SODD和Survivin在化療藥物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡中的作用

1、SODD和Survivin在化療藥物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡中的作用 作者：陶紅芳, 胡群, 方建林, 劉愛國, 劉雙又, 張柳清, 胡迎【摘要】 為了研究死亡結(jié)構(gòu)域沉默子（SODD）、survivin、caspase 3、caspase 8及caspase 9在化療藥物誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡中的變化，以進(jìn)一步明確凋亡調(diào)控基因的調(diào)控機(jī)制和尋找藥物作用新靶點(diǎn)，采用Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測化療藥物作用后Jurkat細(xì)胞凋亡發(fā)生率；采用免疫印跡法分析SODD、caspase 3、caspase 8及caspase 9蛋白表達(dá)的變化；采用RTPCR檢測survivin mRNA表達(dá)的變化；采

2、用免疫組織化學(xué)SABC法檢測survivin蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果表明： SODD及survivn高表達(dá)均抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，VCR具有時(shí)間依賴性特異下調(diào)SODD蛋白的功能并能有效誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，在該凋亡過程中caspase 3、caspase 8酶原呈時(shí)間依賴性逐漸被水解剪切，而caspase 9及survivin均無明顯變化趨勢。結(jié)論：SODD參與了VCR誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡過程,VCR通過下調(diào)SODD表達(dá)并啟動(dòng)受體配體介導(dǎo)途徑誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，在該過程中線粒體凋亡途徑并未被啟動(dòng)。 【關(guān)鍵詞】 白血病 SODD；survivin 化療藥物細(xì)胞凋亡Effects of SODD

3、and Survivin on Leukemia Cell Apoptosis Induced by Chemotherapeutic Drugs Abstract This study was aimed to investigate the changes of silencer of death domains (SODD), survivin, caspase 3, caspase 8 and caspase 9 in the apoptotic process of human leukemia cells induced by chemotherapeutic drugs in o

4、rder to explore the molecular mechanism of apoptotic modulatory genes and to search for the new target of chemotherapeutic drugs. After Jurkat cells were induced by chemotherapeutic drugs, the translocated phosphatidylserine was labeled with annexin V/PI, and the apoptosis incidence was measured by

5、FCM; The expression changes of SODD, caspase 3, caspase 8 and caspase 9 were determined by Western blot; the changes of survivin mRNA and protein were determined by RTPCR and immunohistochemistry SABC method respectively. The results indicated that high expressions of SODD and survivin could inhibit

6、 apoptotic signaling pathway; VCR downregulated the function of SODD protein and effectively induced the apoptosis of Jurkat cells in a timedependent manner and activates caspase 3 through the death receptormediated activation of caspase 8, in which caspase 9 and survivin were not degraded. It is co

7、ncluded that SODD participates in the apoptotic process induced by VCR which induces the Jurkat cell apoptosis by downregulating expression of SODD protein and priming death receptor pathway. In the apoptotic process, the mitochondrion apoptotic pathway is not trigged. Key words leukemia; SODD; surv

8、ivin; chemotherapeutic drug; apoptosis J Exp Hematol 2007; 15(3):501-505 死亡結(jié)構(gòu)域沉默子(silencer of death domains， SODD)是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)凋亡調(diào)控基因，特異識(shí)別并結(jié)合于TNFR胞漿段死亡結(jié)構(gòu)域，具有阻止死亡受體與胞漿凋亡信號蛋白結(jié)合繼而阻斷TNFR凋亡通路的功能 ，是細(xì)胞表面死亡受體配體凋亡途徑中的主要負(fù)調(diào)節(jié)蛋白。Survivin基因是凋亡抑制蛋白IAP家族的新成員之一,有較強(qiáng)的抗凋亡活性,是線粒體途徑中的關(guān)鍵凋亡調(diào)控基因。本研究旨在查明SODD、 survivin及凋亡蛋白酶caspas

9、e在白血病細(xì)胞凋亡中的作用, 進(jìn)一步明確凋亡調(diào)控基因分子調(diào)控機(jī)制, 為尋找化療藥物作用新靶點(diǎn)提供依據(jù)。 材料 人急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞來自于武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心。注射用硫酸長春新堿（VCR,1毫克/支），注射用鹽酸柔紅霉素（DNR，20毫克/支），PI/AnnexinVFluos流式雙標(biāo)試劑盒，兔抗人SODD多克隆抗體、兔抗人caspase 3多克隆抗體、兔抗人caspase 8多克隆抗體、兔抗人caspase 9多克隆抗體及兔抗人survivin多克隆抗體，小鼠抗人肌動(dòng)蛋白（betaactin）單克隆抗體，蛋白markers，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記

10、的羊抗鼠IgG，SABC試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，RTPCR試劑盒，各引物由上海生工生物工程合成。 細(xì)胞培養(yǎng) Jurkat細(xì)胞置于10 FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 5% CO2相對濕度90培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。 細(xì)胞凋亡率的FCM檢測 0.1、1和10 g/ml的VCR及0.01、0.1和1 g/ml DNR分別作用于對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞12、24和36小時(shí)，每樣本收獲1 × 106個(gè)細(xì)胞，離心去培養(yǎng)液，用PBS洗滌后，采用AnnexinV/PI雙標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)避光室溫標(biāo)記30分鐘，上流式細(xì)胞儀檢測。 SODD、caspase

11、3、caspase 8及caspase 9蛋白表達(dá)的Western blot分析 分別收集經(jīng)VCR 0. l、 1和 10 g/ml 作用 12、24和36小時(shí)及DNR 0.01 、0.1 和1 g/ml作用12和36小時(shí)的Jurkat細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，變性后每孔50 g進(jìn)行SDSPAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含有5脫脂牛奶的0.1 TBST室溫封閉2小時(shí)，加一抗4孵育過夜，TBST洗膜10分鐘×5次，加HRP連接的羊抗兔或羊抗鼠IgG室溫振搖2小時(shí)，TBST洗膜10分鐘×5次,用新鮮配置的DAB顯色液顯色。結(jié)果用Leica Q Win圖像分析軟件進(jìn)行光密度

12、積分值分析，分別用SODD/betaactin、caspase 3/betaactin、caspase 8/betaactin和caspase 9/betaactin光密度的積分值之比以表示SODD、caspase 3、caspase 8和caspase 9的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 Survivin mRNA表達(dá)的RTPCR檢測 按TRIzoL試劑說明書提取經(jīng)VCR 0.1和10 g/ml作用 12、 24 和36小時(shí)的細(xì)胞，Unico Uv2000型分光光度儀測量RNA的濃度和純度。反應(yīng)引物設(shè)計(jì)與合成如下，并經(jīng)GenBank驗(yàn)證： survivin(359 bp)forward prime

13、r 5CTTTCTCAAGGACCACCGCAT3 reserve 5GCACTTTCTTCGCAGTTTCCTC3以GAPDH（788 bp）為內(nèi)參物， forward 5GGTCGG AGTCAACGGATTTGGTCG3reserve 5CCTCCG ACGCCTGCTTCACCAC3。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。擴(kuò)增條件為37逆轉(zhuǎn)錄1小時(shí)，94 預(yù)變性5分鐘，然后冰上驟冷5 分鐘，再94 1分鐘，57 1分鐘 ，72 1分鐘，35個(gè)循環(huán)， 72充分延伸10分鐘。取10 l PCR產(chǎn)物加2 l溴酚藍(lán)后，于2瓊脂糖凝膠上電泳，用紫外透射儀觀察結(jié)果并拍照，結(jié)果用 Leica Q Win圖像分析軟

14、件進(jìn)行條帶光密度積分值分析，以survivin/GAPDH 光密度積分值之比來表示survivin mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 Survivin蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)SABC法檢測 分別收集VCR 0.1、1和10 g/ml作用24小時(shí)細(xì)胞，用PBS洗滌，防脫片處理載玻片涂片，4丙酮固定30分鐘。余各步驟按SABC試劑盒說明書進(jìn)行操作。以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：采用HPLAS1000病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)測量細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽性率，以胞漿含棕黃色顆粒者為survivin陽性，每張玻片隨機(jī)選取10個(gè)視野以分析陽性表達(dá)強(qiáng)度與陽性率。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包

15、中的Bonferroni和精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。 結(jié) 果 VCR及DNR對Jurkat細(xì)胞的凋亡效應(yīng) AnnexinV/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明：不同濃度VCR及DNR均可有效誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，化療藥物作用后各組細(xì)胞凋亡率見表1。從表1可見，VCR隨著處理時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率呈直線型增加，具有良好的時(shí)間依賴性,同時(shí)細(xì)胞凋亡率也呈現(xiàn)出濃度依賴性，但不如時(shí)間依賴明顯，提示長春新堿作用腫瘤細(xì)胞以時(shí)間依賴的方式強(qiáng)于濃度依賴的方式。DNR與VCR相反，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式以濃度依賴性強(qiáng)于時(shí)間依賴性。 VCR對SODD蛋白表達(dá)的影響 以不同

16、濃度VCR分別處理Jurkat細(xì)胞12、24及36小時(shí)之后，對SODD蛋白表達(dá)的變化進(jìn)行Western Blot檢測。結(jié)果顯示，隨著VCR處理時(shí)間及濃度的增加，SODD蛋白帶逐漸變細(xì)變暗,呈明顯時(shí)間依賴性（圖1）。3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像分析發(fā)現(xiàn)，SODD/betaactin光密度積分值之比隨著VCR作用時(shí)間的延長均呈現(xiàn)降低趨勢（P<0.05），各組光密度積分值見表2。雖然隨著VCR濃度的增加，蛋白表達(dá)也有下調(diào)趨勢，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 DNR對SODD蛋白表達(dá)的影響 以不同濃度 DNR分別處理Jurkat細(xì)胞12及36小時(shí)后，用Western Blot檢

17、測SODD蛋白表達(dá)的變化。3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像分析顯示，SODD/betaactin光密度積分值之比隨著VCR作用時(shí)間及濃度的增加均無明顯變化趨勢（P>0.05）（圖2）,數(shù)據(jù)見表3。這一結(jié)果提示SODD并不是DNR作用的靶點(diǎn)。 VCR對survivin mRNA表達(dá)的影響 以0.1、 1和10 g/ml VCR分別處理Jurkat細(xì)胞12、24及36小時(shí)后，用RTPCR技術(shù)檢測survivin mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，條帶無明顯變暗變細(xì)趨勢（圖3）。對3次實(shí)驗(yàn)的圖像分析結(jié)果經(jīng)精確概率法分析發(fā)現(xiàn)，各組survivin/GAPDH 光密度積分值之比隨著VCR作用時(shí)間及濃度的增加均

18、無明 顯變化趨勢（P>0.05）,數(shù)據(jù)見表4。這一結(jié)果提示VCR不能下調(diào)survivin mRNA的表達(dá)。 VCR對survivin蛋白表達(dá)的影響 以不同濃度 VCR處理Jurkat細(xì)胞24小時(shí)后，用SABC法檢測survivin表達(dá)變化。病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)測量顯示，95 Jurkat細(xì)胞的survivin表達(dá)陽性，棕黃色顆粒定位于Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，胞核也可見少量表達(dá)（圖4）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，0.1、1及10 g/ml三個(gè)作用組的survivin表達(dá)陽性率與表達(dá)強(qiáng)度差異無顯著性（P>0.05）。這提示VCR并不能下調(diào)survivin蛋白的表達(dá)。 F

19、igure 4. Expression changes of Survivin protein in Jurkat cells induced by different concentratins of VCR. There is no significant difference of survivn mRNA expression in different concentrations of VCR(P >0.05). Caspase 3、8、9在VCR誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡中的變化 Western Blot檢測VCR作用Jurkat細(xì)胞之后，caspase3、8、9蛋白表

20、達(dá)變化的結(jié)果顯示caspase 8酶原隨著VCR處理時(shí)間的延長逐漸水解剪切，24小時(shí)開始出現(xiàn)活化片段。Caspase 3酶原帶隨著時(shí)間的變化也呈逐漸變細(xì)趨勢，而caspase 9酶原蛋白帶無明顯變化，呈現(xiàn)較均一的條帶（圖5）。3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖像分析發(fā)現(xiàn)，caspase 3/betaactin及caspase 8/betaactin光密度積分值之比隨著VCR作用時(shí)間增加而呈現(xiàn)降低趨勢（P<0.05）,而caspase 9/betaactin光密度積分值之比隨著VCR作用時(shí)間及濃度的增加均無明顯變化（P>0.05）。 討 論 SODD是Jiang等1利用酵母雙雜交系統(tǒng)在

21、尋找與DR3死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合的蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域抑制因子,它特異識(shí)別并結(jié)合于TNFR1胞漿段死亡結(jié)構(gòu)域的部位2。在TNFR1介導(dǎo)的凋亡路徑中，SODD是一個(gè)關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，阻止TNFR1凋亡通路呈持續(xù)激活狀態(tài)3。研究表明，高表達(dá)的 SODD可抑制TNFR1 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，若抑制胞內(nèi)SODD表達(dá)，則細(xì)胞凋亡敏感性恢復(fù)，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。survivin基因是凋亡抑制蛋白IAP家族的新成員之一4。一般來說，survivin主要表達(dá)于胚胎組織和大多數(shù)腫瘤組織，而不見于終末分化的成熟組織。本實(shí)驗(yàn)研究中95的Jurkat細(xì)胞有survivin陽性表達(dá)。研究表明，survivin進(jìn)入細(xì)胞核，使CD

22、K4/P21復(fù)合物中的P21釋放，與線粒體procaspase3結(jié)合，抑制其活性，從而阻斷效應(yīng)蛋白激酶，抑制凋亡5。Carter等6在對髓樣白血病的研究證實(shí)，survivin表達(dá)下調(diào)，則啟動(dòng)線粒體途徑的凋亡通路，誘導(dǎo)敏感細(xì)胞凋亡?？梢?，凋亡調(diào)控基因SODD及survivin分別在受體配體凋亡途徑及線粒體凋亡途徑中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，抑制SODD及survivin的表達(dá)將促進(jìn)敏感細(xì)胞凋亡。 本研究用Annexin V/PI雙標(biāo)記法證實(shí)，VCR及DNR均是通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用的。在作用方式上，兩種藥物有一定的差別，提示臨床上VCR化療可以通過降低劑量延長作用時(shí)間達(dá)到相同療效，以減

23、少其化療負(fù)反應(yīng)，而DNR則對藥物濃度的要求高于作用時(shí)間的要求。進(jìn)一步研究顯示，SODD及survivin高表達(dá)均抑制了Jurkat細(xì)胞的凋亡，VCR能呈時(shí)間依賴性下調(diào)SODD蛋白的表達(dá)，有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。為了檢測SODD是否能特異地被VCR下調(diào)，我們選用另一常用藥物DNR，用不同的濃度處理Jurkat細(xì)胞，以同樣的方法檢測SODD蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SODD并不是DNR的作用靶點(diǎn)。這一結(jié)果揭示VCR呈時(shí)間依賴特異下調(diào)SODD的表達(dá)，恢復(fù)了死亡受體介導(dǎo)凋亡通路的正常激活機(jī)制，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。 細(xì)胞內(nèi)外的許多信號刺激可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，

24、這些信號以及隨后的反應(yīng)途徑多種多樣，但已公認(rèn)，凋亡后期的共同途徑是凋亡蛋白酶caspase的激活。在受體介導(dǎo)途徑中，受體配體聚合后，通過FADD接頭蛋白使procaspase 8聚集，聚集后的procaspase 8通過自身和相互之間的切割產(chǎn)生成熟的caspase 8。激活的caspase 8又可以激活下游的效應(yīng)凋亡蛋白酶如caspase 3等凋亡相關(guān)分子，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡7。而對于caspase 9來說，它激活的途徑與caspase 8不同，當(dāng)細(xì)胞線粒體受到破壞，釋放出細(xì)胞色素C，在輔助分子Apaf1的協(xié)同作用下，procaspase 9會(huì)通過CARD結(jié)構(gòu)之間的相互作用聚集自我激活，啟動(dòng)下游

25、信號的級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)凋亡， 此即是線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡。因而caspase 8 和caspase 9的激活代表了caspase激活的兩種方式。 在VCR誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的早期階段caspase 3和caspase 8酶原剪切水解不明顯，隨著作用時(shí)間的延長，caspase 3和caspase 8酶原逐漸剪切水解，而caspase 9酶原在VCR作用前后均無明顯變化，蛋白帶呈現(xiàn)均一條帶；且外源性通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白SODD在該過程中表達(dá)下調(diào)明顯。以上結(jié)果證實(shí)VCR誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡是通過了死亡受體介導(dǎo)的caspase 8途徑實(shí)現(xiàn)的。 進(jìn)一步采用RTPCR技術(shù)及免疫組織化學(xué)SABC法檢測

26、了VCR對survivin mRNA和蛋白水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VCR處理細(xì)胞后，survivin 無論在mRNA水平還是在蛋白水平均無明顯變化趨勢（P>0.05）。此外免疫印跡檢測也顯示VCR作用后caspase 9酶原無激活表現(xiàn)。這提示VCR誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡并非影響到線粒體凋亡途徑中的調(diào)控基因survivin。 綜上所述，SODD參與到了VCR誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的過程，VCR通過下調(diào)SODD的表達(dá)并啟動(dòng)死亡受體凋亡通路、caspase 8級聯(lián)凋亡途徑而誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的凋亡，在該過程中線粒體凋亡途徑并未被啟動(dòng)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Jiang Y, Woronicz JD, Liu W, et al. Prevention of constitutive TNF receptor 1 signaling by silencer of death domains. Science ，1999；283(5401):543-5462Takada H, Chen NJ, Mirtsos C, et al. Role of SODD in regulation of tumor necrosis factor responses. Mol Cell Biol，2003; 23:4026-40333Endres R, Hacker G, Brosch I, et a