測器檢測器分析分析6廢液出口或組分收集器廢液出口或組分收集器 7記錄裝置記錄裝置四、四、hplchplc的特點和應(yīng)用的特點和應(yīng)用“三高三高” “一快一快” “一廣一廣” 高柱效高柱效n

6、=104片片/米，柱效高（遠高于一般米，柱效高（遠高于一般lc）高靈敏度高靈敏度高選擇性高選擇性分析速度快分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機化合物）有機化合物）第二節(jié)第二節(jié) 基本理論和條件選擇基本理論和條件選擇一、塔板理論一、塔板理論平衡理論平衡理論 二、速率理論二、速率理論 vander方程方程 三、三、hplc法中分離條件的選擇法中分離條件的選擇一、塔板理論一、塔板理論理理nlh/22212)(16)(54. 5)(wtwttnrrr理effeffnlh/2212)(54. 5)(16wtwtnrreff0ttkr2)1(kknneff理二、速率理論（與二、速率理

7、論（與gcgc對比）對比） （填充柱）：ucubahgc/（毛細管柱）或ucubh/dpa2dpagmddb22grdbtb，mtdtdgg或llgsmccccccllddfc2tdl1.續(xù)前2）渦流擴散項及其影響）渦流擴散項及其影響ucahhplc：mdb2tdm相忽略大低，流動相柱溫btrtnhuuhscmu，但柱效，時，/1min/1mlu 選擇兼顧柱效和分析時間，2.討論：討論：1）流動相流速對）流動相流速對hplc板高的影響（與板高的影響（與gc對比）對比）dpa2dpa柱效，nhadp圖示續(xù)前3）傳質(zhì)阻抗項及其影響）傳質(zhì)阻抗項及其影響）（忽略固定相傳質(zhì)阻抗smmssmmcccccc

8、忽略固定相傳質(zhì)阻抗態(tài)流動相的傳質(zhì)阻抗注：只考慮流動相和靜ucucahhplcsmm：msmmddpcc2mddpc2tdm柱效，nhcdp柱效，nhdm，柱阻，但易產(chǎn)生氣泡mmdtcdt圖示三、三、hplchplc法中分離條件的選擇法中分離條件的選擇1. 固定相與裝柱方法的選擇：固定相與裝柱方法的選擇：選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp10m） 首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱2. 流動相及其流速的選擇：流動相及其流速的選擇：選粘度小、低流速的流動相選粘度小、低流速的流動相甲醇，甲醇，1ml/min3. 柱溫的選擇：柱溫的選擇：選室溫選

9、室溫250c左右左右第三節(jié)第三節(jié) 各類高效液相色譜法各類高效液相色譜法一、液固吸附色譜法（一、液固吸附色譜法（lsc） 二、液液分配色譜法（二、液液分配色譜法（llc）三、化學(xué)鍵合相色譜法（三、化學(xué)鍵合相色譜法（bpc）一、液固吸附色譜法（一、液固吸附色譜法（lsclsc） 流動相為液體，固定相為固體吸附劑流動相為液體，固定相為固體吸附劑 1分離機制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性分離機制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性 中心能力的差異中心能力的差異 分離前提：分離前提：k不等或不等或k不等不等)1 (0mrvskttmvskk續(xù)前2固定相：與固定相：與lc比，固定相粒徑不同（比，固定

10、相粒徑不同（17% 17% 分配色譜分配色譜 硅膠失活硅膠失活載體載體 吸附的水吸附的水固定液固定液二、液液分配色譜法（二、液液分配色譜法（llcllc）1分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異2固定相：載體固定相：載體+固定液（物理或機械涂漬法）固定液（物理或機械涂漬法） 缺點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用缺點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用 固定液固定液極性極性nllcnllc 固定液固定液非極性非極性rllcrllc3正相色譜正相色譜固定液極性固定液極性 流動相極性流動相極性（nllc） 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱極性小的組分先出柱，極

11、性大的組分后出柱 適于分離極性組分適于分離極性組分 反相色譜反相色譜固定液極性固定液極性 固定相極性固定相極性 底劑底劑 + 有機調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑）有機調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑） 例：水例：水 + + 甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，thfthf續(xù)前4流動相極性與流動相極性與k的關(guān)系：的關(guān)系： 流動相極性流動相極性，洗脫能力，洗脫能力，k，組分，組分tr5反相洗脫反相洗脫：強度因子：強度因子s，見，見p291表表13-5。水的洗脫。水的洗脫 能力為能力為0。6. 出柱順序：極性大的組分先出柱出柱順序：極性大的組分先出柱 極性小的組分后出柱極性小的組分后出柱7適用：非極性適用：非極性中等極性組分（中等極性組

12、分（hplc80%問題）問題）（三）正相鍵合相色譜（三）正相鍵合相色譜1分離機制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、分離機制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、 誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力2固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3流動相：極性?。ㄍ鲃酉啵簶O性?。ㄍ琹sc） 底劑底劑 + 有機極性調(diào)節(jié)劑有機極性調(diào)節(jié)劑 例：正己烷例：正己烷 + + 氯仿氯仿- -甲醇，氯仿甲醇，氯仿- -乙醇乙醇續(xù)前4流動相極性與流動相極性與k的關(guān)系：的關(guān)系： 流動相極性流動相極性，洗脫能力，洗脫能力，組分，組分tr，k5正相洗脫正相洗脫：溶劑的洗脫能力主要參考極性參數(shù)：溶劑

13、的洗脫能力主要參考極性參數(shù)p（見（見p290 表表13-3）。）。6. 出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性小的組分先出柱 極性大的組分后出柱極性大的組分后出柱6適用：適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍?。┣杌I合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍小） 分離物質(zhì)也相似分離物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性 分析極性大物質(zhì)、糖類等分析極性大物質(zhì)、糖類等（四）離子對色譜和離子抑制色譜（四）離子對色譜和離子抑制色譜1反相離子對色譜法（反相離子對色譜法（ion-pair chromatography） 2反相離子抑制色譜反

14、相離子抑制色譜 (ion-press chromatography)1反相離子對色譜法（反相離子對色譜法（ipc或或pic）反相色譜中，在極性流動相中加入離子對試劑，使被測組分反相色譜中，在極性流動相中加入離子對試劑，使被測組分與其中的反離子形成中性離子對，增加與其中的反離子形成中性離子對，增加k和和tr，以改善分離，以改善分離1）離子對試劑：）離子對試劑：烷基磺酸鈉烷基磺酸鈉分析堿分析堿 四丁基季胺鹽四丁基季胺鹽分析酸分析酸2）影響）影響k的因素的因素a與與m的極性有關(guān)（同反相色譜）的極性有關(guān)（同反相色譜）b與與r的鏈長有關(guān)：的鏈長有關(guān)：r長，極性長，極性小，小，tr，k 3）適用：較強的有

15、機酸、堿）適用：較強的有機酸、堿2反相離子抑制色譜反相離子抑制色譜在反相色譜中，通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相在反相色譜中，通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相ph值，抑制值，抑制組分解離，增加其組分解離，增加其k和和tr，以達到改善分離的目的，以達到改善分離的目的1）離子抑制劑：）離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì)弱酸、弱堿性物質(zhì) ph一定的緩沖溶液一定的緩沖溶液2）k的影響因素：與流動相極性有關(guān)，還與的影響因素：與流動相極性有關(guān)，還與ph值有關(guān)值有關(guān)選擇流動相：應(yīng)同時考慮極性及選擇流動相：應(yīng)同時考慮極性及ph值值 酸性物質(zhì)酸性物質(zhì)加入酸加入酸hac tr，k 堿性物質(zhì)堿性物質(zhì)加入堿加入堿nh3h2o tr，k

16、 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)ph范圍：范圍：3.08.0 ph8.0 ph8.0 破壞鍵合相與載體的結(jié)合破壞鍵合相與載體的結(jié)合 ph3.0 ph3.0 腐蝕柱子腐蝕柱子3）適用：極弱酸堿物質(zhì)）適用：極弱酸堿物質(zhì) ph=37弱酸；弱酸；ph=78弱堿；兩性化合物弱堿；兩性化合物分離類型選擇分離類型選擇 第四節(jié)第四節(jié) 影響分離的因素影響分離的因素一、分離度一、分離度 二、流動相二、流動相三、洗脫方式三、洗脫方式22114kknrucah流動相采用粘度小、低流速的勻的固定相：采用粒度小、填充均n12121212rrrrvvttkkkk溫影響?。┵|(zhì)和固定相性質(zhì)（受柱：調(diào)整流動相種類、性0ttvvkvcvcwwkrmsm

17、mssms?。┑呐浔龋ㄊ苤鶞赜绊戄^：調(diào)整流動相和固定相k續(xù)前2對流動相的要求：對流動相的要求：1）與固定液不反應(yīng)）與固定液不反應(yīng)2）對樣品有良好溶解度）對樣品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的最理想的3）與檢測器匹配：）與檢測器匹配： uv（常用，測定波長應(yīng)大于溶劑的截止波長）（常用，測定波長應(yīng)大于溶劑的截止波長） 熒光，電化學(xué)熒光，電化學(xué)4）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈） 使用前過濾、脫氣使用前過濾、脫氣續(xù)前 3洗脫方式洗脫方式 1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫） 以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）以固定配

18、比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵） 類似類似gc的等溫度洗脫的等溫度洗脫2）梯度洗脫：）梯度洗脫： 在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例 即不斷改變其極性（兩個泵）即不斷改變其極性（兩個泵） 適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分 類似類似gc的程序升溫（沸程較長樣品）的程序升溫（沸程較長樣品）圖示第五節(jié)第五節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀hplc hplc 儀器示意圖儀器示意圖hplchplc的基本流程圖的基本流程圖流動相 泵色譜柱檢測器 泵液分離 檢測 記錄進樣閥進樣1泵泵： 恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒壓泵：流量精度不穩(wěn) 恒流泵

19、：常用恒流泵：常用2進樣裝置進樣裝置 1）隔膜進樣（高分子有機硅膠墊）隔膜進樣（高分子有機硅膠墊進樣室）進樣室） gc系統(tǒng)壓力較小，可以系統(tǒng)壓力較小，可以 hplc系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進樣（早期）系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進樣（早期） 2）閥進樣：不必停泵，六通閥）閥進樣：不必停泵，六通閥 廢廢液液樣樣品品 淋洗液淋洗液 至分離柱至分離柱進樣閥進樣閥 樣樣品品 廢廢液液 淋洗液淋洗液至分離柱至分離柱 （）（）（）（） 樣樣品品環(huán)環(huán)續(xù)前3色譜柱色譜柱：直徑：直徑46mm,柱長柱長1030cm 柱效評價：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗柱效評價：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 r，n，fs（拖尾因子）（拖尾因子） 柱再生：維

20、護、保養(yǎng)、柱子的沖洗柱再生：維護、保養(yǎng)、柱子的沖洗4檢測器檢測器 1）紫外檢測器：適于吸收紫外光的物質(zhì)）紫外檢測器：適于吸收紫外光的物質(zhì) 2）熒光檢測器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì)）熒光檢測器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì) 靈敏度高靈敏度高 3）示差折光檢測器：利用折光率的差別）示差折光檢測器：利用折光率的差別 靈敏度低，溫度要求嚴格靈敏度低，溫度要求嚴格 4）電化學(xué)檢測器）電化學(xué)檢測器 5）化學(xué)發(fā)光）化學(xué)發(fā)光 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器第六節(jié)第六節(jié) 超效液相色譜技術(shù)簡介超效液相色譜技術(shù)簡介

21、（uplc）原有原有hplc分析需要分析需要4個不同的方法、三根不同的色譜柱，個不同的方法、三根不同的色譜柱，至少需要至少需要65分鐘才能完成分鐘才能完成 lc/ms聯(lián)用可容納聯(lián)用可容納600個色譜峰個色譜峰第七節(jié)第七節(jié) hplchplc定量分析方法學(xué)考察定量分析方法學(xué)考察n準(zhǔn)確度（回收率實驗）準(zhǔn)確度（回收率實驗）n精密度（重復(fù)性實驗）精密度（重復(fù)性實驗）n檢出限（檢出限（3 s/n）n定量限（定量限（10 s/n）n線性范圍線性范圍 （2個數(shù)量級）個數(shù)量級）n色譜系統(tǒng)適用性實驗色譜系統(tǒng)適用性實驗u柱效（理論塔板數(shù)）柱效（理論塔板數(shù)）u分離度分離度u重復(fù)性重復(fù)性u拖尾因子拖尾因子第八節(jié)第八節(jié)

22、hplchplc的應(yīng)用的應(yīng)用 藥物分析藥物分析食品分析食品分析環(huán)境分析環(huán)境分析農(nóng)藥分析農(nóng)藥分析例題例題在反相色譜中，若以甲醇在反相色譜中，若以甲醇-水為流動相，適水為流動相，適當(dāng)增加甲醇的比例時，組分的容量因子和當(dāng)增加甲醇的比例時，組分的容量因子和保留時間的變化為（保留時間的變化為（ ）。）。a 樣品的樣品的k降低，降低，tr降低降低 b 樣品的樣品的k增加，增加，tr增加增加c 樣品的樣品的k增加，增加，tr降低降低d 樣品的樣品的k降低，降低，tr增加增加例題例題在正相色譜中，若適當(dāng)增大流動相極性，在正相色譜中，若適當(dāng)增大流動相極性，則（則（ ）。）。a 樣品的樣品的k降低，降低，tr降低

23、降低 b 樣品的樣品的k增加，增加，tr增加增加c 相鄰組分的相鄰組分的 增加增加 d 對對 基本無影響基本無影響例題例題hplc中的最佳流速中的最佳流速uh與與gc中的最佳流速中的最佳流速ug比較結(jié)果是（比較結(jié)果是（ ）a uhugb uhugc uh=ug例題例題用用ods柱分析一有機弱酸混合物樣品，以某一比柱分析一有機弱酸混合物樣品，以某一比例甲醇一水為流動相時，樣品容量因子較小，若例甲醇一水為流動相時，樣品容量因子較小，若想使容量因子適當(dāng)增加，較好的辦法是（想使容量因子適當(dāng)增加，較好的辦法是（ ）。）。a 增加流動相中甲醇的比例增加流動相中甲醇的比例 b 增加流動相中的水的比例增加流動

24、相中的水的比例c 流動相中加人少量流動相中加人少量hac d 流動相中加人少量的氨水流動相中加人少量的氨水例題例題在液相色譜中，常用作固定相又可用作鍵在液相色譜中，常用作固定相又可用作鍵合相基體的物質(zhì)是（合相基體的物質(zhì)是（ ）。）。a 分子篩分子篩 b 硅膠硅膠 c 氧化鋁氧化鋁 d 活性炭活性炭 例題例題水在下述（）中洗脫能力最弱（作為底劑）水在下述（）中洗脫能力最弱（作為底劑）a 正相色譜法正相色譜法b 反相色譜法反相色譜法c 吸附色譜法吸附色譜法d 空間排阻色譜法空間排阻色譜法例題例題鍵合相的鍵合基團的碳鏈長度增加后（）鍵合相的鍵合基團的碳鏈長度增加后（）a 極性減小極性減小b 極性增大

25、極性增大c 載樣量增大載樣量增大d 載樣量減小載樣量減小例題例題在分配色譜法及化學(xué)鍵合相色譜法中，選在分配色譜法及化學(xué)鍵合相色譜法中，選擇不同類別的溶劑（分子間作用力不擇不同類別的溶劑（分子間作用力不同），以改善分離度，主要是（）同），以改善分離度，主要是（）a 提高分配系數(shù)比提高分配系數(shù)比b 容量因子增大容量因子增大c 保留時間增長保留時間增長d 色譜柱柱效提高色譜柱柱效提高例題例題二極管陣列檢測器與一般分光光度計的主二極管陣列檢測器與一般分光光度計的主要差別是（）要差別是（）a 不需光譜掃描即可獲得樣品每個組分的不需光譜掃描即可獲得樣品每個組分的 吸收光譜吸收光譜b 服從服從lambert-beer定律定律c 復(fù)光照射樣品，而后再分光復(fù)光照射樣品，而后再分光d 信號弱，需要累加信號弱，需要累加例題例題內(nèi)標(biāo)對比法與內(nèi)標(biāo)一點法的區(qū)別是（）內(nèi)標(biāo)對比法與內(nèi)標(biāo)一點法的區(qū)別是（）a 不需要加內(nèi)標(biāo)物不需要加內(nèi)標(biāo)物b 不需要校正因子不需要校正因子c 進樣量不要準(zhǔn)確進樣量不要準(zhǔn)確例題例題用反相用反相hplc測定樣品中的蘆丁含量，選對氨基苯甲酸為測定樣品中的蘆丁含量，選對氨基苯甲酸為內(nèi)標(biāo)。方法如下：內(nèi)標(biāo)。方法如下： 準(zhǔn)確配制準(zhǔn)確配制1 mg/ml濃度的蘆丁對照溶液和對氨基苯甲濃度的蘆丁對照溶液和對氨基苯甲酸對照溶液，精取蘆丁對照溶液酸對照溶液，精取蘆丁對照溶液2.00 ml、4.00 ml、6