課題申請書神經(jīng)元發(fā)育與退行性病變的分子細(xì)胞遺傳機(jī)制

1、項目名稱：神經(jīng)元發(fā)育與退行性病變的分子細(xì)胞遺傳機(jī)制首席科學(xué)家：肖波 四川大學(xué)起止年限：2009.1至2013.8依托部門：四川省科技廳 教育部一、研究內(nèi)容關(guān)鍵科學(xué)問題: 神經(jīng)元的發(fā)生和發(fā)育是一個多步驟、多因子參與的復(fù)雜過程。目前已知，胞外信號（包括生長因子、營養(yǎng)因子、神經(jīng)活動）在神經(jīng)元的發(fā)生、分化（極化）和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這些胞外信號可以激活各種信號通路，從而啟動一些對神經(jīng)元發(fā)生、發(fā)育起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子的mrna表達(dá)和蛋白質(zhì)合成。本項目將圍繞神經(jīng)元的發(fā)生、極化，突起的形態(tài)發(fā)生及其退行性病變，從分子、細(xì)胞到整體進(jìn)行系統(tǒng)而深入的研究。我們擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是：揭示與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)

2、生，極化，突觸形成及神經(jīng)退行性病變相關(guān)的重要信號分子（包括小g-蛋白及其偶聯(lián)激酶）的功能并研究其作用機(jī)理，以及環(huán)境與遺傳表型的關(guān)系。主要研究內(nèi)容:（1）rheb/mtor信號通路在神經(jīng)元發(fā)生、極化、網(wǎng)絡(luò)化及神經(jīng)退行性病變中的作用及分子機(jī)制：體外研究發(fā)現(xiàn)，mtor信號通路對神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)育起重要作用，而rheb處于mtor蛋白上游并對其起正調(diào)節(jié)作用，前期工作發(fā)現(xiàn)，rheb1敲除小鼠的大腦發(fā)育出現(xiàn)明顯異常。我們的初步研究表明小鼠中mtor的激活需要與神經(jīng)元早期發(fā)育密切相關(guān)的rheb1。 nestin-cre介導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞敲除rheb1導(dǎo)致小鼠大腦體積和重量均減少約50%?；谏鲜?，我們計劃深

3、入研究rheb/mtor信號通路在神經(jīng)元發(fā)生階段作用和機(jī)制。預(yù)計本課題將幫助我們闡明rheb1/mtor信號通路在神經(jīng)元發(fā)生作用和機(jī)制，為相關(guān)疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。在腫瘤細(xì)胞中，我們已知lkb1抑制mtor信號通路。最近研究表明lkb1調(diào)節(jié)神經(jīng)元的極化，我們初步結(jié)果顯示在神經(jīng)前體中敲除rheb1會導(dǎo)致大腦皮層厚度下降，由此推斷rheb/mtor信號通路有可能參與神經(jīng)元極化調(diào)控。由此，我們將研究rheb1/mtor信號通路在神經(jīng)元極化中的作用和分子機(jī)制。預(yù)計通過本課題的研究將確定rheb/mtor信號通路是神經(jīng)元極化所必需的，同時將為進(jìn)一步揭示rheb調(diào)控神經(jīng)元發(fā)生分子機(jī)制，為相關(guān)疾病防治提供

4、新途徑。體外研究表明，抑制mtor會減少神經(jīng)元樹突棘的形成。由于rheb1缺失會導(dǎo)致mtor完全失活，我們推斷rheb1的敲除會引起樹突和樹突棘形成的缺陷。我們初步數(shù)據(jù)表明rheb1敲除將降低突觸后骨架蛋白shank3的表達(dá)。shank3是樹突發(fā)育的必需因子，所以rheb1可能通過提高shank3的表達(dá)調(diào)節(jié)樹突生長。我們將通過本課題的研究確定rheb/mtor/shank3信號通路在樹突和樹突棘形成中的作用和分子機(jī)制，并揭示它在行為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成中的作用。此外， 我們的研究顯示，rheb1敲除小鼠腦體積比野生型減小約50%，小腦皮層的厚度及海馬體大小也均減少約50%。且rheb1敲除小鼠小腦體積

5、顯著減少，其只有五個小腦葉片而正常小腦為七個。上述所有這些發(fā)育缺陷可能由于rheb1敲除小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖率減慢和（或）腦發(fā)育過程中神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞群的早期損失引起。大量研究表明mtor信號在多個細(xì)胞系中具有抑制自噬的作用，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，rheb1中樞神經(jīng)系統(tǒng)敲除小鼠所有腦區(qū)域中mtor活性被顯著抑制。因此，我們推測rheb1敲除小鼠由于缺失mtor信號發(fā)生過度自噬，從而導(dǎo)致神經(jīng)祖細(xì)胞增殖率減慢及腦發(fā)育過程中神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞群的早期損失，最終導(dǎo)致其腦發(fā)育異常。本課題的研究將確定rheb1/mtor通路介導(dǎo)的自噬抑制在維持神經(jīng)祖細(xì)胞生存和增殖中的功能及rheb1/mtor信號異常是否引

6、起線粒體自噬異常從而導(dǎo)致神經(jīng)祖細(xì)胞受損。（2）與鐵離子代謝相關(guān)基因在神經(jīng)元發(fā)生、極化和網(wǎng)絡(luò)化中的作用及分子機(jī)制：研究結(jié)果表明，鐵離子與神經(jīng)元的發(fā)育密切相關(guān)，但其分子機(jī)理尚不清楚。為深入研究鐵離子和鐵轉(zhuǎn)運蛋白在腦神經(jīng)發(fā)育中的分子機(jī)理，我們將在神經(jīng)前體細(xì)胞中敲除鐵離子運輸基因包括鐵轉(zhuǎn)運蛋白受體（transferrin receptor，tfr）、二價金屬轉(zhuǎn)運體（dmt1）和運鐵素（ferroportin，fpn或slc40a1)。 鐵轉(zhuǎn)運蛋白受體主要攝取轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵（transferrin-bound iron，tf-fe），二價金屬轉(zhuǎn)運體主要攝取非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵（non-transferrin

7、-bound iron，ntbi），而運鐵素在機(jī)體內(nèi)唯一具有從細(xì)胞內(nèi)泵出鐵離子的蛋白。這三個基因涵蓋了細(xì)胞攝取和泵出鐵離子的主要通路。通過本課題的研究我們將確定鐵離子轉(zhuǎn)運在神經(jīng)元發(fā)生過程中的作用和機(jī)理，為防治鐵離子代謝失調(diào)引起的神經(jīng)性疾病奠定基礎(chǔ)。并且體外試驗已經(jīng)表明numb調(diào)節(jié)神經(jīng)元的極化。鐵離子、轉(zhuǎn)鐵蛋白與內(nèi)吞調(diào)節(jié)蛋白numb共同參與內(nèi)吞功能，但在脊椎動物中還未有遺傳學(xué)證據(jù)證明這些分子介導(dǎo)的內(nèi)吞調(diào)節(jié)神經(jīng)元的極化。本課題將以這些基因敲除小鼠為模型，運用多種前沿生物學(xué)技術(shù)闡明中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元攝取、泵出鐵離子的通路和內(nèi)吞調(diào)節(jié)蛋白numb/numblike在神經(jīng)元極化中的作用及分子機(jī)制。課題的研

8、究將確定tfr、dmt1、fpn、numb和numblike信號通路是否是神經(jīng)元極化所必需的，同時將為進(jìn)一步揭示它們調(diào)控神經(jīng)元極化的分子機(jī)制，為相關(guān)疾病的防治提供新的途徑。如前所述，鐵離子、轉(zhuǎn)鐵蛋白與內(nèi)吞蛋白numb共同參與細(xì)胞的內(nèi)吞過程。而在神經(jīng)元中，內(nèi)吞功能對樹突發(fā)育、樹突棘形成和可塑性產(chǎn)生都非常重要，但是鐵離子的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運和numb在這些過程中的作用還不清楚。為此，我們將研究確定tfr、dmt1、fpn、numb和numblike信號通路是否是神經(jīng)元樹突、樹突棘形成所必需的，為進(jìn)一步揭示tfr、dmt1、fpn、numb和numblike信號通路調(diào)控神經(jīng)樹突、樹突棘形成的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

9、（3）研究gs在神經(jīng)元極化中的作用及分子機(jī)制：我們的前期工作表明異三聚體g蛋白的亞基gsa調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞的不對稱性分裂和細(xì)胞極性，emx1-cre介導(dǎo)的在大腦的神經(jīng)前體細(xì)胞中敲除gsa導(dǎo)致大腦的重量減輕50%和產(chǎn)后月內(nèi)死亡。雖然我們已在gsa介導(dǎo)對神經(jīng)前體細(xì)胞不對稱細(xì)胞分裂的調(diào)控方面取得顯著進(jìn)展（被資助），最近體外和遺傳學(xué)研究提示gsa還有可能參與神經(jīng)元極化的調(diào)節(jié)，但其中的機(jī)理尚待研究。通過本課題的研究將確定gsa信號通路是神經(jīng)元極化所必需的，并進(jìn)一步揭示gsa信號通路調(diào)控神經(jīng)元極化分子機(jī)制。（4）bdnf在神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)化中的作用及分子機(jī)制：bdnf幾乎在神經(jīng)元的各個發(fā)育階段都具有重要功能。其

10、基因突變val66met導(dǎo)致它在神經(jīng)元內(nèi)活性誘導(dǎo)分泌缺陷，因而造成精神疾病，但是具體的分子機(jī)制還不清楚。 為此我們建立了bdnfmet轉(zhuǎn)基因小鼠模型。 此模型真實反映bdnfmet相關(guān)精神疾病的行為特點。預(yù)計本課題的研究將確定bdnfmet在樹突和樹突棘形成中作用和分子機(jī)制，及對神經(jīng)傳遞的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步深化理解bdnfmet誘導(dǎo)精神疾病的發(fā)生病理及環(huán)境因素對bdnfmet精神疾病的影響，發(fā)現(xiàn)治療bdnfmet誘導(dǎo)精神疾病的介入方式。（5）線粒體自噬在神經(jīng)元發(fā)育和退行性病變中的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制：線粒體自噬是細(xì)胞控制線粒體數(shù)量和清除受損線粒體的唯一途徑。線粒體自噬不足會導(dǎo)致受損線粒體的積累，引起細(xì)胞凋

11、亡；而線粒體自噬過量會導(dǎo)致atp水平下降，引起細(xì)胞的自噬性死亡。由于神經(jīng)元對線粒體的正常運行具有特別高的要求，它們必須具備精細(xì)的線粒體自噬調(diào)節(jié)機(jī)制，以將它控制在適當(dāng)水平。在本課題中，我們將運用細(xì)胞篩選方法分離線粒體自噬的促進(jìn)因子和抑制因子，通過研究它們的生化功能，揭示線粒體自噬特有的調(diào)節(jié)方式。進(jìn)一步通過研究它們在神經(jīng)元發(fā)育和退行性病變過程中的作用和變化，闡明線粒體自噬在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制，為發(fā)展相關(guān)神經(jīng)疾病的新一代防治方法提供理論基礎(chǔ)。二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)：確定在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生發(fā)育及退變過程中起重要作用的信號分子，闡明在該過程中胞外信號如何通過細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)發(fā)生作用，為防治神經(jīng)精神性疾病

12、提供理論依據(jù)，并為相關(guān)疾病研究建立動物模型。 五年預(yù)期目標(biāo)：1、 對神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生，極化，突觸形成，及神經(jīng)退行性病變的機(jī)理研究有所突破，明確rheb/mtor通路在神經(jīng)元發(fā)育及退行性病變中的作用和機(jī)理，確定是否可通過干預(yù)mtor通路治療神經(jīng)精神疾病。2、 利用制備的條件性基因敲除小鼠建立一系列特異小鼠模型，確定信號蛋白的不對稱分布和膜蛋白內(nèi)吞在神經(jīng)元發(fā)育和退行性病變中作用及機(jī)理。3、 明確變性蛋白、老化線粒體的清除與退行性病變的關(guān)系，建立以干預(yù)線粒體自噬活力為基礎(chǔ)的神經(jīng)精神疾病治療方法。4、 建立和完善小鼠遺傳學(xué)，活體影象等公用技術(shù)平臺。5、 研究成果將在國際高水平雜志上發(fā)表，預(yù)期發(fā)表影響因子i

13、f10的10-15篇。6、將在今后5年內(nèi)培養(yǎng)出4-5名領(lǐng)軍型人才，研究生50-100名。三、研究方案總體研究方案項目擬以神經(jīng)元為研究核心，分別圍繞神經(jīng)元的發(fā)生與極化，神經(jīng)突起的形態(tài)發(fā)生，以及神經(jīng)元退行性病變的分子機(jī)制等問題，從分子、細(xì)胞乃至整個機(jī)體的層次進(jìn)行系統(tǒng)而深入的研究。我們希望通過構(gòu)建一系列神經(jīng)細(xì)胞特異性基因敲除小鼠，結(jié)合多種現(xiàn)代生物學(xué)前沿技術(shù)，如高分辨熒光染色影像分析、基因工程報告小鼠、免疫共沉淀、rna干擾等，闡明上述問題的分子機(jī)制，為進(jìn)一步的研究和臨床治療打下堅實基礎(chǔ)。本課題立意新穎，技術(shù)先進(jìn)，重點突出，內(nèi)容具體，具有極大的理論研究意義和實際應(yīng)用價值。技術(shù)路線如右圖所示：本項目的特

14、色與創(chuàng)新性：1 立題新穎：我們的研究將首次揭示胞內(nèi)調(diào)控因子，如gs、rheb和fe，在神經(jīng)元分化發(fā)育過程中的作用和機(jī)制。本項目的研究內(nèi)容處于當(dāng)代生命科學(xué)的前沿，國內(nèi)外均未見類似的研究報道。2 技術(shù)先進(jìn)：我們將大量采用目前世界上先進(jìn)的生物學(xué)研究手段，如條件性基因敲除和報告基因技術(shù)（如rosa26-gfp），熒光標(biāo)記和成像（如catfish）等，著重在體內(nèi)研究基因在神經(jīng)元發(fā)生和發(fā)育中的作用。3 取得重大突破的可能性大：參與本項目的科學(xué)家積累了大量前期工作的基礎(chǔ)，在cell ，nature，science，nature genetics，nature neuroscience，neuron，mole

15、culler cell，development，genes development等世界頂級雜志上發(fā)表論文26篇，影響因子達(dá)520，被引用次數(shù)達(dá)6000多次。該項目應(yīng)用先進(jìn)的技術(shù)手段，在大量前期工作基礎(chǔ)上，研究神經(jīng)元的發(fā)生、極化、樹突形成及退變的分子機(jī)制等神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)的重大問題。項目所需關(guān)鍵條件性基因敲除小鼠和cre小鼠已制備（如下圖），因此，取得重大突破的可能性極大。4 神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生發(fā)育的基礎(chǔ)研究與臨床疾病緊密相關(guān)。神經(jīng)元生理功能和調(diào)節(jié)的失調(diào)將導(dǎo)致神經(jīng)元退行性病變，如老年性癡呆癥和帕金森氏病，我們對相關(guān)機(jī)制的闡明將有利于尋找新的藥物靶點，開發(fā)新的神經(jīng)元保護(hù)藥物，從而為治療神經(jīng)疑難疾病發(fā)現(xiàn)新

16、途徑。課題設(shè)置: 1) 神經(jīng)元發(fā)生的分子機(jī)制：重點研究rheb/mtor信號通路和鐵離子在神經(jīng)元發(fā)生中的作用和機(jī)制；2) 神經(jīng)元極化的分子機(jī)制：重點研究g-蛋白信號通路（gsa,rheb）和鐵離子在神經(jīng)元極化中的作用和機(jī)制；3) 神經(jīng)元突起形態(tài)發(fā)生的分子機(jī)制：著重研究生長因子bdnf、rheb和鐵離子在神經(jīng)元突起形態(tài)發(fā)生的作用和機(jī)制；4) 神經(jīng)元退行性病變的分子機(jī)制：側(cè)重研究線粒體自噬和rheb/mtor信號在神經(jīng)元退行性病變中的作用和機(jī)制。各課題既重點突出、內(nèi)容具體、責(zé)任明確, 又互相合作、相互促進(jìn)。各課題之間將在資源、技術(shù)和人才三方面充分實現(xiàn)共享，我們將共同利用多品系的基因敲除小鼠進(jìn)行各課

17、題相關(guān)基因功能的研究，節(jié)約大量的人力和經(jīng)費，并且互相學(xué)習(xí)先進(jìn)實驗技術(shù)和交換專業(yè)人才，提高科研效率。課題設(shè)置具體如下：課題一：神經(jīng)元發(fā)生的分子機(jī)制負(fù)責(zé)人：肖波, 44歲, 教授，博士生導(dǎo)師，四川大學(xué)預(yù)算經(jīng)費：占20主要內(nèi)容 我們將利用基因敲除小鼠深入研究rheb/mtor信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)生的分子細(xì)胞機(jī)制（包括神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新、增殖和分化）以及鐵離子轉(zhuǎn)運調(diào)控在神經(jīng)元發(fā)生中的作用和分子細(xì)胞機(jī)制。預(yù)期目標(biāo) 確定rheb/mtor信號通路和鐵離子轉(zhuǎn)運在體內(nèi)神經(jīng)元發(fā)生中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制，為相關(guān)疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。預(yù)計發(fā)表sci if>10的科學(xué)論文2-3篇。 在今后5年內(nèi)培養(yǎng)出1-2名領(lǐng)

18、軍型人才，研究生15-20名。課題二：神經(jīng)元極化的分子機(jī)制負(fù)責(zé)人：沈穎，37歲，教授，博士生導(dǎo)師，浙江大學(xué)。預(yù)算經(jīng)費：占30%主要內(nèi)容我們將利用大腦神經(jīng)元特異的基因敲除技術(shù)研究參與鐵離子運輸?shù)霓D(zhuǎn)鐵蛋白受體、泵鐵蛋白(ferroportin)、決定細(xì)胞極性的內(nèi)吞分子numb/numblike、氨基酸感受信號通路蛋白rheb1和感受外源因子的信號分子gs在神經(jīng)元極化中的作用和分子機(jī)制。預(yù)期目標(biāo)確定g蛋白（gs和rheb）和鐵離子在體內(nèi)神經(jīng)元極化的作用和分子機(jī)制，為神經(jīng)再生、神經(jīng)、精神疾病的研究和新藥的開發(fā)提供指導(dǎo)。預(yù)期發(fā)表影響因子if10的3-5篇，在今后5年內(nèi)培養(yǎng)出1-2名領(lǐng)軍型人才，研究生20

19、-30名。課題三：神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生的分子機(jī)制負(fù)責(zé)人：陳哲宇，33歲，教授，博士生導(dǎo)師，山東大學(xué)預(yù)算經(jīng)費：占30%主要內(nèi)容 我們計劃結(jié)合分子生物學(xué)、光學(xué)成像、電生理學(xué)技術(shù)闡明鐵離子代謝、numb/numblike介導(dǎo)的內(nèi)吞噬、bdnfmet、rheb/mtor信號通路在樹突形態(tài)發(fā)生中的作用和分子機(jī)制，探究樹突發(fā)育和神經(jīng)環(huán)路形成的分子機(jī)制以及某些發(fā)育性神經(jīng)疾病的機(jī)理。預(yù)期目標(biāo) 確定bdnfmet、rheb1/mtor、shank3和鐵離子在神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生中的分子機(jī)制，為神經(jīng)、精神疾病的研究和新藥開發(fā)提供指導(dǎo)。預(yù)計發(fā)表sci if>10的科學(xué)論文3-5篇，在今后5年內(nèi)培養(yǎng)出1-2名領(lǐng)軍型人才

20、，研究生20-30名。課題四：神經(jīng)元退行性病變的分子機(jī)制負(fù)責(zé)人：姜長安，37歲，教授，博士生導(dǎo)師，四川大學(xué)預(yù)算經(jīng)費：占20%主要內(nèi)容我們將側(cè)重研究線粒體自噬和rheb/mtor信號在神經(jīng)元退行性病變中的作用和機(jī)制。運用細(xì)胞篩選方法分離線粒體自噬的相關(guān)因子，揭示線粒體自噬特有的調(diào)節(jié)方式，進(jìn)而研究它們在神經(jīng)元發(fā)育和退行性病變過程中的作用和變化，闡明線粒體自噬在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制，為發(fā)展相關(guān)神經(jīng)疾病的新一代防治方法提供理論基礎(chǔ)。預(yù)期目標(biāo)確定線粒體自噬和rheb1/mtor信號通路與神經(jīng)退行性病變的相互關(guān)系及相關(guān)機(jī)制，為神經(jīng)、精神疾病的研究和新藥開發(fā)提供指導(dǎo)。預(yù)計發(fā)表sci if>10的

21、科學(xué)論文2-3篇，在今后5年內(nèi)培養(yǎng)出1-2名領(lǐng)軍型人才，研究生15-20名。四、年度計劃研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年1.建立和驗證多個神經(jīng)細(xì)胞特異性mtor上游分子rheb1、rheb2及下游分子shank3敲除小鼠品系。2.初步分析rheb/mtor信號對大腦皮層、海馬神經(jīng)元和小腦蒲肯野細(xì)胞發(fā)生、極化和網(wǎng)絡(luò)化的影響。3.探討rheb/mtor信號異常與神經(jīng)祖細(xì)胞損傷的關(guān)系。 4.建立和驗證tfr和fpn等鐵離子代謝相關(guān)基因的中樞神經(jīng)系統(tǒng)敲除模型 。5.初步分析上述基因敲除小鼠是否出現(xiàn)中樞神經(jīng)系能發(fā)育異常。6.制備并驗證多個神經(jīng)細(xì)胞特異性gs敲除小鼠品系，包括gsf/f-exml-cre、 gsf/

22、f-nex-cre, gsf/f-nestin-cre和gsf/f-nestin-creer。7.利用膜片鉗技術(shù)檢測專一的鉀鈉離子通道，為研究gs在神經(jīng)元極化中的定向運輸打下基礎(chǔ)。8.建立和驗證多個bdnf轉(zhuǎn)基因小鼠品系，包括bdnfmet´thy1-egfp，bdnfwt´thy-egfp。9.研究bdnf及其受體trkb在神經(jīng)元活性調(diào)控突起形態(tài)發(fā)生中的作用。10.建立線粒體自噬速度的螢光測定方法。11.建立線粒體自噬調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞篩選方法。12.研究已知的ad、pd相關(guān)突變對線粒體自噬的影響。1.完成神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育不同階段rheb 1敲除小鼠的制備及驗證，如rheb1f/

23、f-nestin-cre, rheb1f/f-synapsin1-cre, rheb1f/f-camkii-cre, rheb1f/f-synapsin1-cre rosa26-egfp為研究rheb1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不同時期的作用打下基礎(chǔ)。2.完成rheb1/rheb2雙基因敲除小鼠的制備及驗證，為確定rheb1/rheb2在神經(jīng)元發(fā)生中是否功能重疊打下基礎(chǔ)。3.完成shank3中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除小鼠的制備及驗證。4.建立和完善與研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的解剖學(xué)，免疫組化及體內(nèi)成像等實驗技術(shù)，包括catfish技術(shù)，以研究與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。5.初步分析rheb1、rheb2敲除小鼠腦

24、組織結(jié)構(gòu)是否異常，皮層、海馬神經(jīng)元及小腦蒲肯野細(xì)胞發(fā)育是否異常。6.初步分析神經(jīng)細(xì)胞敲除rheb1后是否能夠形成穩(wěn)定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。7.初步分析rheb1中樞神經(jīng)系統(tǒng)敲除小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞死亡和（或）增殖是否異常，并檢測其自噬活性及線粒體形態(tài)是否異常。8.完成tfr和fpn等鐵離子代謝相關(guān)基因的中樞神經(jīng)系統(tǒng)敲除模型的制備及驗證，包括tfrf/f-nestin-cre和fpnf/f-nestin-cre，為研究鐵離子代謝在神經(jīng)元發(fā)生、極化、網(wǎng)絡(luò)化和死亡/退變中的作用打下基礎(chǔ)。9.建立和完善與研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的解剖學(xué)，免疫組化及體內(nèi)成像等實驗技術(shù)，檢測上述基因敲除小鼠是否出現(xiàn)中樞神經(jīng)系能發(fā)育異常。10

25、.完成多個神經(jīng)細(xì)胞特異性gs敲除小鼠品系的制備及驗證，包括gsf/f-nex-cre, gsf/f-nestin-cre和 gsf/f-nestin-creer，為研究gs在神經(jīng)元極化中有作用和分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。11.建立并完善膜片鉗技術(shù)測定軸突和樹突專一的鉀鈉通道，并利用此技術(shù)初步研究gs在神經(jīng)元極化中的作用。12.多個bdnf轉(zhuǎn)基因小鼠系的制備和驗證，包括bdnfmet´thy1-egfp，bdnfwt´thy-egfp，為研究bdnf在神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生中的作用和分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。13.確定bdnf及其受體trkb在神經(jīng)元活性調(diào)控突起生長中的作用，以及bdnfmet突變

26、是否干擾了此過程及其機(jī)制。14.建立線粒體自噬速度的螢光測定方法，并確定能明顯提高或降低線粒體自噬速度的ad、pd相關(guān)突變。15.建立線粒體自噬調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞篩選系統(tǒng)，包括果蠅的tom20-dendra2穩(wěn)定細(xì)胞株和rnai庫，并通過早期測試，確定大通量篩選的可行性。第二年1.確定rheb1、rheb2、shank3是否與大腦皮層、海馬神經(jīng)元和小腦蒲肯野細(xì)胞發(fā)生、極化、網(wǎng)絡(luò)化及死亡相關(guān)。2.探索rheb/mtor信號異常引起神經(jīng)祖細(xì)胞損失的細(xì)胞機(jī)制。3.確定tfr和fpn中樞神經(jīng)系統(tǒng)敲除小鼠是否與神經(jīng)元的發(fā)生、極化和網(wǎng)絡(luò)化相關(guān)。4.確定tfr和fpn中樞神經(jīng)系統(tǒng)敲除小鼠是否出現(xiàn)早期神經(jīng)細(xì)胞異常

27、死亡和退變。5.確定gsf/f-emxl-cre，gsf/f-nex-cre, gsf/f-nestin-cre和gsf/f-nestin-creer基因敲除小鼠是否出現(xiàn)大腦發(fā)育和神經(jīng)元極化異常。6.探討gs與神經(jīng)細(xì)胞極化分子如par3，par6，lkb1或numb等的轉(zhuǎn)運和定位的關(guān)系。7.通過轉(zhuǎn)基因小鼠觀察bdnfmet變異導(dǎo)致的神經(jīng)元樹突發(fā)生異常有無腦區(qū)的特異性，是否有不同腦區(qū)間的神經(jīng)環(huán)路改變及其相應(yīng)的行為學(xué)異常。8.研究bdnf及其受體trkb參與活性調(diào)控神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制。9.完成線粒體自噬調(diào)節(jié)因子的篩選，并在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中驗證所篩選出的果蠅基因及其哺乳類同源基因具有線

28、粒體自噬的調(diào)節(jié)功能。10.研究ad、pd相關(guān)突變是否通過改變線粒體通透性驟變孔（mptp）的開關(guān)來引發(fā)或抑制它們的自噬，并進(jìn)一步探討它們影響mptp的生化機(jī)制。完成上述研究內(nèi)容，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行后三年研究方向的調(diào)整，爭取在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程的兩個事件進(jìn)行重點突破，如大腦皮層神經(jīng)元或小腦蒲肯野細(xì)胞極化和神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生與大腦或小腦正常結(jié)構(gòu)功能形成的關(guān)系及其分子機(jī)制。1.明確rheb1、rheb2敲除是否引起大腦皮層、海馬神經(jīng)元和小腦蒲肯野細(xì)胞的發(fā)生和極化異常。2.確定 rheb1、rheb2中樞神經(jīng)系統(tǒng)敲除小鼠大腦皮層、海馬神經(jīng)元樹突和軸突的發(fā)育是否受阻、網(wǎng)絡(luò)化是否異常。3.在單細(xì)胞水平確定rheb

29、1是否影響神經(jīng)元極化分子的表達(dá)和空間定位。4.確定shank3中樞神經(jīng)系統(tǒng)敲除小鼠腦體積及組織結(jié)構(gòu)是否異常。5.進(jìn)一步確定rheb1缺失的神經(jīng)祖細(xì)胞是否具有線粒體功能障礙。6.確定rheb1缺失的引起的神經(jīng)祖細(xì)胞損失是否于由過度自噬和（或）線粒體功能障礙。7.提供多方面證據(jù)證明tfr或fpn敲除神經(jīng)元的發(fā)生、極化或網(wǎng)絡(luò)化出現(xiàn)異常，如在大體水平和組織學(xué)水平腦形態(tài)結(jié)構(gòu)是否異常，為進(jìn)一步利用nestin-creer小鼠在神經(jīng)前體細(xì)胞里定時定量地敲除floxed-tfr或fpn,并用報告小鼠rosaegfp標(biāo)記基因敲除的細(xì)胞提供依據(jù)。8.從多方面證明tfr或fpn中樞神經(jīng)系統(tǒng)敲除小鼠是否出現(xiàn)早期神經(jīng)細(xì)

30、胞異常死亡或退變。9.確定gsf/f-emxl-cre，gsf/f-nex-cre, gsf/f-nestin-cre和gsf/f-nestin-creer基因敲除小鼠大腦結(jié)構(gòu)功能是否異常，軸突、樹突的長度和形態(tài)功能是否有缺陷。10.確定gsf/f-emxl-cre，gsf/f-nex-cre, gsf/f-nestin-cre基因敲除小鼠大腦神經(jīng)元中細(xì)胞極化分子，如par3，par6，lkb1或numb等的轉(zhuǎn)運和定位是否異常。11.明確bdnfmet小鼠神經(jīng)元樹突和樹突棘是否具有形態(tài)缺陷，這種缺陷存在哪些腦區(qū)，是否有相對應(yīng)的小鼠行為學(xué)改變？12.明確bdnf及其受體trkb參與活性調(diào)控神經(jīng)突

31、起生長的機(jī)制及其胞內(nèi)信號通路。13.完成線粒體自噬調(diào)節(jié)因子的篩選，通過驗證，估計可獲得10個調(diào)節(jié)因子。14.確定能改變mptp通透性的ad、pd相關(guān)突變，闡明它們的作用機(jī)制。第三年1.探討rheb或shank3影響神經(jīng)元發(fā)育、極性的形成及大腦和小腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的分子或細(xì)胞機(jī)制。2.利用帶有報告基因的rheb1敲除小鼠（rheb1f/f-synapsin1-cre rosa26-egfp），觀察rheb1敲除神經(jīng)元是否同樣有效的參與形成穩(wěn)定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及其功能是否異常。3.確定rheb/mtor信號異常引起神經(jīng)祖細(xì)胞過度自噬與線粒體功能障礙的關(guān)系。4.利用rosaegfp報告基因敲除小鼠，制備在神

32、經(jīng)前體細(xì)胞里定時定量地敲除floxed-tfr或fpn的小鼠，并探討tfr、fpn、numb和numblike在極化過程中的神經(jīng)元定位與突起分化、生長的關(guān)系。5.探討上述蛋白在神經(jīng)元內(nèi)極化與分子的定向運輸中的作用。6.篩選tfr、fpn、numb和numblike相互作用蛋白。7.驗證gs是否通過調(diào)控其下游分子pka進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的極化。8.篩選在神經(jīng)元極化過程中g(shù)s的結(jié)合蛋白。9.蛋白質(zhì)組學(xué)分析bdnf和trkb胞內(nèi)運輸、bdnfmet聚積的分子基礎(chǔ)。10.利用電生理技術(shù)探討bdnfmet對神經(jīng)突觸傳遞的影響。11.在培養(yǎng)的細(xì)胞中研究所篩選出的線粒體自噬調(diào)節(jié)因子的作用機(jī)制。12.利用體外培養(yǎng)

33、的突變神經(jīng)元，研究不同線粒體調(diào)節(jié)因子的缺失導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)育異?；蛲诵行圆∽兊姆肿訖C(jī)制。1.從多方面提供證據(jù)確定rheb1或shank3通過調(diào)控神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、分裂方式，在時間或空間上影響大腦皮層、海馬和小腦神經(jīng)元發(fā)生和生長。2.初步揭示rheb/mtor信號通路調(diào)節(jié)大腦皮層、海馬神經(jīng)元和小腦蒲肯野細(xì)胞極化的分子機(jī)制。3.證實rheb1或shank3通過影響大腦皮層、海馬神經(jīng)元樹突或軸突發(fā)生和生長（與神經(jīng)活動相關(guān)的）從而影響大腦和小腦正常結(jié)構(gòu)功能，包括形成穩(wěn)定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。4.利用rheb1f/f-synapsin1-cre rosa26-egfp小鼠，確定rheb1敲除神經(jīng)元與野生型神經(jīng)元是否同

34、樣有效地參與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)化的形成。5.明確rheb1敲除小鼠是通過以下何種機(jī)制引起軸突和樹突缺陷：a）神經(jīng)元樹突或軸突極性形成障礙；b)軸突和樹突生長不良。6.確定rheb1缺失引起的神經(jīng)祖細(xì)胞線粒體功能障礙是其形成過程受損還是過度自噬。 7.確定敲除tfr、fpn、numb或numblike是否引起極化過程中的神經(jīng)元定位或突起分化、生長的異常。8.確定上述蛋白是否引起神經(jīng)元內(nèi)極化或分子的定向運輸?shù)漠惓！?.篩選tfr、fpn、numb或numblike相互作用蛋白并通過體內(nèi)外實驗驗證其相互作用。10.確定gs是否通過下游信號分子pka調(diào)節(jié)神經(jīng)元極化。11.篩選并驗證在神經(jīng)元極化過程中激活gs的結(jié)

35、合蛋白。12.驗證并鑒定在bdnf和trkb胞內(nèi)運輸以及bdnfmet聚積中起重要作用的分子，進(jìn)一步研究這些分子在神經(jīng)元突起生長中的作用。13.體外培養(yǎng)野生型和bdnfmet小鼠的海馬、小腦神經(jīng)元，記錄突觸受體電流的關(guān)鍵數(shù)據(jù)，初步調(diào)查bdnfmet小鼠的突觸傳遞是否異常。14.闡明2-3個線粒體自噬調(diào)節(jié)因子的作用機(jī)制。第四年在第3年工作基礎(chǔ)上就3至4個內(nèi)容進(jìn)行重點突破，如：1.探討rheb1或shank3影響與神經(jīng)活動相關(guān)的樹突或軸突的發(fā)生和生長，從而影響形成穩(wěn)定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)理。2.重點突破rheb1或shank3影響神經(jīng)元極性的形成和大腦、小腦正常結(jié)構(gòu)功能的分子機(jī)理。3.進(jìn)一步明確rh

36、eb/mtor信號通過調(diào)節(jié)自噬對線粒體功能的影響。4.利用tfr、fpn、numb和numblike敲除小鼠研究調(diào)控極化過程中的神經(jīng)元定位與突起分化、生長的機(jī)制。5.利用tfr、fpn、numb和numblike敲除小鼠研究上述蛋白在神經(jīng)元內(nèi)極化與分子的定向運輸中的作用機(jī)制。6.初步驗證2-3個tfr、fpn、numb或numblike相互作用蛋白是否與神經(jīng)元發(fā)生和極化及突起生成有關(guān)。7.從gs的結(jié)合蛋白中篩選并鑒定在神經(jīng)元極化過程中激活gs的外源信號和受體。8.探討上述受體與神經(jīng)元極化的關(guān)系。9.探討環(huán)境因素對bdnfmet相關(guān)精神疾病的影響。10.利用電生理技術(shù)進(jìn)一步明確bdnfmet對神

37、經(jīng)突觸傳遞的影響。11.利用不同的cre小鼠品系在神經(jīng)元發(fā)育不同的階段敲除以上線粒體自噬調(diào)節(jié)因子，分析它們的缺失是否引起神經(jīng)元的發(fā)育異?；蛲诵行圆∽?。12.探討ad、pd相關(guān)突變與新篩選出的線粒體自噬調(diào)節(jié)因子之間的相互關(guān)系。備注：對rheb/mtor信號通路在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生，極化，網(wǎng)絡(luò)化與神經(jīng)細(xì)胞死亡和退變中的作用研究有顯著突破。1.初步揭示rheb1或shank3導(dǎo)致神經(jīng)活動相關(guān)的樹突或軸突的發(fā)生和生長異常，從而影響形成穩(wěn)定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)理。2.確定rheb1敲除小鼠中調(diào)節(jié)軸突和樹突生長的關(guān)鍵信號通路是否異常。3.進(jìn)一步確定缺失rheb1或shank3影響神經(jīng)元的極性形成并引起大腦和小腦的

38、結(jié)構(gòu)功能異常的分子機(jī)理。4.從生化實驗方面進(jìn)一步明確rheb1缺失引起的過度自噬是否與線粒體功能障礙直接相關(guān)。5.確定tfr、fpn、numb或numblike調(diào)控極化過程中的神經(jīng)元定位與突起分化、生長的機(jī)制。6.確定上述蛋白在神經(jīng)元內(nèi)極化與分子的定向運輸中的作用機(jī)制。7.通過體內(nèi)外實驗確定與神經(jīng)元發(fā)生和極化及突起生成有關(guān)的tfr、fpn、numb或numblike相互作用蛋白。8.從gs的結(jié)合蛋白中篩選并鑒定1-2個在神經(jīng)元極化過程中激活gs的外源信號和受體。9.確定上述受體在神經(jīng)元極化中的作用。10.從神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)、電生理、行為學(xué)三個角度進(jìn)行研究，明確不同環(huán)境（豐富環(huán)境及應(yīng)激環(huán)境）對bdn

39、fmet遺傳的影響。11.明確bdnfmet小鼠海馬和小腦神經(jīng)元的興奮型突觸后電流的頻率和幅度，以及ampa受體動力學(xué)特性和單元電導(dǎo)值是否出現(xiàn)異常。12.確定線粒體自噬在神經(jīng)元發(fā)育過程中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制。13.確定線粒體自噬異常導(dǎo)致神經(jīng)元退行性死亡的分子機(jī)制。14.確定ad、pd相關(guān)突變是否通過影響新篩選出的調(diào)節(jié)因子來改變細(xì)胞內(nèi)的線粒體自噬水平，并進(jìn)一步闡明它們的作用機(jī)制。第五年1.進(jìn)一步完善第四年的研究內(nèi)容。2.著重在生化機(jī)理方面有所突破，如，探討rheb/mtor信號是否影響與神經(jīng)細(xì)胞極化、神經(jīng)突起的形成、網(wǎng)絡(luò)化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成；初步揭示rheb/mtor對自噬在神經(jīng)元發(fā)育與退行

40、性病變中的功能調(diào)控的分子機(jī)制，切實做到表型/功能分析與機(jī)理有機(jī)結(jié)合。3.著重在與神經(jīng)元發(fā)生相關(guān)的鐵離子代謝生化機(jī)理方面有所突破。4.著重在gs與神經(jīng)元極化的機(jī)理中取得突破。5.著重在bdnf和其受體trkb調(diào)控神經(jīng)突起形態(tài)和功能的分子機(jī)制研究中取得突破。6.著重在線粒體自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制及ad、pd相關(guān)突變對它的影響方面取得突破。7.著重在線粒體自噬調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育和防止神經(jīng)元退行性病變方面取得突破。1.全面完成計劃研究內(nèi)容。2.rheb/mtor信號在神經(jīng)元發(fā)生、發(fā)育中的功能研究方面，總結(jié)發(fā)表論文約10篇，其中影響因子10分以上論文3-4篇。3.鐵離子代謝在神經(jīng)元發(fā)生、發(fā)育功能研究方面，總結(jié)發(fā)表論

41、文約5篇，其中影響因子10分以上論文3篇。4.gs與神經(jīng)元極化的機(jī)理研究方面，總結(jié)發(fā)表論文約5篇，其中影響因子10分以上論文3篇。5.bdnf在神經(jīng)突起形態(tài)中的功能研究方面，總結(jié)發(fā)表論文約6篇，其中影響因子10分以上論文2篇。6.線粒體自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制及其在神經(jīng)退行性疾病中的變化方面發(fā)表論文6篇，其中影響因子10分以上論文2篇。7.線粒體自噬在神經(jīng)元中的功能方面發(fā)表論文3篇，其中影響因子10分以上論文2篇。登記序號： 項目編號：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研項目課題設(shè)計書課題名稱：痛痹顆粒對骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞凋亡和增殖的機(jī)理研究申報單位： 江蘇省中醫(yī)院課題負(fù)責(zé)人： 朱萱萱計劃年限：郵政編碼： 210029 聯(lián)

42、系電話： 8661714130306申報日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢；選題的理論和實踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說或技術(shù)構(gòu)思，主要研究內(nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)（達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗方法及技術(shù)路線（工藝路線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開展本項研究的技術(shù)優(yōu)勢，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備及應(yīng)用合格實驗動物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)試驗情況。五、計劃進(jìn)度：根據(jù)總的研究期限、年度計劃進(jìn)度，分別列出具體的目標(biāo)和進(jìn)度的考核指

43、標(biāo)。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計劃。填寫說明一、內(nèi)容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報要求上報。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細(xì)、如實填寫。三、封面上“登記序號”“項目編號”請勿填寫。1、 立項依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，oa）又稱退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據(jù)調(diào)查，在美國目前2億多人口中，就

44、有骨關(guān)節(jié)炎4500萬，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，oa的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達(dá)40%，而65歲以上人群的患病率達(dá)60%90%。隨著計劃生育政策的長久實施及經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國已進(jìn)入老齡化社會，oa的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴(yán)重危害人民的生活、健康，對社會也將造成很大負(fù)擔(dān)。同時世界其他國家也面臨著同樣的問題，因而oa引起了國際、國內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當(dāng)重視。近年來對oa的研究頗多，在發(fā)病機(jī)制、檢測手段以及治療方法上均取得較大進(jìn)步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進(jìn)展。西藥治療oa的主要手段是非甾體藥，

45、但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點。雖然中藥治療oa也取得了一些經(jīng)驗，但對其具體的作用機(jī)制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對療效確切的中藥復(fù)方進(jìn)行深入的機(jī)理研究，使中藥治療oa的療效在國際先進(jìn)行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢近十年來，國內(nèi)外對oa進(jìn)行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.1 流行病學(xué)研究已廣泛開展在近100種不同類型的關(guān)節(jié)疾病中，oa是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增高的趨勢。felson等報道7

46、0歲以下人群膝oa患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝oa70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。butter等報道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血oa 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內(nèi)陳順樂等隊13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀性oa患病率2.2%；無癥狀性oa患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計551例，結(jié)果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.

47、1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)oa易感性不同。美國在衛(wèi)生統(tǒng)計中心調(diào)查結(jié)果，oa患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果oa是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖oa均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在framingham的研究中，felaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險相應(yīng)減少50%。 saase等調(diào)查結(jié)果，膝oa患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計，在美國，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國雖未作全國大范圍的普查，但隨

48、著老齡化社會進(jìn)程的不斷加快，oa的發(fā)病率會越來越高，這必將給家庭、社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。1.2.2 病因、發(fā)病機(jī)制有了巨大突破目前基礎(chǔ)研究認(rèn)為軟骨的損傷與退變是oa的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來眾多學(xué)者對oa關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進(jìn)行了大量研究，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說：由于骨血液動力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液ph值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細(xì)胞的正常代謝導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)

49、說：認(rèn)為自由基對軟骨細(xì)胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細(xì)胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與dna發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細(xì)胞dna即合成dna所需的酶，使dna鏈斷裂、堿基損傷從而影響了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞浸潤，其表面受免疫復(fù)合物、補(bǔ)體等作用能釋放大量o2-和h2o2；細(xì)胞因子學(xué)說：細(xì)胞因子對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細(xì)胞介素-1（il-1）、白細(xì)胞介素-6(il-6)、腫瘤壞死因子（tnf）等在oa中水平明顯增高。il-1具有刺激軟骨細(xì)胞分泌一氧

50、化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時il-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動因子；軟骨酶降解學(xué)說：oa軟骨細(xì)胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達(dá)到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白?；|(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的il-1和tnf的作用下，軟骨細(xì)胞以酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對

51、軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進(jìn)行性破壞；一氧化氮學(xué)說：no是一種細(xì)胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。nos可催化重要炎性介質(zhì)no的產(chǎn)生，oa患者血清、滑液中no含量明顯高于正常。no可通過抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時使軟骨細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞糖酵解，使軟骨破壞。細(xì)胞凋亡學(xué)說：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進(jìn)與不足則會引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細(xì)胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細(xì)胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于

52、軟骨細(xì)胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細(xì)胞修復(fù)過程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。oa軟骨細(xì)胞凋亡主要通過兩種相互獨立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關(guān)的途徑,由no介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由fas介導(dǎo)。典型的oa不存在明顯的炎癥反應(yīng),此時軟骨細(xì)胞凋亡以no途徑為主;當(dāng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時,則通過as途徑加劇軟骨細(xì)胞凋亡和關(guān)節(jié)破壞。no通過兩種方式造成組織及細(xì)胞損傷。一是高濃度的no能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,

53、從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是no與超氧化陰離子2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子onoo-,在酸性條件下(如病理條件)迅速分解為oh-和no2自由基,這兩種自由基具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,可造成組織細(xì)胞損傷。在oa患者中,受損區(qū)軟骨細(xì)胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。fas表達(dá)的結(jié)果與其相符,oa受損區(qū)的fas表達(dá)遠(yuǎn)高于未受損區(qū),提示fas表達(dá)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。除no途徑和fas途徑外,還有一些因素可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1區(qū)等。1.2.3 治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療oa的藥物較多，西藥治療oa主要有三大類，第一類為快

54、作用藥，即非甾體藥，特點是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，oa多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過分運動，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點認(rèn)為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療oa的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價格昂貴，臨床上尚未廣泛運用；第三類為軟骨保護(hù)劑，尚未問世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療oa的研究取得了可喜的進(jìn)步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：多屬臨床經(jīng)驗，無對照組，特別是西藥

55、對照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國際公認(rèn)的、量化的臨床觀察指標(biāo)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)為手段來尋找治療oa的中藥。未針對oa發(fā)病機(jī)制進(jìn)行臨床及動物試驗從生化、免疫、病理、細(xì)胞分子水平來探討中藥的藥物作用機(jī)理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認(rèn)為oa屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認(rèn)為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為oa的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝oa骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密切關(guān)系；謝林等論述了膝oa與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運用活血化淤藥治療oa提供理論依據(jù)。治療方面從古

56、到今絕大部分醫(yī)家皆針對其病因病機(jī)采用益肝腎、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標(biāo)。獨活寄生湯是用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見本方加減治療oa，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報道用本方加減治療104例，總有效率91.3%。1.2.4 實驗研究方面有了較大的進(jìn)展隨著對oa發(fā)病機(jī)理的不斷深入認(rèn)識，對oa的實驗研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動物實驗不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗，現(xiàn)已使用針對oa的動物實驗，并采用相關(guān)的指標(biāo)

57、進(jìn)行檢測。目前實驗研究內(nèi)容主要有以下幾個方面，研究最多的是oa的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗一般均可通過建立骨關(guān)節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測相關(guān)指標(biāo)來進(jìn)行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學(xué)指標(biāo)，使用老齡動物通過檢測體內(nèi)sod及mda含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在no對oa影響的實驗中，一般采用硝酸還原酶法來測定no含量，運用pt-pcr技術(shù)測定nos基因表達(dá)。il-1、il-6、tnf等細(xì)胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素pge2、軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被