HbA1c基礎(chǔ)知識培訓(xùn)

1、糖化血紅蛋白的基礎(chǔ)知識培訓(xùn)HbA1c定義定義l HbA1c: 葡萄糖與血紅蛋白葡萄糖與血紅蛋白鏈氨基酸末端的鏈氨基酸末端的6 6個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸結(jié)結(jié)合產(chǎn)生的一種特定的糖化血紅蛋白合產(chǎn)生的一種特定的糖化血紅蛋白l血紅蛋白被糖化后，氨基酸末端所帶血紅蛋白被糖化后，氨基酸末端所帶負(fù)電荷負(fù)電荷會(huì)增加會(huì)增加l Hb HbA A0 0：沒有結(jié)合葡萄糖的血紅蛋白沒有結(jié)合葡萄糖的血紅蛋白鏈氨基酸末端的鏈氨基酸末端的6 6個(gè)氨個(gè)氨基酸基酸l HbAHbA1c1c以百分比表示，即以以百分比表示，即以和葡萄糖結(jié)合的血紅蛋白占全部血紅蛋白的比例l正常參考范圍：正常參考范圍：4%-6%4%-6%（NGSP/DCCTNG

2、SP/DCCT標(biāo)化的方法）標(biāo)化的方法）糖化血紅蛋白-血紅蛋白的糖基化產(chǎn)物葡萄糖進(jìn)入紅細(xì)胞，在內(nèi)部與血紅蛋白發(fā)生反應(yīng)葡萄糖進(jìn)入紅細(xì)胞，在內(nèi)部與血紅蛋白發(fā)生反應(yīng)血紅蛋白葡萄糖紅細(xì)胞糖化血紅蛋白的生物合成過程（兩步）血紅蛋白葡萄糖中間產(chǎn)物中間產(chǎn)物-LA1c Schiff堿堿HbA1c第一部：快速反應(yīng)，生成不穩(wěn)定A1c（LA1c）第二步：緩慢反應(yīng)，生成穩(wěn)定的A1c（HbA1c）糖化和非糖化的血紅蛋白HbHbA0HbA1HbA1aHbA1bHbA1cHbA()HbA2()HbF()95%2%1-3.5%成人血紅蛋白分三種成人血紅蛋白分三種HbA為主要成人為主要成人Hb非糖化非糖化Hb糖化糖化Hb6-8%

3、87-89%血紅蛋白血紅蛋白HbA1c是如何計(jì)算的？A1c%=A1c/A0+HbA1離子交換色譜所分離的組分解釋（非糖尿病樣本）HbHb的組成的組成 % of Hb Hb% of Hb Hb與糖類的結(jié)合與糖類的結(jié)合HbA1a 1% HbA1a 1% HbA1與1,6-二磷酸果糖結(jié)合而成 HbA1b 1% HbA1b 1% 丙酮酸與鏈氨基末端纈氨酸結(jié)合而成 HbF 1% HbF 1% 胎兒血紅蛋白胎兒血紅蛋白LA1c 1% LA1c 1% 血紅蛋白形成血紅蛋白形成HbA1cHbA1c之前的中間產(chǎn)物之前的中間產(chǎn)物HbA1c 46% HbA1c 46% 鏈鏈氨基酸端與葡萄糖結(jié)合的產(chǎn)物氨基酸端與葡萄糖

4、結(jié)合的產(chǎn)物HbA0 HbA0 90%90% 非糖化血紅蛋白非糖化血紅蛋白 胎兒血紅蛋白在胎兒及出生6個(gè)月以內(nèi)的新生兒體內(nèi)為高濃度，6個(gè)月后基本降為成人水平婦產(chǎn)科 HbA1c主要用于糖尿病妊娠的篩查色譜圖舉例 HbA1a & HbA1b HbA的次要組分的次要組分LA1c (希夫堿希夫堿) 和氨甲基乙和氨甲基乙?；孽；?Hb HbA1c A0總面積為 100萬萬-500萬萬 A1c 結(jié)果結(jié)果小結(jié)什么是HbA1c和HbA0？A1c被糖化后什么電荷增加了？為什么糖化血紅蛋白在A0峰之前被洗脫下來？測量糖化血紅蛋白為什么要先對樣本溶血？HbA1c是如何計(jì)算的？成人血紅蛋白包括哪幾種？HbF

5、是什么？濃度高時(shí)是否會(huì)對A1c造成干擾？為什么？伯樂的糖化試劑能報(bào)告HbF嗎？為什么？糖化的血紅蛋白包括哪幾種？HbA1c實(shí)驗(yàn)室檢測方法常見的HbA1c檢測方法 主要有三種檢測方法: 1.離子交換高壓液相色譜（離子交換高壓液相色譜（HPLCHPLC） 直接分離直接分離HbA1cHbA1c2.硼酸親和高壓液相色譜 檢測產(chǎn)物為總糖化血紅蛋白3. 免疫法 檢測產(chǎn)物為檢測產(chǎn)物為HbA1cHbA1c各檢測方法的精密度 方法 精密度 電泳 +免疫法 +低壓液相色譜（LPLC） +高壓液相色譜（HPLC） + 各檢測方法的分析物HbA ( 2 2)HbA1HbA0HbA1aHbA1bHbA1c非糖化成分非糖

6、化成分糖化成分糖化成分離子交換色譜和免疫法檢測物離子交換色譜和免疫法檢測物硼酸親和色譜檢測物硼酸親和色譜檢測物離子交換HPLC檢測糖化血紅蛋白HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)方法 DCCT研究中唯一所采用的HbA1c檢測方法 NGSP標(biāo)準(zhǔn)化的參考方法 檢測原理： 基于HbA1c 與其它血紅蛋白組分所帶電荷不同，在一定的緩沖液離子強(qiáng)度下可與分析柱樹脂表面偶聯(lián)的離子基團(tuán)有不同程度的結(jié)合，從而將HbA1c與其它組分(HbA1b, HbA1a,HbF,HbA0) 區(qū)分開而得到分離。離子交換HPLC檢測原理色譜圖的橫坐標(biāo)是時(shí)間，縱坐標(biāo)是信號強(qiáng)度，反映Hb各分析峰濃度的高低被校準(zhǔn)的峰被陰影化被校準(zhǔn)的峰被陰影化離子交換H

7、PLC的特點(diǎn) 采用采用離子交換原理離子交換原理基于基于HPLCHPLC的平臺的平臺HPLC方法的試劑組成包括：分析柱、緩沖液、校準(zhǔn)品q采用分析柱內(nèi)填充的離子交換樹脂作為固定相，樹脂上面偶采用分析柱內(nèi)填充的離子交換樹脂作為固定相，樹脂上面偶聯(lián)了帶電荷基團(tuán)聯(lián)了帶電荷基團(tuán)q以可形成以可形成不同離子強(qiáng)度不同離子強(qiáng)度洗脫梯度的緩沖試劑作為流動(dòng)相。洗脫梯度的緩沖試劑作為流動(dòng)相。q溯源性由試劑盒配套的校準(zhǔn)品保證溯源性由試劑盒配套的校準(zhǔn)品保證分離效果的影響因素分離效果的影響因素 分析柱內(nèi)的填充物（顆粒越小，分離效果越好，速度越慢）分析柱內(nèi)的填充物（顆粒越小，分離效果越好，速度越慢） 分析柱柱長（越長，分離效果

8、越好，速度越慢）分析柱柱長（越長，分離效果越好，速度越慢）離子交換HPLC的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 1.全自動(dòng) 2.結(jié)果準(zhǔn)確，可靠 分析物為HbA1c。 高分辨率方法可同時(shí)區(qū)分常見血紅蛋白變異體，給臨床醫(yī)生已額外的醫(yī)療提示 3. 精密度好 CV5%CV%5%）只報(bào)只報(bào)HbA1cHbA1c一個(gè)數(shù)值，不能檢測血紅蛋白變異體一個(gè)數(shù)值，不能檢測血紅蛋白變異體高血紅蛋白高血紅蛋白F F樣本的樣本的HbA1cHbA1c檢測結(jié)果偏低檢測結(jié)果偏低嚴(yán)重的黃疸和高脂血影響比色結(jié)果嚴(yán)重的黃疸和高脂血影響比色結(jié)果國產(chǎn)糖化試劑的國產(chǎn)糖化試劑的非標(biāo)準(zhǔn)化問題非標(biāo)準(zhǔn)化問題小結(jié) 糖化血紅蛋白的主要檢測方法有什么？檢測產(chǎn)物分別是什么

9、？ HPLC的中文全稱是什么？ HbA1c檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法是？為什么？ 離子交換HPLC的檢測原理是基于什么的不同？檢測試劑應(yīng)該包括哪些主要的組分？ 分析柱中填充的是什么？上面偶聯(lián)了什么？不同緩沖液的區(qū)別是什么？ 不同離子交換HPLC方法的分辨率一樣嗎？分辨率的關(guān)鍵影響因素是什么？ 糖化血紅蛋白檢測結(jié)果的溯源性由哪種試劑保證？ 伯樂糖化產(chǎn)品的色譜圖橫坐標(biāo)是什么？縱坐標(biāo)是什么？ 硼酸親和色譜法的檢測原理是基于什么？色譜圖有幾個(gè)峰？分別是什么？ 硼酸親和色譜法是怎么檢測HbA1c的？ 免疫法檢測糖化血紅蛋白的原理是基于什么反應(yīng)？ 國產(chǎn)免疫法試劑的缺點(diǎn)有哪些？HbA1c實(shí)驗(yàn)室檢測干擾因素常見檢測干擾

10、因素非方法學(xué)特異的干擾因素改變紅細(xì)胞壽命的生理?xiàng)l件可影響 HbA1c結(jié)果導(dǎo)致檢測結(jié)果假性偏低 鐮刀細(xì)胞性貧血和溶血性貧血 維他命 C和 E （抑制糖化作用）導(dǎo)致檢測結(jié)果假性偏高 鐵缺乏性貧血，脾切除術(shù)后 真性紅細(xì)胞增多癥（高原地區(qū)）妊娠期 Hb濃度偏低，HbA1c比正常人偏低 方法學(xué)特異的干擾因素 血紅蛋白變異體 (如.HbS, HbC， HbD, HbE) 血紅蛋白衍生物 (乙酰化、甲酰化衍生物等) 長期服用阿斯匹林的病人，體內(nèi)乙?；疕b高，結(jié)果偏高 腎衰病人的氨甲?；?，導(dǎo)致結(jié)果偏高 Schiff堿（A1c中間產(chǎn)物） 某些血糖濃度急劇變化的1型糖尿病人，Schiff堿升高， 胎兒血紅蛋白H

11、bF 嚴(yán)重的黃疸、高血脂血紅蛋白變異體的發(fā)生率全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過一千種血紅蛋白變異體全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過一千種血紅蛋白變異體全球的血紅蛋白變異體發(fā)生率的最新數(shù)據(jù)是全球的血紅蛋白變異體發(fā)生率的最新數(shù)據(jù)是7%7%* *非洲裔美國人：HbSHbS 7.8%；HbC 2.3%19881988年年,2.5,2.5 , ,河南河南* * *20012001年年,3.2 ,3.2 , ,絲綢之路絲綢之路* * * *云南：云南：4%4%云南省的阿昌族HbE的發(fā)病率為41.2%*Kohne E. Hemoglobinopathies: clinical manifestations, diagnosis,

12、and treatment. 1. Dtsch Arztebl Int. 2011;108(31-32):532-540.*河南省異常血紅蛋白的調(diào)查與化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析研究,新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1988, (02) 9-12*中國絲綢之路地區(qū)血紅蛋白病的遺傳流行病學(xué)的特點(diǎn)，人類學(xué)學(xué)報(bào)，2001，V20變異體對HbA1c準(zhǔn)確性的影響Ross J.Molinaro,Targeting HbA1c:standardization and clinical laboratory measurement. MLO Jan,2008,血紅蛋白變異體對HbA1c結(jié)果準(zhǔn)確性的影響 對部分方法的檢測結(jié)對部分方法的檢測

13、結(jié)果準(zhǔn)確性有影響果準(zhǔn)確性有影響例：例： A0A0后有變異體的糖尿后有變異體的糖尿病人樣本，病人樣本， HbFHbF正常正常 G8G8標(biāo)準(zhǔn)模式試劑的檢標(biāo)準(zhǔn)模式試劑的檢測結(jié)果測結(jié)果偏低偏低1%1%G8 Variant 模式試劑（1.6分鐘/test）G8 標(biāo)準(zhǔn)模式試劑（1.0分鐘/test）血紅蛋白變異體與血糖監(jiān)控血紅蛋白變異體會(huì)影響紅細(xì)胞的壽命，紅細(xì)胞的壽命血紅蛋白變異體會(huì)影響紅細(xì)胞的壽命，紅細(xì)胞的壽命會(huì)影響糖化血紅蛋白的生成會(huì)影響糖化血紅蛋白的生成這些病人或許應(yīng)該有不同的糖化血紅蛋白的監(jiān)控時(shí)間這些病人或許應(yīng)該有不同的糖化血紅蛋白的監(jiān)控時(shí)間或者改用其他指標(biāo)來評估血糖或者改用其他指標(biāo)來評估血糖小結(jié)

14、影響HbA1c檢測結(jié)果的非方法學(xué)特異的干擾因素影響HbA1c檢測的方法學(xué)特異的干擾因素有哪些？變異體與A0沒有分離開的情況下會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高還是偏低？為什么？變異體與A1c沒有分離開的情況下會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高還是偏低？為什么？血紅蛋白變異體會(huì)通過兩個(gè)方面影響糖化血紅蛋白，請?jiān)斒?。臨床上對于有血紅蛋白變異體的病人有什么建議？實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該怎么滿足臨床的這一需求？糖化血紅蛋白實(shí)驗(yàn)室檢測指南的要求20132013年中國糖尿病雜志年中國糖尿病雜志8 8月刊月刊分析系統(tǒng)的要求分析系統(tǒng)的要求測定方法要求溯源到測定方法要求溯源到IFCCIFCC參考方法，如參考方法，如NGSPNGSP認(rèn)證方法認(rèn)證方法 （NGS

15、PNGSP認(rèn)證的有效期是認(rèn)證的有效期是1 1年）年）2. 2. 實(shí)驗(yàn)室要知曉所選分析系統(tǒng)可能存在的干擾因素實(shí)驗(yàn)室要知曉所選分析系統(tǒng)可能存在的干擾因素3. POCT3. POCT方法的精確性不能滿足臨床要求，目前不能用于糖方法的精確性不能滿足臨床要求，目前不能用于糖尿病的診斷尿病的診斷中國三級醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室檢測情況數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于NCCL歷年室間質(zhì)評數(shù)據(jù)采用NGSP標(biāo)準(zhǔn)化方法的實(shí)驗(yàn)室占比81%HbA1cTotalGHBHbA1在在DCCT和和UKPD結(jié)果發(fā)表之前，美國有結(jié)果發(fā)表之前，美國有800個(gè)試驗(yàn)室在做個(gè)試驗(yàn)室在做A1c檢測，檢測，CAP實(shí)驗(yàn)調(diào)查實(shí)驗(yàn)調(diào)查顯示在不同的實(shí)驗(yàn)室，用不同的檢測方法得出的顯示

16、在不同的實(shí)驗(yàn)室，用不同的檢測方法得出的A1c結(jié)果存有巨大的差異。結(jié)果存有巨大的差異。HbA1c檢測的標(biāo)準(zhǔn)化 美國從1996年起開展國家糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃國家糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃（NGSP），在HbA1c的檢測值一致性方面取得了巨大成功 在在NGSPNGSP的中心實(shí)驗(yàn)室所采用的參考方法是的中心實(shí)驗(yàn)室所采用的參考方法是 離子交換離子交換HPLCHPLC NGSP 由指導(dǎo)委員會(huì)和實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)組成。實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)包括一級中心參考實(shí)驗(yàn)室（CPRL）、一級參考實(shí)驗(yàn)室（PRL）和二級參考實(shí)驗(yàn)室（SRL）目的: 1. 糖化血紅蛋白檢測項(xiàng)目實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化2. 以使各臨床試驗(yàn)室的檢測結(jié)果與DCCT的報(bào)告結(jié)果具有可比性

17、( 該DCCT試驗(yàn)建立了平均血糖與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系) 臨床實(shí)驗(yàn)室臨床實(shí)驗(yàn)室NGSP 網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò) 廠商廠商 校準(zhǔn)品校準(zhǔn)品1 新鮮血新鮮血NGSP 程序程序(精密度與偏差精密度與偏差) 認(rèn)證認(rèn)證2 新鮮血新鮮血能力比對測試能力比對測試3 新鮮血新鮮血NGSP標(biāo)準(zhǔn)化對標(biāo)準(zhǔn)化對A1c檢測的貢獻(xiàn)檢測的貢獻(xiàn)從無序到有序從無序到有序2008年調(diào)查顯示2000多家CAP實(shí)驗(yàn)室間使用不同的檢測方法的CVs在1.3-7.1%之間，基于A1c檢測結(jié)果已經(jīng)能夠有效的標(biāo)準(zhǔn)化 IFCC標(biāo)準(zhǔn)化20022002年年IFCCIFCC發(fā)表文件，發(fā)表文件， 正式推薦正式推薦 HbA1c HbA

18、1c檢測的參考方法為檢測的參考方法為HPLC-MS(HPLC-MS(質(zhì)譜質(zhì)譜) )或或HPLC-CE(HPLC-CE(毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳) ) 校準(zhǔn)品為純化的校準(zhǔn)品為純化的 HbAo HbAo 和和 HbA1c HbA1c 混合物，共混合物，共 6 6 個(gè)濃度個(gè)濃度 室內(nèi)室內(nèi)CV0.47CV0.472.07%2.07%；室間；室間CV1.35CV1.352.27%2.27%但是，NGSP和IFCC方法檢測HbA1c值存在1%-2%的差異IFCC%HbA1c2.13.2 4.3 5.4 6.4 7.5 8.6 9.710.7 NGSP%HbA1c456789101112偏差偏差 1.9 1.8

19、 1.7 1.6 1.6 1.5 1.4 1.3 1.3非糖尿病范圍非糖尿病范圍控制目標(biāo)控制目標(biāo)需采取治療措施需采取治療措施% HbA1c (IFCC)% HBA1c (DCM)各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)與各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)與IFCC之間的轉(zhuǎn)換之間的轉(zhuǎn)換JDS/JSCC% = 0.927*IFCC% + 1.73NGSP% = 0.915 * IFCC% + 2.15Sweden% = 0.989 * IFCC% + 0.88IFCCIFCC%HbA1c%HbA1cJDSJDS%HbA1c%HbA1c2.02.09.69.610.810.811.61

20、1.6NGSPNGSP%HbA1c%HbA1c4 46 68 810101212HbA1cHbA1c的檢測必須在世界范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化，包括參考系統(tǒng)和數(shù)值報(bào)告的檢測必須在世界范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化，包括參考系統(tǒng)和數(shù)值報(bào)告 IFCC的參考系統(tǒng)是唯一的標(biāo)準(zhǔn)化是唯一的標(biāo)準(zhǔn)化參考系統(tǒng)HbA1cHbA1c以以IFCCIFCC單位單位(mmol/mol)(mmol/mol)以及轉(zhuǎn)換的以及轉(zhuǎn)換的NGSP units (%)NGSP units (%)報(bào)告，使用報(bào)告，使用IFCC-NGSPIFCC-NGSP換換算公式算公式 需要確?；鶎犹悄虿∪菀撰@得需要確?；鶎犹悄虿∪菀撰@得IFCCIFCC和和NGSPNGSP轉(zhuǎn)換公式轉(zhuǎn)換公

21、式 雜志編輯和出版物建議采用雜志編輯和出版物建議采用SI (IFCC) SI (IFCC) 和和NGSPNGSP雙重單位報(bào)告雙重單位報(bào)告HbA1c HbA1c 糖化血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化稱謂為糖化血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化稱謂為HbA1cHbA1c，在指南或教育材料中也可以簡寫為，在指南或教育材料中也可以簡寫為A1C A1C 2010年HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化第二次全球共識 (ADA、EASD、IDF、IFCC和ISPAD) 2010 in Annals of Clinical Biochemistry, Clinical Chemistry, Clinical Chemistry and Laboratory Me

22、dicine, Diabetes Care, Diabetes Research and Clinical Practice, Diabetologia, Diabetic Medicine and Pediatric Diabetes. NGSP = 0.09148 * IFCC + 2.152 NGSP和IFCC之間的轉(zhuǎn)換NGSP = 0.09148 * IFCC + 2.152 糖化血紅蛋白糖化血紅蛋白HbA1cHbA1c HbA1c的臨床應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)室檢測相符相承實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室檢測標(biāo)準(zhǔn)化檢測標(biāo)準(zhǔn)化血糖監(jiān)控血糖監(jiān)控指標(biāo)指標(biāo) 糖尿病篩糖尿病篩查與診斷查與診斷19932010分析系統(tǒng)性能指標(biāo)要求

23、報(bào)告結(jié)果：以報(bào)告結(jié)果：以HbA1cHbA1c相當(dāng)于相當(dāng)于HbA1cHbA1c報(bào)告結(jié)果，因?yàn)橹挥羞@一個(gè)分析項(xiàng)報(bào)告結(jié)果，因?yàn)橹挥羞@一個(gè)分析項(xiàng)目才有評估并發(fā)癥發(fā)生的優(yōu)良數(shù)據(jù)庫。目才有評估并發(fā)癥發(fā)生的優(yōu)良數(shù)據(jù)庫。精密度：精密度：室內(nèi)室內(nèi)CV3%,CV3%, 以小于以小于2%2%為宜；為宜；測定質(zhì)量目標(biāo)：測定質(zhì)量目標(biāo)：0.5% HbA1c0.5% HbA1c準(zhǔn)確度：與可接受參考值的差值在準(zhǔn)確度：與可接受參考值的差值在 0.5%HbA1c0.5%HbA1c范圍內(nèi)范圍內(nèi)準(zhǔn)確度驗(yàn)證方法：準(zhǔn)確度驗(yàn)證方法： 1 1）參加室間質(zhì)評活動(dòng)參加室間質(zhì)評活動(dòng) 2 2）檢測有證參考物質(zhì)；檢測有證參考物質(zhì)； 3 3）與運(yùn)行經(jīng)過認(rèn)證系統(tǒng)的有資質(zhì)實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果進(jìn)行與運(yùn)行經(jīng)過認(rèn)證系統(tǒng)的有資質(zhì)實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果進(jìn)行比對比對注意：沒有直接的證據(jù)顯示其它檢查的數(shù)據(jù)與糖尿病長期并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(例如：總糖化血紅蛋白、果糖胺或糖化血清蛋白)實(shí)驗(yàn)室不精密度對檢測結(jié)果變異性的影響6.5%6.5%的的 HbA1cHbA1c在不同分析不精密度水平下的在不同分析不精密度水平下的95.5%95.5%離散程度離散程度不同室內(nèi)不同室內(nèi)CV對對 A1C 分析的影響分析的影響（95%的可信區(qū)間）的可信區(qū)間）CV %6.0% A1C6.5% A1C7.0% A1C25.76-6.246.24 - 6.766.