血吸蟲試劑盒主要原材料研究資料

1、血吸蟲抗體快速檢測試劑盒主要原材料的研究資料1血吸蟲可溶性蟲卵抗原（sea）（試劑盒檢測點(diǎn)原料）（1）制備方法：取人工感染1500條日本血吸蟲尾蚴45d的家兔肝臟，用生理鹽水洗凈后經(jīng)高速搗碎機(jī)搗碎，分樣篩分離除去肝臟組織，沉淀離心，收集分離蟲卵，依次經(jīng)200目和300 目尼龍絹過濾，收集濾渣，即為較純凈的血吸蟲蟲卵。然后加入10倍量的生理鹽水，置玻璃勻漿器內(nèi)制成勻漿，用超聲粉碎機(jī)超聲處理（1min×10次），液氮凍融3次，最后以10 000 r/ min 離心30 min ，上清液即為血吸蟲可溶性蟲卵抗原（sea），經(jīng)0.22um超濾膜過濾除菌后分裝，20凍存?zhèn)溆?。?）抗原性測定a

2、測定方法1) 取抗原200 µl加入比色杯內(nèi)，用分光光度計(jì)測定a280和a260od值；2) 將抗原用ph9.6碳酸鹽緩沖液作1:4、1:8、1:16、1:32、1:64稀釋,分別包被于酶標(biāo)板內(nèi)(100ul/孔),37 3小時；然后傾去抗原液,用洗滌液洗滌3次,每次5分鐘；bsa（0.5mg/ml)為對照，同法操作；3) 加樣：分別加已作1:100稀釋的血吸蟲抗體檢測質(zhì)控品、陽性和陰性對照血清各100 µl，空白孔僅加 100 µl稀釋液。置于濕盒內(nèi)， 37 培育30 分鐘；4) 洗板：取出酶標(biāo)板，甩去孔內(nèi)液體，每孔注滿洗滌液洗滌 5 次，每次均需停留30秒后再甩

3、凈拍干；5) 加酶標(biāo)結(jié)合物：除空白對照孔外，每孔加入酶標(biāo)結(jié)合物2 滴，37培育30分鐘；6) 洗板：同3；7) 顯色：每孔加底物和顯色劑各1滴，混勻，37避光反應(yīng)10分鐘，加終止液1 滴，混勻，判斷結(jié)果。b判斷依據(jù)：1) 根據(jù)公式計(jì)算：樣品濃度（mg/ml）=（1.45×a280-0.74×a260 ）×稀釋倍數(shù)；2) 肉眼觀察：不加終止液觀察，基本無色或微藍(lán)色為陰性，呈明顯藍(lán)色為陽性；3) 儀器判斷：酶標(biāo)儀上450nm讀取od值，待檢樣本孔的od值大于陰性對照2.1倍者為陽性。c結(jié)果 抗原od值a280nm 2.1510 抗原od值a260nm2.5121計(jì)算公

4、式抗原濃度（mg/ml）=（1.45×a280-0.74×a260 ）×稀釋倍數(shù)；抗原濃度1.26mg/ml比值 sea陰參陽參血吸蟲抗體檢測質(zhì)控品陽參血吸蟲抗體檢測質(zhì)控品1:4 0.05 0.45 0.15 9.03 3.08 1:8 0.04 0.51 0.17 10.26 3.48 1:16 0.05 0.52 0.19 10.31 3.78 1:32 0.05 0.49 0.18 9.41 3.52 1:64 0.06 0.61 0.24 10.92 4.35 bsa 0.01 0.04 0.01 0.82 0.11 結(jié)論：濃度為1.26mg/ml，經(jīng)倍比

5、稀釋，用于elisa檢測血吸蟲抗體陽性臨界血清，1:64(0.02mg/ml)仍呈陽性結(jié)果，具有高度的免疫原性,可用于血吸蟲抗體檢測（3）工作濃度：sea 的作用是作為檢測點(diǎn)，包被于硝酸纖維素膜上，用于檢測人血清中特異性抗血吸蟲抗體。因此，其工作濃度的選擇對于檢測效果的評價是試劑盒研制的關(guān)鍵技術(shù)。如果濃度過高，陽性反應(yīng)色度過強(qiáng)，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果；反之，濃度過低，則不易辨別，影響檢測的靈敏度。所以，研究目的是選擇能較清晰產(chǎn)生反應(yīng)色度的最低抗原濃度。方法：a. sea抗原原液濃度測定：以紫外分光光度法測定sea抗原原液a280和a260od值，根據(jù)公式計(jì)算濃度（mg/ml）=1.45×a

6、280-0.74×a260 ；b. sea稀釋：以0.02 mol/l ph8.0 pbs將sea從1:2至1:10 稀釋成9個稀釋度，與原液一起分成10個濃度組。c. 包被：將上述10個濃度的sea分別點(diǎn)膜，在每塊空白反應(yīng)板中的硝酸纖維素膜（德國schleicher & schuell bioscience，孔徑0.45um）上點(diǎn)滴1ul，每個濃度組包被3塊，室溫干燥2小時后加入2滴封閉液（主要成分為牛血清白蛋白），待干。 d. 效果測試：分別在上述10個濃度組的金標(biāo)反應(yīng)板中央小孔內(nèi)滴加2滴洗滌液，滲入后于反應(yīng)板中央加25 µl 血吸蟲抗體檢測質(zhì)控品（參照血吸蟲病

7、抗體診斷試劑國家參考品低感染度血清(p13)制備，方法見附頁），待液體充分吸入，加2滴洗滌液，滲入后分別加3種濃度的顯色液（即金標(biāo)二抗，濃度依據(jù)a520od值確定，制備方法見后），每塊反應(yīng)板加1種濃度的顯色液，每種顯色液均加4滴，最后加2滴洗滌液，滲入后根據(jù)檢測點(diǎn)顏色深淺判斷效果。結(jié)果：a. sea抗原原液od值：a280為2.1510，a260為2.5121 ，根據(jù)公式（mg/ml）=1.45×a280-0.74×a260計(jì)算，濃度為1.26 mg/ml。b. 檢測效果金標(biāo)二抗?jié)舛萻ea抗原稀釋度原液1:21:31:41:51:61:71:81:91:101.2+

8、7;1.0+±±0.8+±±±±±-注：色度判斷：+深，+易見， ±淺，-無c. 最適工作濃度選擇：金標(biāo)二抗?jié)舛仍?.2 （a520值）時所有金標(biāo)反應(yīng)板的背景較深，且制備成本高；0.8時，檢測效果較差；1.0時的檢測效果最好，在抗原稀釋度1:8（0.157mg/ml）仍可清晰顯示檢測點(diǎn)。因此，抗原最適工作濃度為1:51:8范圍內(nèi)（約0.2±0.05mg/ml），而金標(biāo)二抗的最適工作濃度為1.0（a520值）。進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)：以0.2mg/ml工作濃度的sea抗原為檢測點(diǎn)，1.0（a520值）金標(biāo)二抗為顯色

9、液研制的血吸蟲抗體快速檢測試劑盒（斑點(diǎn)免疫金滲濾法），采用中國藥品生物制品檢定所提供的“血吸蟲病抗體診斷試劑國家參考品”（ 批號：20041108）作為測定血清。其中陰性參考品由15份正常人血清組成，血吸蟲病抗體均為陰性，用于測定試劑盒的特異性。陽性參考品由15份強(qiáng)、中、弱陽性血清組成，用于測定試劑盒對血吸蟲病抗體陽性血清的檢出能力。最低陽性檢出參考品為1份血吸蟲病抗體陽性樣品，從1:21:16作倍比稀釋，用于測定試劑盒的最低檢出量（靈敏度）。診斷試劑的精密性測定由1份中等陽性血清組成，重復(fù)檢測10次，用于測定試劑盒的精密性（操作方法同1 (3) d ）。結(jié)果：血清份數(shù)陰性(數(shù))陽性(數(shù))符合

10、率（%）陰性參考品15150100陽性參考品15015100精密度參考品10010100靈敏度參考品1:2+(1份)1:4+(1份)1:8±(1份)1:16-(1份)2金標(biāo)二抗（試劑盒顯色液原料）（1）制備方法：a. 膠體金制備采用鞣酸-檸檬酸鈉還原法，膠體金顆粒直徑為20 nm。具體方法為：取1%氯金酸5ml溶于395 ml dh2o，加熱至60 ，快速加入鞣酸-檸檬酸鈉溶液100 ml（1%檸檬酸三鈉20 ml，1%鞣酸0.05 ml，dh2o 80 ml），加熱煮沸15 min，溶液顏色由黑逐漸變?yōu)榱良t色。冷卻后用0.1 mol/l碳酸鉀調(diào)溶液ph至8.0。b金標(biāo)二抗制備二抗為

11、親和層析法純化的羊抗人igg(上海神航生物科技有限公司，蛋白濃度為3.34mg/ml，批號：ip2030)。最適蛋白穩(wěn)定量選擇：將待標(biāo)記的二抗分別加到 1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對照管，分鐘后加入0.1ml 10nacl溶液，混勻后靜置小時觀察結(jié)果，紅色不變者為能使膠體金穩(wěn)定的蛋白量，再加20即為最適標(biāo)記蛋白量。反應(yīng)結(jié)果見下表：試管123456膠體金1ml1ml1ml1ml1ml1ml二抗0 ul1 ul1.5 ul2 ul2.5 ul3 ul10%nacl0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml顏色藍(lán)淺藍(lán)灰淺紅紅紅從反應(yīng)結(jié)果觀察，5號管（2.5ul）顏色未變

12、，2.5ul×120%=3 ul，再乘以二抗的蛋白濃度3.34mg/ml，則最適蛋白穩(wěn)定量為0.01mg/ml膠體金。在500 ml膠體金溶液內(nèi)加入5mg 二抗，磁力攪拌30 min，依次加入1% peg20000 20ml和5% bsa 80 ml，繼續(xù)攪拌10 min，20 000 r/min 離心20 min，沉淀物用pb緩沖液（0.02 mol/l，ph8.0）洗滌，再以20 000 r/min 離心20 min，沉淀物用金標(biāo)稀釋液（0.02 mol/l，ph8.0 tbs）稀釋至a520nm為0.8、1.0、1.2等3種濃度，過濾除菌。（2） 最適工作濃度選擇：分別用以上3

13、種濃度的金標(biāo)二抗檢測已包被不同濃度抗原的檢測點(diǎn)，根據(jù)檢測點(diǎn)顏色深淺和背景清晰度判斷效果，操作方法同1 (2) d。（3）結(jié)果：同1 (3) b, c，金標(biāo)二抗?jié)舛仍?.0時的檢測效果最好，在抗原稀釋度1:8（0.157mg/ml）仍可清晰顯示檢測點(diǎn)。繼對“血吸蟲病抗體診斷試劑國家參考品”進(jìn)行測定，進(jìn)一步驗(yàn)證了這一工作濃度的顯色效果（見1（4）。3. 人igg（試劑盒質(zhì)控點(diǎn)原料）（1）制備方法：采用辛酸提取法，從健康獻(xiàn)血者5ml血清中提取人igg。經(jīng)0.22um超濾膜過濾除菌后分裝，2ul/支，置凍干機(jī)抽成干粉，-20保存。臨用時每支加工作濃度的0.02 mol/l ph8.0 pbs緩沖液復(fù)溶

14、即可。（2）活性測定a.測定方法1) 取人igg 10 µl加190µl生理鹽水作1:20稀釋后加入比色杯內(nèi)，用分光光度計(jì)測定a280和a260od值；2) 將樣品用ph9.6碳酸鹽緩沖液從1:6400起倍比稀釋14個滴度,分別包被于酶標(biāo)板內(nèi)(100ul/孔),373小時；然后傾去液體,用洗滌液洗滌3次,每次 5 分鐘；bsa（0.5mg/ml)為陰性對照，同法操作；3) 加酶標(biāo)結(jié)合物：除空白對照孔外，每孔加入酶標(biāo)結(jié)合物2 滴， 37 培育 30 分鐘；4) 洗板：取出酶標(biāo)板，甩去孔內(nèi)液體，每孔注滿洗滌液洗滌 5 次，每次均需停留30秒后再甩凈拍干；5) 顯色：每孔加底物和

15、顯色劑各 1滴，混勻，37 避光反應(yīng)10 分鐘，加終止液 1 滴，混勻，判斷結(jié)果。b判斷依據(jù)：1) 根據(jù)公式計(jì)算：人igg濃度（mg/ml）=（1.45×a280-0.74×a260 ）×稀釋倍數(shù)；2) 肉眼觀察：不加終止液觀察，基本無色或微藍(lán)色為陰性，呈明顯藍(lán)色為陽性；3) 儀器判斷：酶標(biāo)儀上450nm讀取od值，待檢樣本孔的od值大于陰性對照2.1倍者為陽性。c結(jié)果：人igg od值a280nm 2.8619 人igg od值260nm1.7831計(jì)算公式人igg濃度（mg/ml）=（1.45×a280-0.74×a260 ）×稀

16、釋倍數(shù)；人igg濃度56mg/ml人iggod值比值人iggod值比值1:64002.56867551.37351:16384000.01990.3979961:128002.50180450.036071:32768000.013580.2715961:256002.11549742.309941:65536000.003660.0731981:512001.2928525.856991:131072000.009180.1835981:1024000.61812912.362581:262144000.006110.1221981:204800.3102796.2055821:524288

17、000.005520.1103991:4096000.097321.946396bsa0.013540.27081:8192000.05911.181997空白-0.00069-0.0138d結(jié)論：原液濃度為56mg/ml，從1:6400起作倍比稀釋，經(jīng)elisa方法檢測，最低檢測濃度為1:204800(0.3g / ml),與抗人igg的結(jié)合力強(qiáng),可用作斑點(diǎn)免疫金滲濾法質(zhì)控點(diǎn)。（3）工作濃度：人igg的作用是作為質(zhì)控點(diǎn)，包被于硝酸纖維素膜上，能夠與金標(biāo)二抗結(jié)合，產(chǎn)生紅色圓點(diǎn)，以此判斷金標(biāo)二抗處于有效期內(nèi)；如不能出現(xiàn)紅色圓點(diǎn)，則金標(biāo)二抗失效。因此，試驗(yàn)?zāi)康木褪沁x擇能清晰產(chǎn)生反應(yīng)色度的人igg濃

18、度。a.方法：1) 人igg原液濃度測定：以0.02 mol/l ph8.0 pbs將原液作1:20稀釋，用紫外分光光度儀測定 a280和a260od值，根據(jù)公式2計(jì)算濃度（mg/ml）=（1.45×a280-0.74×a260）×稀釋倍數(shù)；2) 以0.02 mol/l ph8.0 pbs將人igg原液從1:100至1:1000 稀釋成10個稀釋度。3) 包被：將上述10個濃度的人igg分別點(diǎn)膜，在每塊空白反應(yīng)板中的硝酸纖維素膜（德國schleicher & schuell bioscience）上點(diǎn)滴0.5ul，每個濃度組包被1塊，室溫干燥2小時后加入2

19、滴封閉液，待干。 4) 效果測試：分別在上述10個濃度組的金標(biāo)反應(yīng)板中央小孔內(nèi)滴加2滴洗滌液，滲入后于滴加4滴顯色液（即金標(biāo)二抗，濃度1.0（a520值），最后加2滴洗滌液，滲入后根據(jù)檢測點(diǎn)顏色深淺判斷效果。b. 結(jié)果：1) 人igg作1:20稀釋的od值：a280為2.8619，a260為1.7831 ，根據(jù)公式（mg/ml）=（1.45×a280-0.74×a260）×稀釋倍數(shù)計(jì)算，原液濃度為56 mg/ml。2) 檢測效果金標(biāo)二抗?jié)舛热薸gg稀釋度1:1001:2001:3001:4001:5001:6001:7001:8001:9001:10001.0+&

20、#177;±±±注：色度判斷：+深，+易見， ±淺c. 最適工作濃度選擇：人igg在工作濃度1:600至1:100（約0.1mg/ml0.6 mg/ml）均能清晰顯示紅色圓點(diǎn)，均可作為判斷金標(biāo)二抗是否有效的質(zhì)控點(diǎn)。但因?qū)嶋H用量極微（每只反應(yīng)板僅需0.5 ul）, 最適工作濃度選擇1:300(0.19mg/ml)為宜。參考文獻(xiàn)1 毛守白主編.血吸蟲生物學(xué)與血吸蟲病的防治.北京：人民衛(wèi)生出版社，1990：465.2 現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)（第二版），湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002年3 丁建祖,干小仙,沈慧英,等.快速檢測抗日本血吸蟲抗體的金標(biāo)免疫滲濾法的建立及應(yīng)用j. 中國寄生蟲病防治雜志,1998,11 (4) :308-3104 辛?xí)苑?張謹(jǐn),薄淑英, 等.血吸蟲病免疫診斷試劑的質(zhì)量評價j.中國血吸蟲病防治雜志,2006,18(2):119-121.附：血吸蟲抗體檢測質(zhì)控品制備方法本品參照“血吸蟲病抗體診斷試劑國家參考品” （ 批號：20041108）低感染度抗體水平(p13)制備，作為斑點(diǎn)免疫金滲濾法試劑盒出廠檢驗(yàn)的質(zhì)控品。具體方法：將2 ml血吸蟲病陽性血清（江西省