色譜法的分類及其原理

1、色譜法的分類及其原理(一) 按兩相狀態(tài)氣相色譜法：1、氣固色譜法 2、氣液色譜法液相色譜法：1、液固色譜法 2、液液色譜法(二) 按固定相的幾何形式1、柱色譜法(column chromatography) :柱色譜法是將固定 相裝在一金屬或玻璃柱中或是將固定相附著在毛細(xì)管內(nèi)壁上做成 色譜柱，試樣從柱頭到柱尾沿一個(gè)方向移動(dòng)而進(jìn)行分離的色譜法2、紙色譜法(paper chromatography ):紙色譜法是利用濾 紙作固定液的載體，把試樣點(diǎn)在濾紙上，然后用溶劑展開(kāi)，各組分在濾紙的不同位置以斑點(diǎn)形式顯現(xiàn)，根據(jù)濾紙上斑點(diǎn)位置及大 小進(jìn)行定性和定量分析。3、薄層色譜法(thin-layer chr

2、omatography, TLC):薄層色譜法是將適當(dāng)粒度的吸附劑作為固定相涂布在平板上形成薄層，然后用與紙色譜法類似的方法操作以達(dá)到分離目的。(三) 按分離原理按色譜法分離所依據(jù)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)的不同，又可將 其分為：1、吸附色譜法：禾U用吸附劑表面對(duì)不同組分物理吸附性能的差別 而使之分離的色譜法稱為吸附色譜法。適于分離不同種類的化合 物（例如，分離醇類與芳香烴）。2、分配色譜法：利用固定液對(duì)不同組分分配性能的差別而使之分 離的色譜法稱為分配色譜法。3、離子交換色譜法：利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái) 測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法，利用被分離組 分與固定相之間發(fā)生離子

3、交換的能力差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。離子交換 色譜主要是用來(lái)分離離子或可離解的化合物。它不僅廣泛地應(yīng)用 于無(wú)機(jī)離子的分離，而且廣泛地應(yīng)用于有機(jī)和生物物質(zhì)，如氨基 酸、核酸、蛋白質(zhì)等的分離。4、尺寸排阻色譜法：是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法, 體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出 來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗 出色譜柱。這樣，樣品分子基本按其分子大小先后排阻，從柱中 流出。被廣泛應(yīng)用于大分子分級(jí)，即用來(lái)分析大分子物質(zhì)相對(duì)分 子質(zhì)量的分布。5、親和色譜法：相互間具有高度特異親和性的二種物質(zhì)之一作為 固定相，利用與固定相不同程度的親和性，使成分與雜質(zhì)分離

4、的 色譜法。例如利用酶與基質(zhì)（或抑制劑）、抗原與抗體，激素與 受體、外源凝集素與多糖類及核酸的堿基對(duì)等之間的專一的相互 作用，使相互作用物質(zhì)之一方與不溶性擔(dān)體形成共價(jià)結(jié)合化合物， 用來(lái)作為層析用固定相，將另一方從復(fù)雜的混合物中選擇可逆地 截獲，達(dá)到純化的目的?？捎糜诜蛛x活體高分子物質(zhì)、過(guò)濾性病 毒及細(xì)胞?；蛴糜趯?duì)特異的相互作用進(jìn)行研究。（四）按原理色譜過(guò)程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動(dòng)相之間分 配平衡的過(guò)程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會(huì)不同，這使其隨 流動(dòng)相運(yùn)動(dòng)速度各不相同，隨著流動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)，混合物中的不同 組分在固定相上相互分離。根據(jù)物質(zhì)的分離機(jī)制，又可以分為吸 附色譜、分配色譜、離子

5、交換色譜、凝膠色譜、親和色譜等類別。1、吸附色譜：吸附色譜利用固定相吸附中心對(duì)物質(zhì)分子吸附能力 的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物的分離，吸附色譜的色譜過(guò)程是流動(dòng)相分子 與物質(zhì)分子競(jìng)爭(zhēng)固定相吸附中心的過(guò)程吸附色譜的分配系數(shù)表達(dá)式如下：K_a =fracX_aX_mXm其中Xa表示被吸附于固定相活性中心的組分分子含量， 表示游離于流動(dòng)相中的組分分子含量。分配系數(shù)對(duì)于計(jì)算待分離 物質(zhì)組分的保留時(shí)間有很重要的意義。2、分配色譜：分配色譜利用固定相與流動(dòng)相之間對(duì)待分離組分 溶解度的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。分配色譜的固定相一般為液相的溶劑, 依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者擔(dān)體表面。分配 色譜過(guò)程本質(zhì)上是組分分子在固

6、定想和流動(dòng)相之間不斷達(dá)到溶解 平衡的過(guò)程。分配色譜的狹義分配系數(shù)表達(dá)式如下：K=frac=fracX_s/V_sX_m/V_m式中Cs代表組分分子在固定相液體中的溶解度，Cm代表組分分子在流動(dòng)相中的溶解度。3、 離子交換色譜：離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間 發(fā)生離子交換的能力差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。離子交換色譜的固定相一 般為離子交換樹脂，樹脂分子結(jié)構(gòu)中存在許多可以電離的活性中 心，待分離組分中的離子會(huì)與這些活性中心發(fā)生離子交換，形成 離子交換平衡，從而在流動(dòng)相與固定相之間形成分配。固定相的 固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭(zhēng)奪固定相中的離子交 換中心，并隨著流動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)而運(yùn)動(dòng)，最終實(shí)現(xiàn)分

7、離。離子交換色譜的分配系數(shù)又叫做選擇系數(shù)，其表達(dá)式為：K_s=fracRXA+XA+其中RX + 表示與離子交換樹脂活性中心結(jié)合的離子濃度，X + 表示游離于流動(dòng)相中的離子濃度。4、凝膠色譜：凝膠色譜的原理比較特殊，類似于分子篩。待分 離組分在進(jìn)入凝膠色譜后，會(huì)依據(jù)分子量的不同，進(jìn)入或者不進(jìn) 入固定相凝膠的孔隙中，不能進(jìn)入凝膠孔隙的分子會(huì)很快隨流動(dòng) 相洗脫，而能夠進(jìn)入凝膠孔隙的分子則需要更長(zhǎng)時(shí)間的沖洗才能 夠流出固定相，從而實(shí)現(xiàn)了根據(jù)分子量差異對(duì)各組分的分離。調(diào) 整固定相使用的凝膠的交聯(lián)度可以調(diào)整凝膠孔隙的大??；改變流 動(dòng)相的溶劑組成會(huì)改變固定相凝膠的溶漲狀態(tài)，進(jìn)而改變孔隙的 大小，獲得不同的

8、分離效果。5、吸附色譜：吸附色譜利用固定相吸附中西對(duì)物質(zhì)分子吸附能力 的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物的分離，吸附色譜的色譜過(guò)程是流動(dòng)相分子 與物質(zhì)分子競(jìng)爭(zhēng)固定相吸附中心的過(guò)程。（五）按操作方式吸附薄層色譜法是指根據(jù)各成分對(duì)同一吸附劑吸附能力不 同，使在移動(dòng)相（溶劑）流過(guò)固定相（吸附劑）的過(guò)程中，連續(xù) 的產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達(dá)到各成分的互 相分離的目的。色譜法常見(jiàn)的方法有：柱色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高 效液相色譜法等。1、柱色譜：柱色譜法是最原始的色譜方法，這種方法將固定相 注入下端塞有棉花或?yàn)V紙的玻璃管中，將被樣品飽和的固定相粉 末攤鋪在玻璃管頂端，以流動(dòng)相洗脫。常見(jiàn)的洗脫方式

9、有兩種， 一種是自上而下依靠溶劑本身的重力洗脫，一種是自下而上依靠 毛細(xì)作用洗脫。收集分離后的純凈組分也有兩種不同的方法，一 種方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一種方法是烘干固定相 后用機(jī)械方法分開(kāi)各個(gè)色帶，以合適的溶劑浸泡固定相提取組分 分子。柱色譜法被廣泛應(yīng)用于混合物的分離，包括對(duì)有機(jī)合成產(chǎn) 物、天然提取物以及生物大分子的分離。2、薄層色譜：薄層色譜法是應(yīng)用非常廣泛的色譜方法，這種色 譜方法將固定相圖布在金屬或玻璃薄板上形成薄層，用毛細(xì)管、 鋼筆或者其他工具將樣品點(diǎn)染于薄板一端，之后將點(diǎn)樣端浸入流 動(dòng)相中，依靠毛細(xì)作用令流動(dòng)相溶劑沿薄板上行展開(kāi)樣品。薄層 色譜法成本低廉操作簡(jiǎn)單，被用于對(duì)

10、樣品的粗測(cè)、對(duì)有機(jī)合成反 應(yīng)進(jìn)程的檢測(cè)等用途。3、氣相色譜：GC主要是利用物質(zhì)的沸點(diǎn)、極性及吸附性質(zhì)的差 異來(lái)實(shí)現(xiàn)混合物的分離，其過(guò)程如圖氣相分析流程圖所示。待分析樣品在汽化室汽化后被惰性氣體（即載氣，也叫流動(dòng) 相）帶入色譜柱，柱內(nèi)含有液體或固體流動(dòng)相，由于樣品中各組 分的沸點(diǎn)、極性或吸附性能不同，每種組分都傾向于在流動(dòng)相和 固定相之間形成分配或吸附平衡。但由于載氣是流動(dòng)的，這種平 衡實(shí)際上很難建立起來(lái)。也正是由于載氣的流動(dòng)，使樣品組分在 運(yùn)動(dòng)中進(jìn)行反復(fù)多次的分配或吸附 /解吸附，結(jié)果是在載氣中濃度 大的組分先流出色譜柱， 而在固定相中分配濃度大的組分后流出。 當(dāng)組分流出色譜柱后，立即進(jìn)入檢測(cè)

11、器。檢測(cè)器能夠?qū)悠方M分 的與否轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，而電信號(hào)的大小與被測(cè)組分的量或濃度成 正比。當(dāng)將這些信號(hào)放大并記錄下來(lái)時(shí)，就是氣相色譜圖了。氣 相色譜被廣泛應(yīng)用于小分子量復(fù)雜組分物質(zhì)的定量分析。4、高效液相色譜 ：高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引 用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓 力可達(dá)4.9 107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而 成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬(wàn)或幾十 萬(wàn)）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。 高效液相色譜 （HPLC是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，高效液 相色譜系統(tǒng)由流動(dòng)相儲(chǔ)液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè) 器和記