第六章 基因工程抗體

1、醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所王嘉寧Emil von Behring, 1901, antitoxinsGeoreges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibodySusumu Tonegama,1987, structure of Ig geneGerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibodyPaul Ehrlich , 1908, production of antibodyNobel Prize winners免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能5OrthocloneR

2、eoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinMylotargCampath-1HZevalin移植排斥移植排斥心絞痛心絞痛B B細胞非霍奇金淋巴瘤細胞非霍奇金淋巴瘤移植排斥移植排斥移植排斥移植排斥嬰兒呼吸道合胞病毒嬰兒呼吸道合胞病毒類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎乳腺癌乳腺癌急性復(fù)發(fā)性髓性白血病急性復(fù)發(fā)性髓性白血病難治性慢性淋巴細胞白血病難治性慢性淋巴細胞白血病難治性難治性B B細胞非霍奇金淋巴瘤細胞非霍奇金淋巴瘤19861994199719971998199819981998200020012002一一 抗體抗體分子結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)complim

3、entarity determining region, CDRCDRhypervarible region (HVR)(HVR)( (complimentarity determining region, CDRCDR) :formation of the Ag binding sitepurple : HV CDR ( in both the ribbon and ball and stick views) green : antigen HV sequences contact the antigen.antibodyantigenantigen-antibody complex: ep

4、itopethe antibody molecular surface, with the PorA antigen superimposed. Closeup of a hydrogen bond The Tyr 101 of the antibody forms a hydrogen bond with the Gln 121 of the antigen13在Ig分子多肽鏈中，型、型輕鏈和Ig的重鏈分別寫作Ig、Ig和IgH，基因依次寫作IGK、IGL和IGH，其分別位于第2、22和14號染色體上。 14CV區(qū)編碼基因: VH (可變區(qū)) - 48 DH (多樣性區(qū)) - 23 JH (

5、連接區(qū)) - 6C區(qū)編碼基因: CH (恒定區(qū)): C, C, C等10個片段15V區(qū)編碼基因: - V, J - 40, 5 - V, J - 30, 4C區(qū)編碼基因: C (1); C(4)二、細胞工程抗體和基因工程抗體二、細胞工程抗體和基因工程抗體第一代：多克隆抗血清第一代：多克隆抗血清第二代：細胞工程抗體第二代：細胞工程抗體第三代：基因工程抗體第三代：基因工程抗體抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段1890年年Behring和北里柴三郎等人發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，和北里柴三郎等人發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，并建立了血清療法，開抗體制藥之先河。并建立了血清療法，開抗體制藥之先河。 193

6、7年年Tiselius等人用電泳法將血清分為白蛋白、等人用電泳法將血清分為白蛋白、甲種（甲種（）球蛋白、乙種（）球蛋白、乙種（ ）球蛋白、丙種（）球蛋白、丙種（ ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。組分。 1975年年Khler and Milstein等首次利用等首次利用B淋巴細胞淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體 (monoclonal antibody, MAb)。19941994年基因工程抗體年基因工程抗體。1、多克隆抗體多克隆抗體(polyclonal antibody; PcAb)多價抗原多價抗原多個

7、多個克隆克?。ㄖ旅舻模ㄖ旅舻腂細胞）細胞）多多克隆抗體克隆抗體 （1）預(yù)防、治療感染性疾病，）預(yù)防、治療感染性疾病， 如：破傷風(fēng)抗毒素血清如：破傷風(fēng)抗毒素血清 抗抗破傷風(fēng)，破傷風(fēng)， 胎盤球蛋白胎盤球蛋白 抗病毒感染抗病毒感染等，等， 副作用：副作用： 超敏反應(yīng)。超敏反應(yīng)。 （2）臨床診斷，）臨床診斷， 如：肥達氏反應(yīng)如：肥達氏反應(yīng) - 傷寒、副傷寒，傷寒、副傷寒， 缺點：特異性差。缺點：特異性差。2、單克隆抗體（單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb） 由單一克隆由單一克隆B細胞雜交瘤產(chǎn)生的，只識別抗細胞雜交瘤產(chǎn)生的，只識別抗原分子某一特定抗原決定簇的特異性抗體。原分子

8、某一特定抗原決定簇的特異性抗體。 特點：具有高度均一性。特點：具有高度均一性。 雜交瘤細胞：雜交瘤細胞： 骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞 - 無限增殖；無限增殖； 免疫免疫B細胞細胞 - 合成、分泌特異性抗體。合成、分泌特異性抗體。 雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù) - HAT培養(yǎng)基：次黃嘌呤培養(yǎng)基：次黃嘌呤(H), 氨氨基蝶呤基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷(T)。 單抗制備的流程圖單抗制備的流程圖 （1）抗原的純化和結(jié)構(gòu)分析；）抗原的純化和結(jié)構(gòu)分析； （2）細胞發(fā)生、分化及功能的闡明；）細胞發(fā)生、分化及功能的闡明； （3）臨床疾病的診斷和治療，）臨床疾病的診斷和治療， 如：免疫分子檢測；如：免疫分子檢測

9、； 免疫導(dǎo)向藥物治療惡性腫瘤免疫導(dǎo)向藥物治療惡性腫瘤 - McAb抗癌藥物抗癌藥物(毒素或毒素或 放射核素偶聯(lián)放射核素偶聯(lián))。 多克隆抗體多克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體來源來源動物免疫血清、恢復(fù)期病人血動物免疫血清、恢復(fù)期病人血清或免疫接種人群清或免疫接種人群多為鼠源性多為鼠源性特點特點來源廣泛、制備容易來源廣泛、制備容易純度高、特異性強、效價高、少純度高、特異性強、效價高、少或無血清交叉或無血清交叉反應(yīng)反應(yīng)組成組成針對不同抗原表位的抗體的混針對不同抗原表位的抗體的混合物合物針對單一表位，結(jié)構(gòu)和組成高度針對單一表位，結(jié)構(gòu)和組成高度均一，抗原特異性及同種型一致均一，抗原特異性及同種型一致應(yīng)用應(yīng)用

10、疾病的被動免疫治療疾病的被動免疫治療疾病診斷、特異性抗原或蛋白的疾病診斷、特異性抗原或蛋白的檢測和鑒定、疾病的被動免疫治檢測和鑒定、疾病的被動免疫治療和生物導(dǎo)向藥物制備療和生物導(dǎo)向藥物制備缺點缺點特異性不高、易發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性不高、易發(fā)生交叉反應(yīng)，不易大量制備不易大量制備人體應(yīng)用后可導(dǎo)致人鼠抗體反應(yīng)人體應(yīng)用后可導(dǎo)致人鼠抗體反應(yīng)多克隆抗體與單克隆抗體的比較多克隆抗體與單克隆抗體的比較單抗體內(nèi)應(yīng)用和療效受限原因：1.鼠源性單抗對人體有較強的免疫原性2.注入人體的單抗在腫瘤部位的攝取量甚少3.生產(chǎn)成本高,難于普及應(yīng)用人雜交瘤技術(shù)未獲真正突破原因:融合率低、建株難、不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、人體不能隨意免疫

11、新思路：盡量減少抗體中的鼠源成分，但又盡量保留原有的抗體特異性?；蚬こ炭贵w：根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體，主要包括嵌嵌合抗體合抗體、人源化抗體、小分子抗體、抗體、人源化抗體、小分子抗體、抗體融合蛋白和雙特異性抗體融合蛋白和雙特異性抗體。27基基因因工工程程抗抗體體1 小分子抗體小分子抗體3 鼠單抗人源化鼠單抗人源化基因工程改造的抗體基因工程改造的抗體2 從雜交瘤細胞分離出從雜交瘤細胞分離出功能功能性可變區(qū)基因，與人性可變區(qū)基因，與人IgIg恒定區(qū)（決定恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達免疫原

12、性）基因連接，插入適當(dāng)表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，表達人載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，表達人- -鼠嵌鼠嵌合抗體。合抗體。 特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性，特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。同時保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。Pr 鼠鼠VH 人人 CH Pr 鼠鼠VL 人人 CL免疫球蛋白免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體鏈嵌合載體L 鏈嵌合載體鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細胞共轉(zhuǎn)染細胞啟動子啟動子人人- -鼠嵌合抗體基因工程改造策略鼠嵌合抗體基因工程改造策略 鼠鼠VH鼠鼠V L人人CL人人CH抗體分泌細胞抗體分泌細胞人人- -鼠嵌合基因工程抗體鼠嵌合基因工

13、程抗體決定簇互決定簇互補區(qū)補區(qū)CDR序列序列 CDR序列序列 鼠單克隆抗體鼠單克隆抗體 人抗體人抗體人源化抗體人源化抗體鼠單克隆鼠單克隆V區(qū)人源化（區(qū)人源化（CDR移植）移植） 定義：用基因工程方法，定義：用基因工程方法，將抗體將抗體VHVH和和VLVL（重鏈和輕鏈可變（重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過一個連接肽連接而成的區(qū)）通過一個連接肽連接而成的小分子抗體，小分子抗體， 功能：具有較好的抗原結(jié)合功能：具有較好的抗原結(jié)合能力，且分子量小、穿透力強、能力，且分子量小、穿透力強、免疫原性低等特性?？膳c其他效免疫原性低等特性?？膳c其他效應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的抗體分子，是構(gòu)建

14、免疫毒素和雙抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體等的理想而基本的元特異抗體等的理想而基本的元件件 。Ag123免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈表達載體鏈表達載體L鏈表達載體鏈表達載體共轉(zhuǎn)染細胞共轉(zhuǎn)染細胞Pr VH CH1 Pr VL CLFab 抗體分子的制備抗體分子的制備I Fab antibody molecule抗體分泌細胞抗體分泌細胞VHVLCL-S-S-CH1Fab 抗體分子的制備抗體分子的制備II Fv antibody molecule分別構(gòu)建載體分別構(gòu)建載體L鏈表達載體鏈表達載體H鏈表達載體鏈表達載體共轉(zhuǎn)染細胞共轉(zhuǎn)染細胞Pr VH Pr VL Fv 二硫鍵穩(wěn)定的二硫鍵穩(wěn)定的Fv (

15、disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗體的制備小分子抗體的制備(1) ds-Fv抗體分泌細胞抗體分泌細胞VHVL-S-S-Fv小分子抗體的制備小分子抗體的制備disulfide-stabilized Fv,ds-FvVH VL接頭接頭DNA (Gly4Ser)3 VH引物引物PCR VH 接頭接頭DNA酶切、克隆酶切、克隆 ScFv (single chain Fv,scFv )的構(gòu)建的構(gòu)建 變性、復(fù)性變性、復(fù)性VL引物引物(2) Sc-FvVL抗體抗原結(jié)合是經(jīng)過補體決定區(qū)（抗體抗原結(jié)合是經(jīng)過補體決定區(qū)（CDRCDR）來）來實現(xiàn)。因此，實現(xiàn)。因此，CDRCDR是構(gòu)

16、成抗原抗體結(jié)合的最小是構(gòu)成抗原抗體結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單位。根據(jù)這一特點，可以設(shè)計出那些結(jié)構(gòu)單位。根據(jù)這一特點，可以設(shè)計出那些在抗原識別及親和力方面有重要意義的在抗原識別及親和力方面有重要意義的CDRCDR多多肽，直接用于診斷或治療，可望獲得理想的肽，直接用于診斷或治療，可望獲得理想的結(jié)果。這種只含有一個結(jié)果。這種只含有一個CDRCDR多肽的抗體，稱為多肽的抗體，稱為超變區(qū)多肽，亦稱為最小識別單位超變區(qū)多肽，亦稱為最小識別單位(minimal (minimal recognition unit, MRU)recognition unit, MRU)。提高抗體提高抗體效應(yīng)功能效應(yīng)功能抗體融合蛋白抗體融

17、合蛋白雙特異性抗體雙特異性抗體偶連細胞毒物質(zhì)偶連細胞毒物質(zhì)細胞內(nèi)抗體細胞內(nèi)抗體提高抗體效應(yīng)功能提高抗體效應(yīng)功能抗原抗原A A抗原抗原B B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVLCTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原抗原A A抗原抗原B B（1）雜化雜交瘤技術(shù)：將具有某種特異性（如抗瘤細胞）的Mab細胞株與具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾細胞進行融合，即產(chǎn)生出雜化雜交瘤細胞株的二價瘤體。它們分泌的是重鏈、輕鏈被雜化的抗體分子，有10種形式： 重鏈、輕鏈都無改變，保持原特異性的配對抗體分子： LH-HL，KG-GK 重鏈特異性相

18、同的配對抗體分子： LH-HK，KH-HK KG-GL，LG-GL 重鏈、輕鏈特異性不同的配對抗體分子： LH-GK，LH-GL KH-GL，KH-GK 在這些雜化抗體分子中，只有LH-GK配對的才是所需的雙功能抗體分子。（2）化學(xué)交聯(lián)法：Nisonoff和Rivers最早從事這方面的研究?；瘜W(xué)交聯(lián)的方法無需經(jīng)過細胞融合，所以比較簡便易行。 通常利用重鏈與輕鏈這間的二硫鏈經(jīng)還原和再氧化，將兩種不同特異性抗體的半分子結(jié)合在一起?；蛴秒p功能交聯(lián)劑，如鄰苯酸酯等，把兩個抗體半分子交聯(lián)在一起。 用于制備雙功能抗體的Mab可以是完整分子，也可是經(jīng)胃酶水解獲得F（ab）2片段。后者在減少鼠源免疫原性方面，效果較好。（3）利用基因工程技術(shù)將兩套重輕鏈基因?qū)牍撬枇黾毎騻魅玖黾毎小?這種方法制備的雙功能抗體可選擇合適的穩(wěn)定區(qū)和合適的類及亞類，而得到較好的產(chǎn)量較高的雙功能抗體。由于只有較少的嵌合導(dǎo)入并整合到宿主基因組，故傳染瘤細胞更為穩(wěn)定，染色體不易丟失 免疫毒素免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicin ARicin A（-FcRI-Ricin A）Ricin A:蓖麻毒素A,對腫瘤細胞具有毒性作用偶連細胞毒物質(zhì)偶連細胞毒物質(zhì)連接放射性同位素連接放射性同位素( (131131I I、99m9