石蠟切片步驟

1、石蠟切片-paraffin section 制備蘇木精-伊紅對染法實驗原理：石蠟切片是最基本的切片技術(shù)，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。蘇木素與伊紅對比染色法（簡稱h.e.對染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構(gòu)造，而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色可長期保存。經(jīng)過he染色，細胞核被蘇木素染成藍紫色，細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。實驗用品：（一） 器材切片機，切片刀，溫臺，恒溫箱，解剖刀，鑷子，剪刀，解剖針，單面刀片，小臺木，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，燒杯，水盆，熔蠟爐，蠟杯。（二） 試劑卡諾（car

2、noy）固定液，埃利希蘇木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸乙醇液，各級酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。試劑配法：1、卡諾氏固定液：100%酒精3份冰醋酸 1份或：100%酒精6份氯仿 3份冰醋酸 1份2、埃利希蘇木精染液的配法：蘇木精 1g純酒精 50ml冰醋酸 5 ml甘油 50 ml鉀礬（硫酸鋁鉀）約5g（飽和量）蒸餾水 50 ml配法：、將蘇木精溶于約15 ml的純酒精中，再加冰醋酸后攪拌。、當蘇木精溶解后即將甘油倒入并搖動容器，同時加入其余的酒精。、將鉀礬在研缽中研碎并加熱，然后將它溶解于水中。、將溫熱的鉀礬溶液一滴

3、一滴地加入上述染液中，并隨時攪動。、此液混合完畢，將瓶口用一層紗布包著小塊棉花塞起來，放在暗處通風的地方，并經(jīng)常搖動以促進它的成熟。成熟時間約34周。若加入0.2g碘酸鈉，可立刻成熟。此液穩(wěn)定而染色均勻，染核效果良好，不會發(fā)生沉淀，長期貯備無妨。此液可分別與伊紅等進行二重染色。3、1%伊紅酒精溶液：伊紅1g溶于100 ml95%酒精溶液。4、1%鹽酸乙醇液鹽酸 1份70%酒精 100份5、甘油蛋白貼片劑：蛋白 50 ml甘油 50 ml水楊酸鈉（防腐劑） 1g配制時將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調(diào)打成雪花狀泡沫，然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經(jīng)數(shù)小時或一夜，即可濾出透明蛋

4、白液。此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。最后加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用。可保存幾個月。（三） 材料鼠肝實驗程序：1、取材頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或小腸）。切取的組織塊不宜太大，以便固定劑穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小塊23mm厚。取材的注意事項：（1）取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。（2）切片材料應根據(jù)需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。2、固定將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入卡諾固定液

5、中固定，固定3050min。固定的注意事項：（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的2030倍，有些水分多的材料，中間應更換12次新液。 （4）材料固定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標簽，并隨同材料在溶液中投入相應的標簽，以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽上的文字，應用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。1、 洗滌材料經(jīng)固定后，除乙醇外，組織中的固定

6、液必須沖洗干凈，尤其是含有重金屬的固定液。因為殘留在組織中的固定液，有的不利于染色，有的產(chǎn)生沉淀或結(jié)晶影響觀察。沖洗方法根據(jù)固定液的性質(zhì)而定，固定液為水溶液的常用水洗滌，固定液含有乙醇的則用50%70%乙醇沖洗。2、 脫水30%、50%、70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水各40min，放入95%、100%各兩次，每次20min。各種材料經(jīng)固定與洗滌后，組織中含有大量水分，由于水與石蠟不能互溶，所以必須將組織中的水分除去。脫水注意事項（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。（2）在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)

7、剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。（3）在低濃度或純酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。（5）如需過夜，應停留在70%酒精中。（6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象5、透明純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明為止），須換一次二甲苯。由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。透明注意事項（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免

8、空氣中的水分進入。（2）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。（3）在透明過程中， 如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應退回純酒精中重新脫水，然后再透明。6、透蠟放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟、石蠟透蠟各2030分鐘。透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織的透蠟時間較長，約需12d。透蠟應在恒溫箱內(nèi)進行，并保持箱內(nèi)溫度在5560左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。置于恒溫箱0.5h。透蠟注意事項（1）盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；（2）透

9、蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；（3）操作要迅速，力求在最短的時間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。1、 包埋將經(jīng)過透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入容器內(nèi)，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蠟塊。用于包埋的石蠟的熔點在5060之間，包埋時應根據(jù)組織材料、切片厚度、氣候條件等因素，選擇不同熔點的石蠟。一般動物材料常用的石蠟熔點為5256，植物材料用的石蠟熔點為5458。包埋的操作過程包埋時，將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯3，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列

10、整齊。輕輕將紙盒兩側(cè)的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋塊迅速凝固。待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。2、 切片將已固定和修好的石蠟塊臺木裝在切片機的夾物臺上。將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為410微米。一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以4050r/min。切成的蠟帶到2030cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成

11、帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。切片工作結(jié)束后，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。3、 貼片、取一片清潔的載玻片，滴一滴粘片劑于玻片中央，然后用洗凈的手指加以涂抹，便成均勻薄層。、滴12滴的蒸餾水已涂粘片劑的載玻片上。、用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在水面上，注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標簽。、把玻片擺好片位置，在酒精燈火焰上方適度加熱至蠟片舒展?；蚍胖弥糜陬A先加熱的展片臺上（溫度保持在4045）。

12、此時蠟片因受熱而伸展攤平。并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標簽。、展片后把載玻片放在平盤上編好記號置于37溫箱烘干，一晝夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。10、脫蠟復水石蠟切片經(jīng)二甲苯、脫蠟各510min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各級酒精溶液中各35min，再放入蒸餾水中3min。染色液多數(shù)為水溶液，因此，染色前必須將蠟脫去，使切片中的材料由有機相進入到水相。一般采用二甲苯脫蠟，逐級復水與脫水浸蠟過程正好相反，但是，由于蠟片較薄，所需時間比脫水浸蠟要短的多。11、染色切片放入蘇木精中染色約1030min。染色時間應根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長

13、。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。12、水洗用自來水流水沖洗約15min。沖洗過程中使切片顏色發(fā)藍（或放入堿性水中也可，但用促藍劑對伊紅可能拒染，如果時間來得及，應以流水沖洗使切片顯示藍色為宜），但要注意流水不能過大，以防切片脫落，并隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍為止。13、分化就是將細胞質(zhì)著的色褪去，使細胞核著色更加鮮明，也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液（鹽酸1份+70%乙醇100份）中褪色，見切片變紅，顏色較淺即可，約數(shù)秒至數(shù)十秒鐘。這一步驟是h.e.染色成敗的關(guān)鍵，如分化不當會導致染色不勻，或深或淺，得到的切片染色效果差。如果染色適中，

14、可取消此步驟。14、漂洗切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。低倍鏡檢查見細胞核呈藍色、結(jié)構(gòu)清楚；細胞質(zhì)或結(jié)締組織纖維成分無色為標準。然后放入蒸餾水中漂洗一次。15、脫水切片入50%乙醇70%乙醇80%乙醇中各35min。16、復染用0.5%伊紅乙醇液對比染色25min。伊紅主要染細胞質(zhì)，著色濃淡應與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質(zhì)也應濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質(zhì)也應淡染?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。17、脫水：放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中35min。最后用吸水紙吸干多余

15、的乙醇。18、透明切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中約5min，然后放入純二甲苯、中各35min。二甲苯應盡量保持無水，應經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。19、封藏：中性樹膠封存切片經(jīng)染色、脫水、透明后，即可用封藏劑將其封藏起來，目的是永久保存切片，便于鏡檢。常用的封藏劑一類為干性封藏劑如中性樹膠、加拿大樹膠等，另一類為濕性封藏劑如甘油明膠等。如果切片是經(jīng)二甲苯透明，則用樹膠作為封藏劑，樹膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠度。如果切片是直接從水中或水溶液中取出，則常用甘油明膠作為封藏劑，可用于短期保存標本。封藏的方法：封片前應根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透