蛋白質(zhì)定量與定性分析報(bào)告

1、蛋白質(zhì)定量分析與定性分析報(bào)告此次“蛋白質(zhì)定量分析與定性分析”報(bào)告總共包括蛋白定量、蛋白簡(jiǎn)單定性、蛋白功能定性三個(gè)部分組成。師兄的報(bào)告內(nèi)容翔實(shí)，介紹生動(dòng)，讓我受益匪淺。1. 蛋白質(zhì)定量分析蛋白質(zhì)定量分析是確定樣品中總蛋白含量，或者某種單一蛋白的含量。蛋白質(zhì)的定量分析一般可從三個(gè)方面入手，一是基于蛋白質(zhì)的元素組成特點(diǎn)，二是基于蛋白質(zhì)的化學(xué)顯色反應(yīng)，三是基于蛋白質(zhì)的光吸收特性。蛋白質(zhì)定量分析的方法有：280紫外吸光比色法、經(jīng)典bradford與lowry檢測(cè)法、bca（二喹啉加酸）檢測(cè)法、疏基測(cè)定檢測(cè)法。1.1 280紫外吸光比色法這一方法可用來(lái)快速檢測(cè)溶液中是否含有蛋白質(zhì)成分及其含量，通常用于柱層

2、分析過(guò)程中檢測(cè)蛋白質(zhì)的洗脫峰。如下圖，蛋白質(zhì)中的trp、tyr、cys殘基含有共軛雙鍵，在280nm有一紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的a280與其濃度成正比，所以測(cè)定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡(jiǎn)便的方法?？梢酝ㄟ^(guò)a280與a260的差值來(lái)計(jì)算出蛋白質(zhì)濃度，如：蛋白質(zhì)濃度（mg/l）=1.45a280-0.74a260。蛋白質(zhì)的第二吸收峰在240nm以下，214nm最大，此峰是由肽鍵引起?？赏ㄟ^(guò)214nm與225nm的差值來(lái)計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。較為精確的公式為：(280) (m-1 cm-1)= (#trp)(5,500) + (#tyr)(1,490)

3、 + (#cystine)(125).1.2 經(jīng)典bradford與lowery檢測(cè)法1.2.1 bradford檢測(cè)法這是一種迅速、可靠的通過(guò)染色法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)含量的方法。該法基于考馬斯亮藍(lán)g-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當(dāng)于蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)。藍(lán)色復(fù)合物在595nm波長(zhǎng)處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測(cè)595nm的光吸收值大小計(jì)算蛋白的含量。蛋白質(zhì)與色素結(jié)合反應(yīng)很快，約在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，在室溫1h之內(nèi)是穩(wěn)定的。在0.011.0mg蛋白質(zhì)/ml范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與od595

4、值成正比。這種反應(yīng)快速而敏感，幾乎沒(méi)有蛋白質(zhì)損失，但是對(duì)各種純化蛋白質(zhì)反應(yīng)不同，用這種測(cè)定方法對(duì)蛋白質(zhì)引起不可逆的變性，靈敏度在25ug/ml200ug/ml。下圖為用bradford檢測(cè)蛋白質(zhì)含量與吸光度曲線(xiàn)。1.2.2 lowery檢測(cè)法這一標(biāo)準(zhǔn)、快速的蛋白質(zhì)定量分析檢測(cè)方法已得到廣泛應(yīng)用，在檢測(cè)之前可通過(guò)蛋白質(zhì)沉淀將干擾物質(zhì)去除。原理是，蛋白質(zhì)在堿性條件下與雙縮脲試劑中的cu2+形成絡(luò)合物。由于蛋白質(zhì)含芳香族氨基酸殘基，生成的絡(luò)合物可還原folin試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸而產(chǎn)生鉬酸和鎢藍(lán)復(fù)合物，該復(fù)合物顯藍(lán)色，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，可用于定量分析。該藍(lán)色復(fù)合物在74

5、5750nm處有最大的吸收峰，可根據(jù)750nm的光吸收值計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。該法靈敏度高，為5ug/ml100ug.ml，但耗時(shí)長(zhǎng)，干擾物質(zhì)多，使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。下圖為lowery檢測(cè)蛋白質(zhì)含量與吸光度的關(guān)系曲線(xiàn)。1.3 bca（二喹啉甲酸）檢測(cè)法 在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與cu2生成絡(luò)合物，同時(shí)將cu2還原成cu。而bca試劑可敏感特異地與cu結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值。1.4巰基測(cè)定檢測(cè)法 含巰基化合物可以與dtnb（ellman試劑）反應(yīng)，斷裂dtnb的二硫鍵產(chǎn)生2-硝基-5-硫代苯甲酸（ntb-），若在中性或堿性ph條件下的水中可以離子化

6、，生成ntb2-二價(jià)陰離子。這種ntb2-離子呈現(xiàn)黃色。這個(gè)反應(yīng)迅速且定量，加入1摩爾的巰基可以釋放1摩爾的ntb。通過(guò)測(cè)定在412nm可見(jiàn)光吸光度就可以定量ntb2-，進(jìn)而計(jì)算巰基化合物含量（如谷胱甘肽gsh），或測(cè)定蛋白質(zhì)上巰基基團(tuán)的數(shù)目。2. 蛋白簡(jiǎn)單定性（分子量）蛋白質(zhì)分子量的簡(jiǎn)單定性是確定是否有蛋白質(zhì)存在以及存在何種蛋白質(zhì)，主要方法有：sds-page、質(zhì)譜（esi-ms）、動(dòng)態(tài)彈性光散射、沉降平衡超速離心、排阻層析（分子篩）。2.1 sds-pagesds-page法測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量：帶電顆粒在電場(chǎng)中的遷移主要受三個(gè)因素的作用，即場(chǎng)強(qiáng)、顆粒本身的電荷及分子形狀。因此一般電泳無(wú)法

7、直接測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。加入變性劑sds后，蛋白質(zhì)中的氫鍵和疏水鍵被破壞，蛋白質(zhì)變性肽鏈伸展且蛋白質(zhì)所帶電荷被sds的負(fù)電荷覆蓋，使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷遠(yuǎn)超過(guò)本身所有的電荷量，掩蓋了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，同時(shí)還加入巰基乙醇破壞蛋白質(zhì)的二硫鍵，使蛋白質(zhì)幾乎成長(zhǎng)橢圓棒狀。各種sds蛋白復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷影響，而只與蛋白分子量有關(guān)。 下圖左側(cè)為幾種常見(jiàn)蛋白質(zhì)電泳遷移距離，右側(cè)為未知蛋白質(zhì)遷移距離，根據(jù)其相對(duì)其他蛋白質(zhì)分子的遷移距離可算出該未知蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。2.2 質(zhì)譜（ems-ms）質(zhì)譜法分析蛋白的基本原理是通過(guò)電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)

8、、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值（m/z）的蛋白質(zhì)離子分離開(kāi)來(lái)，經(jīng)過(guò)離子檢測(cè)器收集分離的離子，確定離子的m/z值，分析鑒定未知蛋白。通常結(jié)合相應(yīng)的處理及其他技術(shù)，能夠比較準(zhǔn)確、快速地鑒定蛋白質(zhì)。電噴霧電離質(zhì)譜（esi-ms）是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根

9、據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。2.3 動(dòng)態(tài)彈性光散射動(dòng)態(tài)光散射，也稱(chēng)光子相關(guān)光譜，準(zhǔn)彈性光散射，測(cè)量光強(qiáng)的波動(dòng)隨時(shí)間的變化。動(dòng)態(tài)彈性光散射儀器，可以用來(lái)測(cè)量大分子的分子量，故能用于蛋白質(zhì)分子的定性分析。動(dòng)態(tài)光散射法用于測(cè)量粒度及分子大小。dls可測(cè)量作布朗運(yùn)動(dòng)顆粒的擴(kuò)散情況，并采用斯托克斯-愛(ài)因斯坦方程轉(zhuǎn)化為粒度與粒度分布，通過(guò)檢測(cè)不同濃度下的粒徑可以計(jì)算kd，dls相互作用因子。2.4 沉降平衡超速離心沉降平衡超速離心是利用離心力的作用將分散體系中的分散質(zhì)點(diǎn)逐漸沉降，質(zhì)點(diǎn)越大，沉降速度越大，基于沉降速度與分子量依賴(lài)性的原理，來(lái)測(cè)定高聚物分子量分布的方法。在高分子溶液中，高分子的質(zhì)量很小，需要超速離心

10、機(jī)，在很大的離心力場(chǎng)下才能觀察到它們的沉降。離心機(jī)轉(zhuǎn)速可達(dá)1000r/s以上，得到幾十萬(wàn)倍于重力的離心力。如果在比沉降速度法低的轉(zhuǎn)速和不可忽視溶質(zhì)布朗運(yùn)動(dòng)的情況下繼續(xù)離心，則由于離心力所引起的沉降與逆方向擴(kuò)散相均衡，而使管內(nèi)溶質(zhì)的濃度分布保持一定。這種狀態(tài)就是沉降平衡。通過(guò)平衡時(shí)的濃度分布分析可計(jì)算出溶質(zhì)的分子量。公式如下：該分子不含水的相對(duì)分子重量；r：氣體常數(shù)；t：絕對(duì)溫度；s：分子的沉降系數(shù)；：分子的微分比容（當(dāng)一克溶質(zhì)加到一個(gè)大體積的溶液中所占有的體積）；：溶劑的密度。2.5 排阻層析（分子篩）排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。層析柱中的

11、填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類(lèi)物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離。測(cè)定大分子的分子量是凝膠過(guò)濾的應(yīng)用之一。將已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在同一凝膠柱上以相同條件進(jìn)行過(guò)濾層析，由于加入凝膠柱的物質(zhì)分子質(zhì)量不同，洗脫體積也不同?？筛鶕?jù)洗脫體積求出柱的分配常數(shù)kav，而kav與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量之間又存在線(xiàn)性關(guān)系，利用這一關(guān)系可繪制出kav與分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。蛋白質(zhì)洗脫體積ve與其分子量的關(guān)系如下：lg mrk1k2 ve3. 蛋白功能定性蛋白功能定性是指確定蛋白質(zhì)的特定功能，主要方法有蛋白序列定功能、蛋白質(zhì)等溫滴定、蛋白質(zhì)熒光偏振、生物大分子相互

12、作用儀。3.1 蛋白序列定功能蛋白序列定功能指分解出特定蛋白的序列，然后比照蛋白序列得出蛋白可能的各項(xiàng)功能。首先是蛋白測(cè)序-edman降解。這種n端測(cè)序方法是通過(guò)edman化學(xué)降解將蛋白質(zhì)和多肽的n-端殘基轉(zhuǎn)化為pth-氨基酸。每個(gè)循環(huán)從蛋白質(zhì)與多肽裂解一個(gè)氨基酸殘基，同時(shí)暴露出新的游離的氨基酸進(jìn)行下一步的降解，最后通過(guò)轉(zhuǎn)移的pth-氨基酸鑒定實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的測(cè)定。如下圖：將得到的蛋白質(zhì)序列與蛋白質(zhì)序列庫(kù)pdb中特定功能序列對(duì)比，從而得出蛋白質(zhì)功能。3.2 蛋白質(zhì)等溫滴定（itc）等溫滴定量熱技術(shù)是一種監(jiān)測(cè)由結(jié)合成分的添加而起始的任何化學(xué)反應(yīng)的熱力學(xué)技術(shù)，通過(guò)高靈敏度、高自動(dòng)化的微量量熱儀連續(xù)

13、、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)和記錄一個(gè)變化過(guò)程的量熱曲線(xiàn)，同時(shí)提供熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息，從而監(jiān)測(cè)蛋白與蛋白相互作用過(guò)程中吸收和放出的熱量，來(lái)確定蛋白結(jié)合功能。3.3 蛋白質(zhì)熒光偏振熒光偏振分析是指利用熒光偏振原理，通過(guò)檢測(cè)熒光素所標(biāo)記的小分子與其他分子的相互作用前后分子量的變化，計(jì)算水平方向及垂直方向的熒光偏振值作相關(guān)分析。發(fā)射光相對(duì)于激發(fā)光平面將去偏振化，測(cè)得的偏振光值低，從而計(jì)算出樣品的偏振值。故可以利用蛋白蛋白相互作用后，熒光偏振光的改變，來(lái)測(cè)定蛋白相互作用。 3.4 生物大分子相互作用儀表面等離子共振（spr），當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同折射率的介質(zhì)界面（比如玻璃表面的金或銀鍍層）時(shí)，可引起金屬自由電子的共振，由于共振致使電子吸收了光能量，從而使反射光在一定角度內(nèi)大大減弱。其中，使反射光在一定角度內(nèi)完全消失的入射角稱(chēng)為spr角。spr隨表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又和結(jié)合在金屬表面的生物分子質(zhì)量成正比。因此可以通過(guò)獲取生物反應(yīng)過(guò)程中spr角的動(dòng)態(tài)變化，得到生物分子之間相互作用的特異