山羊痘病毒羊傳染性膿瘡病毒的檢測(cè)

1、ICS11.220B41DB45廣西壯族自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB 45/T XXXXX2011山羊痘病毒、羊傳染性膿瘡病毒的檢測(cè)山羊痘病毒、羊傳染性膿瘡病毒的檢測(cè)二重聚合酶鏈反應(yīng)法Detection of goatpox virus and Orf virus by duplex PCR點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)（本稿完成日期：2010年12月7日）2011 - XX - XX發(fā)布2011 - XX - XX實(shí)施廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布12 / 16文檔可自由編輯打印目次前言II1范圍12術(shù)語(yǔ)和定義13試驗(yàn)材料23.1用于GTPV和ORFV鑒別檢測(cè)的特異性引物23.2試劑23.3

2、儀器設(shè)備及耗材34操作方法34.1待檢樣品的準(zhǔn)備34.2待檢樣品總DNA抽提44.3PCR擴(kuò)增45PCR檢測(cè)結(jié)果判斷45.1電泳45.2結(jié)果判定5附錄A（資料性附錄）試劑盒6附錄B（規(guī)范性附錄）溶液的配制7附錄C（資料性附錄）溴化乙錠溶液的凈化處理注意事項(xiàng)10附錄D（規(guī)范性附錄）溴化乙錠溶液的凈化處理11附錄E（規(guī)范性附錄）1瓊脂糖凝膠的制備12附錄F（規(guī)范性附錄）檢測(cè)結(jié)果凝膠電泳圖示13前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：鄭敏、施開(kāi)創(chuàng)、胡杰、劉棋、李軍、陳義祥、陸

3、文俊、莫?jiǎng)偬m、梁媛、屈素潔。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。標(biāo)準(zhǔn)名稱1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了應(yīng)用二重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)山羊痘病毒和羊傳染性膿瘡病毒的材料準(zhǔn)備、操作方法及結(jié)果判定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于山羊痘和羊傳染性膿瘡的快速鑒別診斷，可對(duì)病羊臨床組織樣品及病毒細(xì)胞分離培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)。2 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。2.1山羊痘 goat pox是由山羊痘病毒（Goatpox virus, GTPV）引起山羊的一種高度接觸性傳染病，以發(fā)熱、全身痘瘡、結(jié)節(jié)和死亡為特征。由于該病可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失、阻礙國(guó)際貿(mào)易，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為需報(bào)告的傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其列為一類動(dòng)物疫病。山羊痘病毒（G

4、TPV）是痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒屬（Capripoxvirus）成員，是一種有囊膜的DNA病毒。2.2羊傳染性膿瘡 contagious ecthyma俗稱羊口瘡，是由羊傳染性膿瘡病毒（Orf virus, ORFV）引起的一種高度接觸性傳染病，侵害綿羊、山羊和野生反芻獸，表現(xiàn)為口唇等處皮膚和粘膜形成丘疹、膿瘡、潰瘍和結(jié)成疣狀厚痂，主要通過(guò)圈舍、用具或皮膚擦傷傳播，呈群發(fā)性。該病呈全世界廣泛流行，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其列為三類動(dòng)物疫病。羊傳染性膿瘡病毒（ORFV）是痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒屬（Parapoxvirus）成員，是一種有囊膜的DNA病毒。2.3聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

5、應(yīng) polymerase chain reaction , PCR PCR 技術(shù)是一種在體外快速擴(kuò)增特定 DNA 片段的方法。由熱變性復(fù)性延伸三步反應(yīng)組成一個(gè) PCR 循環(huán)，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，使目的 DNA 得以大量擴(kuò)增。2.4二重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) duplex polymerase chain reaction是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種新型DNA擴(kuò)增技術(shù)，在同一反應(yīng)體系中同時(shí)加入兩對(duì)引物擴(kuò)增兩條目的基因。采用這一技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)兩種病原微生物。2.5引物 primer與待擴(kuò)增 DNA 片段兩端互補(bǔ)的一段寡核苷酸。2.6特異性引物 specific primer針對(duì)特定模板 DNA

6、片段設(shè)計(jì)的一段互補(bǔ)寡核苷酸，在 PCR 反應(yīng)中與模板 DNA 特異性結(jié)合。3 試驗(yàn)材料3.1 用于GTPV和ORFV鑒別檢測(cè)的特異性引物根據(jù)GTPV和ORFV的基因組特性和差異，在GTPV的A29L基因保守序列設(shè)計(jì)合成了1對(duì)寡核苷酸引物GTPV1/GTPV2，在ORFV的H3L基因保守序列設(shè)計(jì)合成了1對(duì)寡核苷酸引物ORFV1/ORFV2，擴(kuò)增片段大小分別為413 bp和708 bp，兩對(duì)引物的使用濃度均為25 mmol/L。3.2 試劑3.2.1 抽提試劑DNA 抽提試劑如下： DNA抽提試劑：平衡酚：氯仿：異戊醇按體積分?jǐn)?shù)分別為25:24:1比例混合； 10SDS； 20 mg/mL蛋白酶K

7、； 異丙醇； 75乙醇。注： 商品信息見(jiàn)附錄A。3.2.2 PCR試劑PCR 試劑如下： Taq DNA聚合酶； dNTPs混合物：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP； MgCl2； PCR緩沖液。注： 商品信息見(jiàn)附錄A。3.2.3 電泳試劑電泳試劑如下： 1瓊脂糖； 10 mg/mL溴化乙錠； 凝膠加樣緩沖液； 1倍Tris-硼酸電泳緩沖液。注： 試劑的配制見(jiàn)附錄B。3.2.4 其他試劑其他試劑如下： 滅菌雙蒸水； 滅菌PBS，pH7.2； TE緩沖液。注： 試劑的配制見(jiàn)附錄B。3.3 儀器設(shè)備及耗材3.3.1 儀器設(shè)備本方法使用下列儀器設(shè)備： 生物安全柜； PCR儀； 電泳儀； 紫

8、外投射儀或凝膠成像系統(tǒng)； 小型臺(tái)式高速離心機(jī)； 水浴鍋； 漩渦振蕩器； 乳缽或玻璃研磨器； 微量加樣器：200 µL1 000 µL、40 µL200 µL、5 µL40 µL、0.5 µL10 µL等多種規(guī)格。3.3.2 一次性耗材本方法使用下列一次性耗材： 離心管：1.5 mL和0.5 mL； PCR反應(yīng)管； 吸頭：200 µL1 000 µL、40 µL200 µL、5 µL40 µL、0.5 µL10 µL等多種規(guī)格。4 操作方

9、法4.1 待檢樣品的準(zhǔn)備根據(jù)具體情況，選擇以下一種或多種方法。4.1.1 臨床組織病料的采集及預(yù)處理無(wú)菌采取1 g待檢羊的皮膚、淋巴結(jié)、脾、肝及肺，置于乳缽或玻璃研磨器中，加入少量滅菌石英砂和5 mL滅菌的PBS充分研磨，使其成為勻漿，收集組織懸液，反復(fù)凍融3次。以3 000×g離心5 min，收集上清液。上清液供總DNA抽提，或者-20 保存?zhèn)溆谩?.1.2 病毒分離培養(yǎng)物的收獲及處理收獲疑感染GTPV或者ORFV的單層細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次。以1 000×g離心5 min，收集上清液，供總DNA抽提，或者-20 保存?zhèn)溆谩?.2 待檢樣品總DNA抽提在已預(yù)處理的650

10、 µL待檢樣品中加入65 µL的10 SDS和10 µL的20 mg/mL蛋白酶K，振蕩混合，37 水浴1 h。加入等體積的DNA抽提試劑，振蕩混合，室溫作用5 min。于4 10 000×g離心10 min。收集上清液，加入等體積的冷異丙醇，顛倒混合均勻，室溫作用20 min或者-20 作用過(guò)夜。4 12 000×g離心10 min，倒去上清液，重新加入1.5 mL75的冷乙醇。10 000×g離心10 min，倒去乙醇，將離心管倒置于在干凈的吸水紙上15 min，風(fēng)干粘附于管底的總DNA沉淀物。最后加10 µL TE緩沖

11、液至總DNA沉淀中，55 水浴15 min，取3 µL5 µL總DNA樣品進(jìn)行PCR或者-20 保存?zhèn)溆谩?.3 PCR擴(kuò)增4.3.1 PCR操作在冰浴條件下，在PCR反應(yīng)管中按下列試劑用量分別加入各成份： 25 mmol/L MgCl2: 50 µL，終濃度為2.5 mmol/L； 10倍PCR緩沖液：50 µL，終濃度為1倍； 2.5 mmol/L dNTPs：20 µL，終濃度為0.1 mmol/L； 5 U/L Taq DNA聚合酶：0.5 µL，終濃度為0.05 U/µL； GTPV上游引物（GTPV1）：0.5

12、µL，終濃度為0.5 pmol/µL； GTPV下游引物（GTPV2）：0.5 µL，終濃度為0.5 pmol/µL； ORFV上游引物（ORFV1）：0.5 µL，終濃度為0.5 pmol/µL； ORFV下游引物（ORFV2）：0.5 µL，終濃度為0.5 pmol/µL； DNA模板：3 µL； 滅菌雙蒸水：補(bǔ)足至總體積為50 µL。4.3.2 PCR反應(yīng)程序加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，按下面反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 5 min；然后進(jìn)入94 1 min，55

13、 1 min，72 1 min的循環(huán)，共進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；然后進(jìn)入94 1 min，53 1 min，72 1 min的循環(huán)，共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)；72 10 min；4 結(jié)束擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物保存于4 以備電泳。4.3.3 PCR陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照4.3.3.1 陰性對(duì)照用3 µL從健康山羊組織抽提的DNA為模板作陰性對(duì)照。4.3.3.2 陽(yáng)性對(duì)照用GTPV AV41株和ORFV GO-BT株細(xì)胞培養(yǎng)物的混合物的DNA 3 µL為模板作陽(yáng)性對(duì)照。注： 注意事項(xiàng)見(jiàn)附錄C。5 PCR檢測(cè)結(jié)果判斷5.1 電泳注： 廢棄的溴化乙錠或者含溴化乙錠的電泳液、凝膠等要集中回收處理，處理方法見(jiàn)附

14、錄D。5.1.1 瓊脂糖凝膠制備制備方法見(jiàn)附錄E。5.1.2 加樣將10 µL PCR產(chǎn)物與2 µL 6倍加樣緩沖液混合均勻，加至瓊脂糖凝膠樣品孔中。同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量對(duì)照。5.1.3 電泳條件以5 v/cm穩(wěn)壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)瓊脂糖凝膠長(zhǎng)度的2/33/4時(shí)停止。5.2 結(jié)果判定將電泳后的瓊脂糖凝膠置于紫外檢測(cè)儀上觀察，與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量、陰性對(duì)照及GTPV、ORFV陽(yáng)性對(duì)照比較，分析結(jié)果。用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。試驗(yàn)成立條件：陰性對(duì)照無(wú)任何DNA擴(kuò)增帶或者在413 bp或者708 bp位置上未出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，而GTPV陽(yáng)性對(duì)照在413 bp位置出現(xiàn)DNA

15、擴(kuò)增帶，并且ORFV陽(yáng)性對(duì)照在708 bp位置上出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶。若被檢樣品在413 bp位置出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為GTPV陽(yáng)性，記為GTPV（+）；若被檢樣品在413 bp位置未出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為GTPV陰性，記為GTPV（-）；若被檢樣品在708 bp位置出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為ORFV陽(yáng)性，記為ORFV（+）；若被檢樣品在708 bp位置未出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為ORFV陰性，記為ORFV（-）。注： 檢測(cè)結(jié)果凝膠電泳圖見(jiàn)附錄F。AA附錄A （資料性附錄）試劑盒A.1 病毒DNA提取試劑盒試劑盒包含了提取病毒基因組DNA所必需的各種酶、抽提試劑、洗滌緩沖液和乙醇等試劑，可從商業(yè)生

16、物試劑公司購(gòu)買。使用時(shí)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求使用。A.2 PCR試劑盒試劑盒包含了PCR擴(kuò)增所必需的各種酶、dNTPs、MgCl2和PCR緩沖液等試劑，可從商業(yè)生物試劑公司購(gòu)買。使用時(shí)按照本規(guī)范的要求使用。BB附錄B （規(guī)范性附錄）溶液的配制B.1 PBS（pH7.2）的制備PBS（pH7.2）按下列配方進(jìn)行配制： 氯化鈉： 8.0 g； 氯化鉀： 0.2 g； 磷酸氫二鈉： 1.44 g； 磷酸二氫鉀： 0.24 g； 雙蒸水： 定容至 1 000 mL；在800 mL雙蒸水中溶解上述各種成份，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至7.2，加雙蒸水定容至1 000mL，1.034×1

17、05 Pa高壓滅菌25 min。室溫保存。B.2 20 mg/mL蛋白酶K的制備20 mg/mL蛋白酶K按下列配方進(jìn)行配制： 蛋白酶K： 100 mg； 滅菌雙蒸水：定容至 5 mL；稱取100 mg蛋白酶K，溶于4 mL滅菌雙蒸水，充分溶解后，加滅菌雙蒸水定容至5 mL，用0.22m微孔濾膜過(guò)濾除菌，-20保存?zhèn)溆?。B.3 75乙醇的配制75乙醇按下列配方進(jìn)行配制： 無(wú)水乙醇： 750 mL； 滅菌雙蒸水：定容至 1 000 mL；在750 mL無(wú)水乙醇中加入滅菌雙蒸水定容至1 000 mL，-20保存?zhèn)溆?。B.4 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)的配制0.5 mol/L EDT

18、A(pH 8.0) 按下列配方進(jìn)行配制： 二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2·2H2O)： 186.1 g； 氫氧化鈉： 20.0 g； 雙蒸水： 定容至 1 000 mL；在800 mL雙蒸水中加入186.1 g EDTA-Na2·2H2O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，調(diào)節(jié)溶液pH值至 8.0，然后定容至1 000 mL，分裝后1.034×105Pa高壓滅菌30 min。室溫保存。B.5 1 mol/L Tris·CL （pH8.0）的配制1 mol/L Tris·CL （pH8.0）按下列配方進(jìn)行配制： Tris: 121.1 g； 濃HC

19、L: 42 mL； 雙蒸水： 定容至 1 000 mL；在800 mL水中溶解121.1 g Tris，加熱至68助溶，待溶液冷卻至室溫后用濃HCl調(diào)節(jié)pH至8.0，加雙蒸水定容至1 000 mL，分裝后1.034×105Pa高壓滅菌30 min。室溫保存。B.6 TE緩沖液（pH8.0）TE緩沖液（pH8.0）按下列配方進(jìn)行配制: 10 mmol/L mol/L Tris·CL （pH8.0）； 1 mmol/L EDTA（pH8.0）；在980 mL雙蒸水中加入10 mL pH8.0的1 mol/L Tris·CL(配制方法見(jiàn)附錄B.6)和2 mL pH8.0

20、的0.5mol/L EDTA（配制方法見(jiàn)附錄B.5），混合均勻，加雙蒸水定容至1 000 mL，分裝后1.034×105Pa高壓滅菌30 min。室溫保存。B.7 10SDS的配制10SDS的配制按下列配方進(jìn)行： 十二烷基硫酸鈉（SDS）： 100.0 g； 雙蒸水： 定容至 1 000 mL；在900 mL雙蒸水中溶解100.0g電泳級(jí)SDS，加熱至68助溶，用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加雙蒸水定容至1 000 mL，分裝備用。室溫保存。B.8 凝膠加樣緩沖液的配制凝膠加樣緩沖液按下列配方進(jìn)行配制： 蔗糖： 40.0 g； 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)：20

21、mL； 10SDS： 5 mL； 溴酚藍(lán)： 50.0 mg； 雙蒸水： 定容至 100 mL；先將蔗糖完全溶解于雙蒸水，然后按順序加入其余各成份，待所有成份溶解混合均勻后，加雙蒸水定容至100 mL，用0.22 m的微孔濾膜過(guò)濾除菌，4保存。B.9 10 mg/mL溴化乙錠的配制10 mg/mL溴化乙錠按下列方法進(jìn)行配制： 溴化乙錠(EB)： 1.0 g； 雙蒸水： 100 mL；在90 mL雙蒸水中加入1.0 g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，加雙蒸水定容至100 mL，然后用鋁箔包裹容器或移至棕色瓶中，保存于室溫。注： 溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑并帶有毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)應(yīng)戴上

22、手套，稱量時(shí)要戴面罩。廢棄溴化乙錠或含溴化乙錠的電泳液、凝膠等要集中回收處理，處理方法見(jiàn)附錄D。也可使用其他商業(yè)化的非致癌性染料。B.10 Tris-硼酸電泳緩沖液的配制B.10.1 5倍Tris-硼酸電泳緩沖液的配制5倍Tris-硼酸電泳緩沖液按下列配方進(jìn)行配制： Tris： 54.0 g； 硼酸： 27.5 g； 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)：20 mL； 雙蒸水： 定容至 1 000 mLB.10.2 1倍Tris-硼酸電泳緩沖液的配制1倍Tris-硼酸電泳緩沖液按下列配方進(jìn)行配制： 5倍Tris-電泳硼酸緩沖液：100 mL； 雙蒸水： 400 mL注： *所用試劑應(yīng)為

23、分析純（AR）或優(yōu)質(zhì)純（GR）。附錄C （資料性附錄）溴化乙錠溶液的凈化處理注意事項(xiàng)C.1 操作環(huán)境由于山羊痘病毒為二級(jí)動(dòng)物病原微生物，對(duì)其檢測(cè)應(yīng)當(dāng)在符合要求的生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，且必須嚴(yán)格遵循有關(guān)生物安全操作標(biāo)準(zhǔn)。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，并使用一次性手套。C.2 玻璃器皿的準(zhǔn)備玻璃器皿常規(guī)洗凈后，用滅菌雙蒸水漂洗幾次。1.034×105 Pa 高壓滅菌30 min后，再用50 烘烤4 h以上或 100 干烤15 min。C.3 一次性耗材的準(zhǔn)備離心管、PCR反應(yīng)管、加樣吸頭應(yīng)使用一次性塑料制品，使用前經(jīng)1.034×105 Pa高壓滅菌30 min。C.4 疑似山羊痘感染材料的處理 檢測(cè)過(guò)程中的器皿和廢棄物，應(yīng)收集后經(jīng)1.034×105 Pa高壓滅菌30 min。附錄D （規(guī)范性附錄）溴化乙錠溶液的凈化處理D.1 濃度大于0.5 mg/mL的溴化乙