流式原理培訓(xùn)

1、流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)-理論及應(yīng)用理論及應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容流式細(xì)胞術(shù)簡(jiǎn)介流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用 細(xì)胞周期檢測(cè) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)流式細(xì)胞儀預(yù)約使用規(guī)范附二院分析型流式細(xì)胞儀附二院分析型流式細(xì)胞儀BD Canto II 二激光六色(自動(dòng)上樣，同時(shí)容納40個(gè)樣本)488nm 藍(lán)激光633nm 紅激光Beckmen Cytoflex 雙激光六色（單上樣管，半自動(dòng)上樣）488nm 藍(lán)激光635nm 紅激光流式細(xì)胞儀基本構(gòu)造流式細(xì)胞儀基本構(gòu)造 液流系統(tǒng)流動(dòng)室液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)光源光束收集系統(tǒng) 電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)熒光信號(hào)熒光信號(hào) 電信號(hào)電信號(hào) 數(shù)字信號(hào)數(shù)字信號(hào) 流式細(xì)胞術(shù):用于對(duì)懸懸浮浮于流體中的微

2、小顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)和分選。這種技術(shù)可以用來(lái)對(duì)流過(guò)光學(xué)或電子電子檢測(cè)器的一個(gè)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的多種多種參數(shù)參數(shù)分析。流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（ Flow Cytometry, FCM）鞘液Sheath流式細(xì)胞術(shù)光信號(hào)類(lèi)型流式細(xì)胞術(shù)光信號(hào)類(lèi)型 散射光信號(hào)：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)， 是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光前向散射光(forward scatter, FSC);側(cè)向散射光側(cè)向散射光(side scatter, SSC) 熒光信號(hào)自發(fā)熒光自發(fā)熒光 ：微弱特異熒光特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。散射光信號(hào)散射光信號(hào)FSCFSC和和 SSC SSC當(dāng)顆粒通過(guò)聚焦光束時(shí)，激光向各個(gè)方向散射。

3、與激光束方向同軸的稱(chēng)前向角散射光信號(hào)（FSC）。與激光束垂直的稱(chēng)側(cè)向角散射光信號(hào)（SSC）。FSC：反應(yīng)細(xì)胞大小和活力SSC：反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)變化 FSC/SSCFSC/SSC的作用的作用 實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。熒光信號(hào)熒光信號(hào)當(dāng)熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過(guò)激光束時(shí)，燃料吸收光子躍遷到高能級(jí)，返回基態(tài)時(shí)，染料釋放出能量，以光的形式釋放。這種發(fā)出的光成為熒光。熒光通道熒光通道散射光通道: FSC和SSC通道；熒光通道 通道命名方式：以FL(fluorescence)加數(shù)字命名，如FL1、FL2、FL3等

4、。以該通道接收的主要熒光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。FLFL的作用的作用熒光素分子熒光素分子激發(fā)光波長(zhǎng)激發(fā)光波長(zhǎng)（nm）發(fā)射光波長(zhǎng)發(fā)射光波長(zhǎng)（nm）中文名中文名FITC490520異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白別藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻紅蛋白藻紅蛋白-花青素花青素5PE-Cy7496/546767藻紅蛋白藻紅蛋白-花青素花青素7Alexa Flour 488495519Alexa Flour 647650665常用熒光染料常用熒光染料499nm

5、藍(lán)色熒光（藍(lán)色熒光（Blue）； 500-549nm，綠色熒光（，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（，黃色熒光（Yellow） 585-615nm，橙色熒光（，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（，紅色熒光（Red）； 700nm，遠(yuǎn)紅外熒光（，遠(yuǎn)紅外熒光（Far-Red）。熒光抗體的選擇熒光抗體的選擇 根據(jù)流式細(xì)胞儀選擇抗體 根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理選擇抗體不同熒光素強(qiáng)度有所不同高表達(dá)的抗原可不用太“亮”的熒光染料，“亮”的熒光染料分配給表達(dá)低的抗原 選擇熒光波譜見(jiàn)光譜重疊小的染料進(jìn)行組合，同時(shí)正確的調(diào)節(jié)補(bǔ)償(細(xì)胞攜帶兩種以上熒光素激發(fā)出不同波長(zhǎng)熒光時(shí)，理

6、論上可選擇濾光片使每種熒光僅被相應(yīng)的通道檢測(cè)。由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，因而少量的熒光信號(hào)會(huì)被另一通道檢測(cè)到，這種現(xiàn)象就是光譜重疊.)對(duì)照的設(shè)置對(duì)照的設(shè)置 空白對(duì)照空白對(duì)照設(shè)置空白對(duì)照（未染色的細(xì)胞），用以區(qū)分細(xì)胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽(yáng)性的結(jié)果。 流式結(jié)果中熒光強(qiáng)弱是一個(gè)相對(duì)值，光電倍增管電壓越信號(hào)越強(qiáng)。通過(guò)調(diào)節(jié)電壓，使陰性對(duì)照管的熒光強(qiáng)度處于陰性的位置，實(shí)驗(yàn)組的熒光值都是相對(duì)對(duì)照組。同型對(duì)照同型對(duì)照 非特異性染色 抗體的Fc段可以與細(xì)胞表面的Fc受體非特異性結(jié)合； 抗體進(jìn)入胞內(nèi)，不容易洗脫，造成非特異性染色。 實(shí)驗(yàn)抗體：FITC-CD3單克隆抗體為鼠IgG1亞型抗

7、體; 同型對(duì)照：相同劑量未免疫小鼠血清純化的IgG1，并標(biāo)記FITC。單標(biāo)對(duì)照單標(biāo)對(duì)照兩色或多色實(shí)驗(yàn)時(shí)須設(shè)置單標(biāo)對(duì)照，用于補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)兩色或多色實(shí)驗(yàn)時(shí)須設(shè)置單標(biāo)對(duì)照，用于補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)( (以以PE/FITCPE/FITC為例為例) )；單標(biāo)實(shí)驗(yàn)時(shí)不需要。單標(biāo)實(shí)驗(yàn)時(shí)不需要。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2 - %FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1 - %FL2補(bǔ)償前補(bǔ)償前補(bǔ)償后補(bǔ)償后FITC單標(biāo)單標(biāo)PE 單標(biāo)單標(biāo)流式數(shù)據(jù)顯示流式數(shù)據(jù)顯示: 單參數(shù)直方圖 ( Histogram ) 雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示 - 散點(diǎn)圖(Do

8、t Plot) -等高線圖(Contour Plot) -密度圖（Density Plot） 三維圖 (3D Plot)直方圖 ( Histogram ):橫坐標(biāo)是散射光或熒光相對(duì)強(qiáng)弱，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)散點(diǎn)圖：每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，橫縱軸各代表一個(gè)參數(shù)等高線圖 ：同一條線上的細(xì)胞數(shù)目相等，越靠里的曲線說(shuō)明細(xì)胞數(shù)目越多密度圖：點(diǎn)密度越大的地方，細(xì)胞數(shù)越多三維圖FSC/SSC/ FL熒光抗體選擇原則對(duì)照設(shè)置（熒光補(bǔ)償）流式數(shù)據(jù)顯示小結(jié)小結(jié)流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用-細(xì)胞周期細(xì)胞周期細(xì)胞周期：細(xì)胞周期：細(xì)胞從一次分裂完成到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為間期和分裂期兩個(gè)階段周期檢測(cè)的原理周期

9、檢測(cè)的原理周期檢測(cè)步驟u0.25%胰酶（無(wú)EDTA）消化，將細(xì)胞消化成單個(gè)。u離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次。 u打孔：加入1ml預(yù)冷（-20度）70%乙醇到細(xì)胞沉淀中，于4度固定過(guò)夜（或?qū)嶒?yàn)周期長(zhǎng)可以-20長(zhǎng)期固定）。u離心收集細(xì)胞，以1mL的PBS洗細(xì)胞兩次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙錠（PI），100ug/mL RNase A， 4避光孵育30分鐘，上機(jī)檢測(cè)。樣本來(lái)源樣本來(lái)源培養(yǎng)的細(xì)胞、血液、骨髓、體液、組織等的單細(xì)胞都可用于DNA分析；標(biāo)本數(shù)應(yīng)大于106注意注意獲得單個(gè)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞，盡量避免DNA降解；樣本關(guān)鍵減少碎片減少碎片（無(wú)EDTA/不可過(guò)度吹打/離

10、心）；PI 既能和DNA結(jié)合，又能跟RNA結(jié)合，所以要用RNase降解脫氧核糖核酸酶會(huì)降解DNA,故耗材試劑要干凈滅菌 。流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用-細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡概念細(xì)胞凋亡概念 為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。是機(jī)體主動(dòng)主動(dòng)、高度有序有序清除無(wú)用細(xì)胞的過(guò)程。是生物體中一種普遍存在的現(xiàn)象。區(qū)別于細(xì)胞壞死（外力引起的細(xì)胞無(wú)序變化的死亡過(guò)程）細(xì)胞凋亡多事件發(fā)生 早期：AnnexinV（PS外翻） 早中期：JC-1( 線粒體膜電位) 中晚期：caspase-3、8、9（western） 晚期： TUNEL （ DNA 片段）不同時(shí)期凋亡檢測(cè)指標(biāo)不同時(shí)期凋亡檢測(cè)指標(biāo)早

11、期凋亡特征： 磷脂膜（PS）外翻，但是細(xì)胞膜保持完整性，因此 PI染色為陰性 DNA沒(méi)有發(fā)生斷裂AnnexinVAnnexinV（磷脂結(jié)合蛋白）（磷脂結(jié)合蛋白）對(duì)照設(shè)置：對(duì)照設(shè)置：空白對(duì)照：不加AnnexinV/PI,用以調(diào)節(jié)電壓，陰陽(yáng)性細(xì)胞界限單陽(yáng)對(duì)照：誘導(dǎo)凋亡，AnnexinV/ PI單染，用來(lái)補(bǔ)償雙染陰性對(duì)照：未誘導(dǎo)的 AnnexinV+PI雙染。用它確定兩熒光通道電壓，排除非特異性結(jié)合注意：注意：細(xì)胞制備或存儲(chǔ)時(shí)細(xì)胞膜損傷，造成假陽(yáng)性貼壁細(xì)胞消化時(shí)避免使用EDTA，螯合鈣離子當(dāng)樣本表達(dá)GFP時(shí)，禁用AnnexinV-FITC 推薦使用AnnexinV-APC/7-AAD染色JC-1(B

12、IC2)JC-1(BIC2)檢測(cè)線粒體膜電位變化檢測(cè)線粒體膜電位變化原理：JC-1有單體跟多聚體兩種形式。濃度高時(shí)，JC-1呈多聚體，可以產(chǎn)生紅色熒光；在濃度較低時(shí)，JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。正常細(xì)胞：膜電位正常， JC-1隨線粒體膜極性進(jìn)入線粒體，隨濃度升高而成多聚體，發(fā)紅色熒光。凋亡細(xì)胞：線粒體膜去極化， JC-1從線粒體釋放，濃度降低，轉(zhuǎn)為單體，發(fā)綠色熒光。通過(guò)檢測(cè)紅綠兩種熒光區(qū)分。Caspase-3Caspase-3檢測(cè)檢測(cè) -細(xì)胞凋亡過(guò)程中，胞內(nèi)主要蛋白通常被降解，調(diào)節(jié)這一過(guò)程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶)。 Caspase 3是參與DNA維護(hù)和調(diào)控細(xì)胞

13、的重要組分，即 Caspase 3激活=細(xì)胞凋亡TUNELTUNEL檢測(cè)檢測(cè)凋亡晚期特征 DNA內(nèi)切酶活性激活升高，雙鏈DNA切斷形成185bp的有序片段。Tunel流式法:基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素 (FITC) 標(biāo)記的dUTP (fluorescein-dUTP) ，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。一步法一步法FITC-dUTP染色凋亡細(xì)胞流式細(xì)胞儀488nm激發(fā)，PI發(fā)出623nm熒光，F(xiàn)ITC發(fā)出520nm熒光兩步法兩步法PI染總DNA(周期)FITC-dUTP染色凋亡細(xì)胞（如不需要周期信息，可不做PI染色）TUNELTUNEL檢測(cè)檢測(cè)TUNELTUNEL檢測(cè)檢測(cè) 小結(jié)：細(xì)胞凋亡小結(jié)：細(xì)胞凋亡-流式分析流式分析活細(xì)胞細(xì)胞凋亡流式分析固定細(xì)胞膜不對(duì)稱(chēng)性改變AnnexinV線粒體膜電位變化Mitoscreen(JC-1)TUNEL/DNA片段化流式的其他應(yīng)用流式的其他應(yīng)用黏附因子黏附因子表面受體表面受體細(xì)胞因子細(xì)胞因子分泌到胞外分泌到胞外的細(xì)胞因子的