微流控液滴單分子PCR

1、n微流控液滴單分子 pcr朱志，王春明，官志超，楊朝勇*（廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系，固體表面物理化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，分析科學(xué)重點(diǎn)510實(shí)驗室，福建 廈門 361005）摘要：近年來，微流控液滴 pcr 技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于單分子的放大及分析。微流控液滴技術(shù)具有許多優(yōu)異的特性，如能將反應(yīng)分割在多個獨(dú)立的空間內(nèi)進(jìn)行，在單分散的液滴中同時進(jìn)行多個平行反應(yīng)，避免了液滴間的交叉污染，消除 pcr 偏好與非特異性放大，以及進(jìn)行快速的熱循環(huán)從而實(shí)現(xiàn)高效放大。本文將對近五年來微流控液滴領(lǐng)域的重大技術(shù)突破以及它們在單分子放大分析中的應(yīng)用如高通量篩選、下一代 dna 測序技術(shù)、稀有突變檢測等進(jìn)行評述。雖然目

2、前微流控液滴單分子 pcr 目前還在起步階段，但其已展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用前景，未來有望繼續(xù)為生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域在單分子放大分析面臨的挑戰(zhàn)提供新的解決思路。關(guān)鍵詞：單分子放大；乳液 pcr；微流控液滴；高通量；稀有突變檢測中圖分類號：o652.615microfluidic droplets for single-molecule pcrzhu zhi, wang chunming, guan zhichao, yang james chaoyong(state key laboratory of physical chemistry of solid surfaces, department of

3、chemical biology,key laboratory of analytical science, college of chemistry and chemical engineering, xiamen202530university, fujian xiamen 361005)abstract: the application of microfluidic droplet pcr for single-molecule amplification andanalysis has recently been extensively reported. microfluidic

4、droplet technology has theadvantages of compartmentalizing reactions into discrete volumes, performing highly parallelreactions in monodisperse droplets, reducing cross-contamination between droplets, eliminatingpcr bias and nonspecific amplification, as well as enabling fast amplification with rapi

5、dthermocycling. here, we have reviewed the important technical breakthroughs of microfluidicdroplet pcr in the past five years and their application to single-molecule amplification andanalysis, such as high-throughput screening, next generation dna sequencing, and quantitativedetection of rare muta

6、tions. although the utilization of microfluidic droplet single-molecule pcris still in the early stages, its great potential has already been demonstrated and will provide novelsolutions to todays biomedical engineering challenges in single-molecule amplification andanalysis.keywords: single-molecul

7、e amplification; emulsion pcr; microfluidic droplets; high-throughput;rare mutation detection350 前言有選擇性地針對單分子尤其是單個生物分子的靈敏檢測對化學(xué)、生物、醫(yī)療以及環(huán)境科學(xué)都有著重大而深遠(yuǎn)的影響1-3。 對比于群體研究的方法，針對單分子的研究能夠表征單個分子在時間軌道和狀態(tài)分布等方面的具體信息，從而可以深入探討化學(xué)和生物反應(yīng)的過程和40途徑3-6。例如，核酸分子對細(xì)胞的生理功能其著廣泛的作用：可以調(diào)節(jié)和沉默基因表達(dá)，是分子機(jī)器的結(jié)構(gòu)組成，同時還可以精確控制細(xì)胞的行為7-9。因而，單分子水平上

8、對于基因表達(dá)的靈敏檢測將在生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)和醫(yī)學(xué)診斷等方面起到重要的作用7-9分類似的相關(guān)基因也是單分子基因檢測的必須要求10,11基金項目：教育部高校博士點(diǎn)基金（200803841013)作者簡介：朱志，女，副教授，主要研究方向：dna 分子工程、微流控技術(shù)。通信聯(lián)系人：楊朝勇，男，教授，主要研究方向：微流控技術(shù)，dna 分子工程，化學(xué)生物學(xué)。 e-mail:cyyang-1-。此外，由于單堿基改變導(dǎo)致的生物活性改變和疾病發(fā)展受到越來越多的關(guān)注，準(zhǔn)確區(qū)。目前，最有前景的單分子核酸分n455055析方法就是聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）。pcr 具有將目標(biāo)物放大幾個數(shù)量級的能力，甚至可以由

9、單拷貝的基因得到成千上萬條產(chǎn)物鏈12-15。與微全分析技術(shù)和芯片實(shí)驗室緊密結(jié)合的微流控技術(shù)近年來得到了大力的發(fā)展，對現(xiàn)代化學(xué)和生物領(lǐng)域有著革新性的意義。微流控技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括減少樣品試劑消耗量、進(jìn)行高通量分析、加快反應(yīng)速率和熱傳遞、以及制作廉價便攜的裝置等。微流控技術(shù)的一個重要分支就是利用不互溶的兩相產(chǎn)生離散體積的液滴微流控技術(shù)。液滴微流控可以超高通量地產(chǎn)生 nl 至 pl 的均勻液滴，在不增加裝置體積和復(fù)雜性的前提下，可在液滴中同時進(jìn)行大量化學(xué)反應(yīng)。在過去的十年中液滴微流控技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于材料合成、分子篩選、蛋白結(jié)晶、藥物運(yùn)輸、以及單分子單細(xì)胞分析等方面16-20。本文主要綜述近年

10、來液滴微流控技術(shù)在單分子 pcr 方面的發(fā)展和應(yīng)用。首先，我們將簡要介紹傳統(tǒng)的單分子 pcr 技術(shù)及其局限性；其次，詳述液滴微流控在該研究方向的突破性進(jìn)展；最后，提供幾個由此展開的新的研究領(lǐng)域。關(guān)于液滴微流控的更為全面的綜述可以在參考其他文獻(xiàn)16, 21-24。1 傳統(tǒng) pcr 及其在單分子分析方面的局限性自 1983 年 kary mullis 發(fā)明了 dna 指數(shù)放大的 pcr 技術(shù)25,266065室的必備，并且對生命科學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域，如生物、醫(yī)學(xué)、臨床、法醫(yī)學(xué)等，產(chǎn)生了革命性的影響。由于其幾個數(shù)量級的放大能力，pcr 是單分子基因檢測方面最有前景的技術(shù)12-15。然而，為了實(shí)現(xiàn)單分子分

11、析，傳統(tǒng) pcr 必須滿足非?？量痰膶?shí)驗條件以達(dá)到最大產(chǎn)率，同時又要避免非特異性擴(kuò)增27。此外，傳統(tǒng) pcr 需要消耗大量的昂貴試劑，更存在著短序列的放大偏向性，這對于低模板濃度的單分子分析的影響是致命的13, 15。傳統(tǒng) pcr 的通量性也被實(shí)驗空間和長熱循環(huán)時間所限制，很難實(shí)現(xiàn)高通量的分析27。為了克服這些缺點(diǎn)，科學(xué)家們也提出并進(jìn)行了一些嘗試性改進(jìn)以期實(shí)現(xiàn)單分子放大分析。例如，采用嵌套式引物的兩次或多次相繼 pcr 技術(shù)可以消除影響 pcr 效率的非特異性產(chǎn)物，達(dá)到單分子分析的靈敏度28,29容易造成交叉污染。隨后，人們意識到反應(yīng)體積是單分子 pcr 的一個關(guān)鍵因素30。kalinina7

12、07580及其小組利用玻璃毛細(xì)管進(jìn)行 nl 的 pcr 放大和 taqman 探針熒光檢測放大產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)單分子檢測30。同時，隨機(jī) pcr 單分子放大和毛細(xì)管電泳檢測在微流控上的整合也為單分子檢測提供了一種新思路31。這些微型裝置通過減少反應(yīng)體積增加了初始 dna 模板的有效濃度。但是，由此帶來的高比表面積增加了管道表面和試劑、樣品的接觸，導(dǎo)致 pcr 抑制和污染。當(dāng)作用于單個 dna 模板時，這一問題尤為嚴(yán)重。此外，對于裝置和技術(shù)的特殊要求也大大限制了這些方法在單分子檢測的通量性。為了進(jìn)一步降低反應(yīng)體積同時保持 pcr 效率和通量性，發(fā)展了單分子微乳 pcr（epcr）32于一個 2-10

13、m 的液滴，其體積大約為 4.2 fl - 0.52 pl，單分子 dna 在這樣體積中的有效濃度可高達(dá) 3.2pm - 0.4nm，足以進(jìn)行單分子 pcr。較高的有效 dna 模板濃度大大減低了引物二聚體的影響，提高了 pcr 的特異性33。液滴周圍的疏水油相也有效地防止液滴內(nèi)的樣品和反應(yīng)容器壁的接觸。雖然 epcr 可以實(shí)現(xiàn)單分子放大，但是隨后的高通量處理和分析卻很難實(shí)現(xiàn)，因為去除油相后液滴將相互融合失去單克隆性。為了解決這些問題，科學(xué)家開發(fā)了一種稱為 beaming 的技術(shù)34,35每個微乳液滴中都含有一個大量引物共價相連的磁珠和單分子 dna 模板。dna 模板在磁-2-，pcr 已成

14、為生化實(shí)驗。但是，該反應(yīng)過程中需要打開反應(yīng)容器添加試劑，。epcr 利用油包水微乳在油相中產(chǎn)生大量液滴，可以同時進(jìn)行成千上萬的平行反應(yīng)。對。在 beaming 中，n85珠表面被復(fù)制放大，從而使得幾千個 dna 放大產(chǎn)物被固定在磁珠上，防止了去除油相后不同液滴中 dna 產(chǎn)物的混合。磁珠的采用可以在后續(xù)處理中很好地保持液滴的單克隆性，利用流式細(xì)胞術(shù)或光學(xué)掃描技術(shù)可在幾分鐘內(nèi)分析成千上萬的磁珠。技術(shù)上的革新使得高背景下稀有變異基因的定性和定量分析成為可能，同時也直接促使了二代高通量 dna 測序的發(fā)展36,37。在理想狀態(tài)下，每個液滴中應(yīng)該只含有一個磁珠以及相同體積和含量的模板和試9095100

15、105110115劑，使得每個液滴中的反應(yīng)條件相似，從而保證可靠和有效的結(jié)果。然而，目前常用的液滴產(chǎn)生技術(shù)，如劇烈的攪動，導(dǎo)致液滴產(chǎn)生的單分散性差、尺寸不均勻，從而使液滴中 pcr試劑的含量不均且僅有一個磁珠的液滴產(chǎn)率低。這些因素的直接結(jié)果就是低 pcr 效率、不均勻放大、短 dna 放大產(chǎn)物（250bp），同時也大大減少了液滴中成功進(jìn)行的平行反應(yīng)數(shù)量，產(chǎn)生較多無用液滴38。2 液滴微流控 pcr微流控技術(shù)能夠以每秒鐘幾千個的速度產(chǎn)生單分散性好的液滴，同時又能很好地控制液滴的尺寸和成分。由于液滴在微尺寸上的大比表面積，熱和物質(zhì)在液滴中的傳遞時間短，有利于反應(yīng)快速進(jìn)行。類似油包水微乳，液滴中的樣

16、品與管道壁的不利接觸被油相阻止。液滴微流控實(shí)現(xiàn)了單個液滴的混合、傳輸和分析的獨(dú)立控制，在單個實(shí)驗中快速產(chǎn)生大量均一的液滴，使得大量平行反應(yīng)能夠在短時間內(nèi)快速進(jìn)行，并具有很好的重現(xiàn)性?；谝陨系膬?yōu)點(diǎn)，液滴微流控被很好地應(yīng)用于 epcr，將反應(yīng)分割在離散體積中，可以同時進(jìn)行大量平行反應(yīng)，減少液滴間的交叉污染，消除 pcr 偏向性和非特異性擴(kuò)增，且液滴中的放大反應(yīng)和熱循環(huán)速度也得到提高。在此，我們將小結(jié)近年來基于液滴微流控技術(shù)的單分子 pcr 實(shí)例。2.1 無磁珠的芯片液滴微流控 epcrbeer et al. 報道了第一例 epcr 和微流控技術(shù)的成功結(jié)合39，構(gòu)建了一個芯片數(shù)字微流控實(shí)時 pcr

17、 儀器，在單一通道內(nèi)產(chǎn)生單分散液滴、進(jìn)行熱循環(huán)放大、同時實(shí)時監(jiān)測每個液滴中的擴(kuò)增結(jié)果。如圖 1a 所示，單分散的油包水液滴由交叉流 t-管道產(chǎn)生，產(chǎn)生速率 1 khz，液滴直徑依實(shí)驗條件不同在 24-31 m 間，誤差 1 m。圖 1b 展示了儀器中液滴產(chǎn)生、熱循環(huán)和熒光檢測的整合。其中，一個芯片外的閥門系統(tǒng)可以暫停液滴的產(chǎn)生，使得液滴在管道內(nèi)停止流動，進(jìn)行芯片上的熱循環(huán)和熒光監(jiān)測。由于反應(yīng)體積減少了 6 個數(shù)量級，減少了試劑的消耗量，降低了 pcr 循環(huán)的熒光閾值，實(shí)現(xiàn)了單分子 dna 放大檢測（圖 1c）。隨后，他們利用類似的系統(tǒng)進(jìn)一步發(fā)展了芯片上的單分子液滴反轉(zhuǎn)錄 pcr40。這一儀器的

18、開發(fā)大大提高了單分子 pcr 的通量，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜體系中的 dna、rna 和病毒的分離及單分子單細(xì)胞的檢測。-3-n圖 1：芯片上的單分子實(shí)時液滴 pcr39。（a）管道的設(shè)計和流體構(gòu)造。（b）實(shí)時液滴 pcr 的裝置原理120125130135圖。（c）實(shí)時液滴 pcr 數(shù)據(jù)對比：每個液滴中分別含有 7、0.06 和 0 個 dna 拷貝。fig. 1 on-chip, real-time, single-molecule pcr in picoliter droplet reactors 39. (a) overall channel and flowconfiguration. (b)

19、schematic of the integrated instrument for real-time pcr in droplets. (c) real-time pcr datafrom picoliter droplets at an estimated 7, 0.06, and 0 copies of genomic dna per single droplet, respectively.然而，上述裝置需對整個裝置進(jìn)行加熱，限制了熱循環(huán)的速率和通量。為了進(jìn)一步提高單分子液滴 pcr 的通量，科學(xué)家們提出了一些新的裝置設(shè)計。kiss et al.設(shè)計了一種連續(xù)流體的實(shí)時 pcr 體系

20、（圖 2）41。如圖 2b 所示，該裝置利用流動聚焦技術(shù)以 500/s 的速率產(chǎn)生成大量含有 dna 模板和 pcr 試劑的液滴，然后這些液滴在流動油相的帶動下在芯片內(nèi)流動，依次交替穿過芯片上固定加熱器控制的變性區(qū)和退火區(qū)。這一裝置的優(yōu)點(diǎn)在于加熱區(qū)域固定，無需對整個芯片進(jìn)行熱循環(huán)，從而可以獲得更短的熱循環(huán)時間（55s/循環(huán)）和更高的pcr 效率。通過在芯片內(nèi)設(shè)計周期性地只能通過單個液滴的瓶頸區(qū)域，整個 pcr 放大的過程可以在這些特殊的區(qū)域被實(shí)時監(jiān)測（圖 2c）。該裝置實(shí)現(xiàn)了對一條 245-bp 的 dna 進(jìn)行放大，完成 35 個循環(huán)僅耗時 35 分鐘，而且 dna 的最低濃度可以達(dá)到 16

21、7 個液滴中只有一條模板 dna，成功地證明了流動 pcr 芯片在高通量單分子 dna 放大和定量上的應(yīng)用。圖 2：連續(xù)流體液滴 pcr 芯片41。（a）裝置的整體示意圖。（b）液滴在噴嘴處產(chǎn)生的圖像。（c）均勻液滴在管道內(nèi)的流動和單個液滴依次通過瓶頸的圖像。fig. 2 image of continuous flow droplet pcr chip41. (a) schematic of the overall flow configuration. (b) opticalimage of droplet generation at the nozzle. (c) optical ima

22、ge of uniform droplets in the downstream channel andflowing through one of the neckdowns.-4-n140145150155160圖 3：圓盤式連續(xù)流體液滴 pcr 芯片42。裝置包括油相進(jìn)口（a）和兩個水相進(jìn)口（b1 和 b2），在 t-管道（c）中產(chǎn)生液滴。液滴經(jīng)過中心加熱區(qū)（d）變性，然后駛往周圍低溫區(qū)（e）進(jìn)行退火和延伸。隨后液滴再次回到中心區(qū)開始一個新的熱循環(huán)。最后 34 個循環(huán)結(jié)束，液滴離開裝置（f）。fig. 3 design of the continuous-flow radial pcr

23、device for single-molecule dna amplification42. the devicecontains an oil inlet (a) that joins two aqueous inlet channels (b1 and b2) to form droplets at a t-junction (c). thedroplets pass through the inner circles in the hot zone (d) to ensure initial denaturation and travel on to theperiphery in 2

24、00-m wide channels where annealing and extension occur (e). the droplets then flow back to thecenter where the dna is denatured and a new cycle begins. finally, the droplets exit the device after 34 cycles (f).同時，schaerli et al. 報道了另一種流動液滴 pcr 芯片的設(shè)計42。如圖 3 所示，他們設(shè)計了一種圓盤式的芯片，中心部位為 dna 變性的加熱區(qū)，周邊為 dna 退

25、火和延伸的低溫區(qū)。液滴由交叉流 t-管道產(chǎn)生，然后在流動油相的推動下從中心流向外圍再流回中心區(qū)域，依次循環(huán)，通過各個溫度區(qū)域，完成 pcr 的熱循環(huán)。利用羅丹明 b 的熒光壽命成像來監(jiān)測液滴內(nèi)的溫度，從而可以精確控制各個區(qū)域的溫度，確保 pcr 效率。但是，最終產(chǎn)物的分析需要在芯片外通過凝膠電泳、實(shí)時 pcr 或者測序來完成。這一裝置可以實(shí)現(xiàn) 17 分鐘內(nèi)對85-bp 的 dna 實(shí)現(xiàn) 34 個 pcr 循環(huán)，最低濃度為每個液滴中含有 0.3 個 dna 模板。對長鏈dna（505-bp）的放大效率不是很高。上述兩個實(shí)例證明了液滴中的高通量單分子 dna 放大，為液滴微流控 pcr 的發(fā)展開辟

26、了道路。2.2 基于磁珠的液滴微流控 epcr如前所述，從簡單的 epcr 到更為廣泛應(yīng)用的 beaming 技術(shù)，pcr 放大的后續(xù)高通量分析和處理得到了大幅提高。因此，自從實(shí)現(xiàn)了微流控液滴技術(shù)上的 epcr，科學(xué)家們一直在探索 beaming 技術(shù)和液滴微流控的結(jié)合途徑，以期實(shí)現(xiàn)可控的液滴產(chǎn)生、便捷的操作和-5-n靈活的后續(xù)分析處理。近年來終于在這方面有了一些突破性進(jìn)展。將磁珠應(yīng)用于液滴微流控的最大難點(diǎn)在于液滴產(chǎn)生過程中磁珠容易在注射器內(nèi)沉降。165170175180185kumaresan et al. 通過在玻璃-pdms-玻璃的雜和液滴產(chǎn)生器（dg）的三通閥中引入隔膜泵，成功地解決了

27、這一問題，實(shí)現(xiàn)對液滴尺寸、產(chǎn)生速率、磁珠傳輸和包裹的控制（圖 4）38，從而發(fā)展了一種高通量單拷貝的基因放大技術(shù)（scga）。在芯片上，dna 或者細(xì)胞、固定有引物的磁珠和 pcr 試劑被一同包裹進(jìn)液滴中。然后在芯片外完成 pcr 放大過程，破乳，收集磁珠，便于后續(xù)分析處理。該研究小組報道了首例 在磁珠上從單拷貝模板獲得 100amol 大于 600 bp 的 dna 放大產(chǎn)物，可直接應(yīng)用于二代 dna 測序和高通量單細(xì)胞基因分析。圖 4：單拷貝基因放大技術(shù)（scga）38。（a）在芯片上產(chǎn)生含有 dna 或細(xì)胞、磁珠和 pcr 試劑的液滴，收集于試管中進(jìn)行熱循環(huán)。（b）每個有效的液滴中含有反

28、向引物共價相連的磁珠、熒光染料標(biāo)記的正向引物和單拷貝的靶標(biāo) dna。pcr 反應(yīng)在磁珠表面產(chǎn)生熒光標(biāo)記的雙鏈 dna 產(chǎn)物。（c）裝置示意圖，包括pcr 溶液進(jìn)口、兩個油相進(jìn)口和液滴出口（紅色）。三層結(jié)構(gòu)的空氣泵與芯片相整合，用于控制 pcr 試劑的傳輸。（d）三種條件下 pcr 效率的對比：380 bp ( 175 amol/bead), 624 bp ( 155 amol/bead), and 1139 bp( 10 amol/bead) 。（e）流式細(xì)胞術(shù)對 624 bp 產(chǎn)物的分析：每個液滴中含有 1 個（上圖）或 0 個模板（下圖）。fig. 4 single copy geneti

29、c amplification (scga) 38. (a) monodisperse droplets containing target dna or cells,beads and the pcr reagent (blue) are formed in a carrier oil (yellow) at the cross-injector and routed into a tube fortemperature cycling. (b) each functional pcr droplet contains a bead covalently labeled with the r

30、everse primer,dye-labeled forward primer, and a single target copy. subsequent steps of pcr generate dye-labeleddouble-stranded product on the bead surface. (c) layout of the device, showing the pcr solution inlet, the two oilinlets, and the droplet outlet ports (red). a three layer(glass-pdms-glass

31、) pneumatically controlled micropump isintegrated on-chip to deliver pcr reagent. (d) comparison of pcr yields for 380 bp ( 175 amol/bead), 624 bp( 155 amol/bead), and 1139 bp ( 10 amol/bead) amplicons. (e) flow cytometry analysis of beads carrying a624 bp product amplified from 1 template per dropl

32、et (upper) and 0 template per droplet (lower).-6-n190195200205210215220圖 5：微流控微乳產(chǎn)生陣列裝置（mega）43。（a）4 通道的 mega 裝置示意圖，三通閥空氣泵控制著 4個噴嘴的液滴產(chǎn)生。（b）32 通道的 mega 裝置示意圖，8 個空氣泵陣列控制著 32 個噴嘴的液滴產(chǎn)生。（c）96 通道的 mega 裝置示意圖，左上方是含有 4 個 t 型噴嘴的單個結(jié)構(gòu)單元示意圖，右上方顯示了三對共軸閥門和溝槽組成的空氣泵結(jié)構(gòu)。（d）96 通道的 mega 裝置內(nèi)部構(gòu)造詳圖，由樹脂玻璃構(gòu)成的模塊控制油相的進(jìn)口和收集微乳液滴

33、。（e-f）96 通道 mega 裝置用于細(xì)菌 o157 的檢測，結(jié)果與輸入值一致：（e）0.94/103 vs 1/103(10 cpd) 和（f） 0.85/104 vs 1/104 (100cpd)。fig. 5 microfluidic emulsion generator array (mega) devices 43. (a) layout of a glass/pdms/glass hybridfour-channel mega device with a pneumatically controlled three-valve micropump integrated to d

34、rive fournozzles for droplet generation. (b) design of a 32-channel mega device using an array of eight identicalmicropumps to operate 32 nozzles simultaneously. (c) layout of 96-channel mega on a 4 in. wafer composed ofa single ring pump and 96 droplet generators. inset: close-ups of a single repea

35、ting unit composed of four t-shapednozzles (left) and the pump structure schematically showing three pairs of coaxial ring-shaped valves anddisplacement trenches (right). (d) exploded view of the complete four-layer 96-channel mega device and theplexiglass assembly module used to infuse oil and to c

36、ollect the generated emulsion. (e-f) e. coli o157 detectionusing a 96-channel mega shows the measured o157 ratios consistent with the inputs: (e) 0.94/103 vs 1/103(10cpd) and (f) 0.85/104 vs 1/104 (100cpd).第一代的 dg 的最大缺陷在于液滴的產(chǎn)生效率較低，僅為 6 hz。為了拓展 dg 的應(yīng)用，必須提高其液滴產(chǎn)生的通量性，從而可以在高背景下對低頻目標(biāo)物進(jìn)行檢測。由此，單通道的 dg 被升級為

37、 4、32、或 96 的多通道裝置（mega）， 最多每小時可產(chǎn)生 340 萬個 nl 液滴43。如圖 5 所示，芯片上的隔膜泵提高了足夠的動力同時產(chǎn)生多個液滴，對稱性的設(shè)計保證了流體的傳輸。利用這一裝置，該研究小組證明了針對不同細(xì)胞和靶標(biāo)的多元單分子 pcr。由于采用了較大的磁珠（34 m），其表面可以被有效地固定上多種不同的正向引物，pcr 混合試劑中含有不同熒光染料標(biāo)記的反向引物。單個細(xì)胞、磁珠和 pcr 試劑被包裹進(jìn)每一個液滴中，然后進(jìn)行 pcr 熱循環(huán)放大，破乳收集磁珠，隨后通過多色細(xì)胞流式儀進(jìn)行快速分析。該方法實(shí)現(xiàn)了在 1/105 的高背景下的病原體識別和定量，證明了多元 mega

38、技術(shù)在單分子和單細(xì)胞水平上的高通量、大規(guī)模的定量分析應(yīng)用。2.3 基于瓊脂糖液滴微流控的單分子 epcr由于附著引物的磁珠可以將單分子或單細(xì)胞 pcr 得到的擴(kuò)增產(chǎn)物固定在磁珠上，大大便捷了后續(xù)高通量的分析和處理。然而，磁珠導(dǎo)致的空間位阻和電荷排斥也給 pcr 帶來了一系列問題，包括低 pcr 效率（ 磁珠 epcr 的效率僅為 40% 38）和短 pcr 擴(kuò)增產(chǎn)物。而且，根據(jù)泊松分布，當(dāng)模板濃度較稀時，同時含有目標(biāo)分子和磁珠的有效液滴產(chǎn)率很低，大量的液滴僅含有目標(biāo)分子，或僅含有磁珠，或為空液滴，導(dǎo)致試劑浪費(fèi)，也影響 pcr 效率 。-7-n225230235240245250圖 6：基于瓊脂

39、糖液滴微流控的單分子 epcr44。（a）瓊脂糖微乳液滴微流控用于單分子基因分析的示意圖，系統(tǒng)稀釋的模板被包含在 nl 的油包瓊脂糖液滴，進(jìn)行熱循環(huán) pcr 放大，隨后降溫將瓊脂糖液滴固化為瓊脂糖微球，便于后續(xù)的基因分析。（b-c）瓊脂糖微球的熒光顯微鏡成像：（b） 1.5 和 （c） 0 拷貝/微球。（d）微球包含 pcr 產(chǎn)物的比例，泊松分布得到的理論值（藍(lán)色）與實(shí)驗值（綠色）基本相符。fig. 6 agarose droplet microfluidics for single-molecule emulsion pcr44. (a) schematics of the agarosee

40、mulsion droplet microfluidic method for single copy genetic analysis. statistically diluted templates areencapsulated into uniform nanolitre agarose-in-oil droplets, which are then thermally cycled for pcr amplification.following epcr, the droplets are cooled to gelate to agarose beads for downstrea

41、m genetic analysis. (b-c)fluorescence microscope images of agarose beads after amplification from template concentrations of (b) 1.5 and(c) 0 copy/bead. (d) percentage of microbeads carrying pcr product. the theoretical value (blue) was calculatedaccording to poisson distribution and the observed va

42、lue (green) was the statistic result according to theexperimental data.為了解決這些挑戰(zhàn)性問題同時保持 dna 在液滴內(nèi)的單克隆性，我們研究小組最近利用瓊脂糖取代傳統(tǒng)的磁珠作為 dna 的載體44。如圖 6 所示，利用流動聚焦技術(shù)產(chǎn)生的油包瓊脂糖液滴中包含有瓊脂糖溶液、pcr 試劑和 dna 模板。瓊脂糖有一個非常特殊的熱響應(yīng)溶膠-成膠轉(zhuǎn)變特性。瓊脂糖在所有的 pcr 溫度區(qū)域均以液態(tài)存在，從而避免了固相空間位阻，使得 pcr 能高效進(jìn)行。隨后，簡單地將瓊脂糖液滴降溫至低于其凝膠點(diǎn)，使瓊脂糖從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，即可形成瓊脂糖

43、微球。由于，pcr 正向引物已被固定在瓊脂糖上，放大得到的產(chǎn)物也就被固定在瓊脂糖微球中，從而類似磁珠的效果，保持了擴(kuò)增產(chǎn)物的單克隆性，便于后續(xù)的靈活分析和處理，例如流式細(xì)胞術(shù)、dna 測序以及長期保存等。該方法不需要同時包裹模板和含有引物的磁珠，保證了高通量的有效液滴產(chǎn)生（500 hz）和高 pcr 效率（95 %），為單拷貝基因分析研究提供一種新的思路。3 液滴微流控 pcr 的應(yīng)用最近，液滴微流控 pcr 在技術(shù)方面的迅速發(fā)展已經(jīng)證明了該技術(shù)的優(yōu)越性并被廣泛地應(yīng)用于生物、化學(xué)等領(lǐng)域，尤其在單分子放大和分析方面的優(yōu)勢更加明顯。在此，我們將主要介紹該技術(shù)在三個重要科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。-8-n3.1

44、 高通量篩選近幾十年來，生物學(xué)家一直致力于開發(fā)高通量篩選的各種技術(shù)，以期從較大的文庫中獲得更多功能性的基因和蛋白45-47。其中一種特別的技術(shù)是的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)255260265270275280（selex），通過篩選獲得針對靶標(biāo)具有高結(jié)合力和高選擇性的 dna 或 rna 的核酸適配體48-52。selex 技術(shù)的核心是從一個含有 1014-1016 條單鏈 dna 的文庫中進(jìn)行 8-30 輪的篩選和放大，逐步富集得到核酸適配體48-50。經(jīng)過多輪的篩選后得到的富集 dna 文庫將被克隆進(jìn)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)菌。然后細(xì)菌培養(yǎng)，挑選單克隆菌落，進(jìn)行 dna 測序，獲得核酸適配體的候選者。

45、利用生物統(tǒng)計學(xué)的分析方法，可能的候選者將被化學(xué)合成出來，然后逐一表征其結(jié)合力和特異性。這樣的過程耗時費(fèi)力、低效且昂貴。圖 7：基于瓊脂糖液滴微流控技術(shù)的核酸適配體篩選53。（a）實(shí)驗流程圖，由傳統(tǒng) selex 獲得的富集文庫被分散進(jìn)單個的瓊脂糖液滴中，進(jìn)行單分子液滴 pcr，隨后降溫將瓊脂糖液滴固化為瓊脂糖微球，用sybr 綠色染料對 dna 進(jìn)行染色，挑選出高熒光的微球，對每個微球中的 dna 進(jìn)行結(jié)合力的考察，鑒別核酸適體序列。（b-c）pcr 放大后 sybr 綠色染料染色后的瓊脂糖微球的顯微鏡成像：（b） 0 和 （c）1.5 拷貝/微球。（d-e）流式細(xì)胞術(shù)對單克隆微球中的 dna

46、對 shp2 蛋白（d）和 gst 蛋白（e）的結(jié)合力考察。fig. 7 aptamer screening by agarose droplet microfluidic technology53. (a) schematic working-flow. singledna sequences of an enriched library obtained by traditional selex are encapsulated individually into agarosedroplets for high-throughput single copy dna amplificati

47、on. the resulting agarose droplets are cooled to becomeagarose beads and stained with sybr green in order to pick out high fluorescent beads containing dna colonies.binding affinity of dna in each fluorescent bead against target molecule are screened and aptamers are identified.(b-c) microscope imag

48、es of agarose beads after pcr amplification and sybr green staining at dna templateconcentration of 0 (b) and 0.3 copies/droplet (c). (d-e) binding assay of dna in clonal beads with shp2 protein(d) and gst protein (e) monitored by flow cytometry.為了解決上述問題，最近我們發(fā)展了一種基于瓊脂糖液滴微流控的 epcr 技術(shù)，直接從復(fù)雜的單鏈 dna 文庫中

49、篩選核酸適配體53。如圖 7a 所示的實(shí)驗流程圖，針對癌癥標(biāo)志物shp2 蛋白進(jìn)行篩選獲得的 dna 富集文庫被系統(tǒng)稀釋并在芯片上被包裹進(jìn)單個瓊脂糖液滴中，使得每個液滴至多含有一條 dna 序列，通過 pcr 進(jìn)行放大擴(kuò)增，產(chǎn)生單克隆的瓊脂糖微球。dna 染色后，含有 dna 的明亮微球被挑選出來（圖 7b-c）。利用高通量的熒光流式細(xì)胞術(shù)，對單克隆微球中的單鏈 dna 進(jìn)行結(jié)合力表征（圖 7d-e）。 那些具有高結(jié)合力-9-n和特異性的單鏈 dna 序列被挑選出來作為核酸適配體，或者被 dna 測序，或者即可直接用于后續(xù)的生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗。與傳統(tǒng)的克隆-測序-合成-表征的實(shí)驗流程相比，我們的方法

50、利用285290液滴微流控的分割性，從含有大量序列的 dna 文庫中獲得僅含有單一序列的液滴，在未知序列信息的前提下，對每一條序列進(jìn)行表征，使得整個過程更加快速、有效、經(jīng)濟(jì)。該方法還可以進(jìn)一步推廣應(yīng)用于其他分子進(jìn)化技術(shù)，如 mrna 展示、噬菌體展示等等。3.2 下一代 dna 測序dna 測序已被廣泛地應(yīng)用于診斷學(xué)、生物技術(shù)、法醫(yī)生物學(xué)、生物信息學(xué)等領(lǐng)域7, 54, 55。人類基因組工程也已與 2003 年順利完成。然而，為了將 dna 測序技術(shù)真正應(yīng)用于人們?nèi)粘５尼t(yī)學(xué)診斷和醫(yī)療保健，高準(zhǔn)確性、長程連續(xù)性、高通量及低成本依舊是必須解決的問題，也是科學(xué)家發(fā)展下一代測序技術(shù)的主要目標(biāo)。其中，消除

51、傳統(tǒng)的克隆技術(shù) dna 文庫準(zhǔn)備法是下一代測序發(fā)展的首要解決問題?；?beaming 的微乳技術(shù)已經(jīng)成為快速、經(jīng)濟(jì)的取代法34,35。但是，由于產(chǎn)生的微乳體積小且不均勻，該方法依舊存在著非特異性擴(kuò)增、放大295300305鏈長有限（250 bp）等許多問題 。kumaresan et al. 發(fā)展了一種高通量的 scga 技術(shù)，并證明了它在 dna 測序方面的應(yīng)用38。芯片上可以很容易地產(chǎn)生均勻且尺寸可控的液滴（2-5nl）并包含有 34 m 的磁珠。與 beaming 技術(shù)中小磁珠和小液滴相比，大磁珠具有更大的表面積可以標(biāo)記上足夠多的正向引物（大約每個磁珠上 4.4 fmol 正向引物），同時反向引物等其他 pcr 試劑的含量也達(dá)到 10 倍過量，保證了 pcr 的效率43。如圖 4d-e 所示，每個磁珠上可產(chǎn)生 175 amol 的 380 bp dna 產(chǎn)物， 150amol 的 624 bp dna 產(chǎn)物，或者10 amol 的 1139 bp dna 產(chǎn)物。其中從