核酸檢測實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化管理PPT012

1、 ( (一一) ) 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則 1 1臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)分隔開的工作區(qū)域：臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)分隔開的工作區(qū)域： 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)； 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 （如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并）（如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并） 2 2各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。物品混用。 3 3進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格

2、按照單一方向進(jìn)行，即：進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即： 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū) 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增區(qū) 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 4 4不同工作區(qū)域使用不同的工作服不同工作區(qū)域使用不同的工作服( (例如不同的顏色例如不同的顏色) )。工作人。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。（二）工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)（二）工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn) 1 1試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 2-82-8和和-15-15冰箱；混勻器；微量加樣器冰箱；混勻器；微量加樣器( (覆蓋覆蓋1

3、-10001-1000l)l)； 移動(dòng)紫外燈移動(dòng)紫外燈( (近工作臺面近工作臺面) )；消耗品：；消耗品： 一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭( (帶濾芯帶濾芯) )； 專用工作服和工作鞋；專用辦公用品。專用工作服和工作鞋；專用辦公用品。 2 2標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū) 1-81-8冰箱、冰箱、-20-20或或-80-80冰箱；高速臺式冷凍離心機(jī)；冰箱；高速臺式冷凍離心機(jī)； 混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器( (覆蓋覆蓋1-10001-1000l)l)； 可移動(dòng)紫外燈可移動(dòng)紫外燈(

4、 (近工作臺面近工作臺面) )；超凈工作臺；消耗品；超凈工作臺；消耗品; ; 一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭( (帶濾芯帶濾芯) )； 專用工作服專用工作服和工作鞋；專用辦公用品；和工作鞋；專用辦公用品； 如需處理大分子如需處理大分子dnadna，應(yīng)備有超聲波水浴儀。，應(yīng)備有超聲波水浴儀。 3.3.擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū) 核酸擴(kuò)增儀；微量加樣器(覆蓋1-1000l) ； 可移動(dòng)紫外燈(近工作臺面)；消耗品（一次性手套、一次性吸水紙、 耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾芯)； 專用工

5、作服和工作鞋；專用辦公用品.4.4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū) 基本儀器設(shè)備如下： 微量加樣器(覆蓋1-1000l) ； 可移動(dòng)紫外燈；消耗品； 專用工作服和工作鞋；專用辦公用品。 下述操作在該區(qū)進(jìn)行：下述操作在該區(qū)進(jìn)行： 儲(chǔ)存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。儲(chǔ)存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。在本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過程中，必須戴手套并經(jīng)常更換。在本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過程中，必須戴手套并經(jīng)常更換。操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)

6、高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。 下述操作在該區(qū)進(jìn)行：下述操作在該區(qū)進(jìn)行： 標(biāo)本保存、核酸（標(biāo)本保存、核酸（rnarna、dnadna）提取、貯存及其加入至擴(kuò)）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定增反應(yīng)管和測定rnarna時(shí)時(shí)cdnacdna的合成。的合成。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，

7、必須有明確的樣本處理和滅活程序。活程序。樣本處理對核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取樣本處理對核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法。方法。下述操作在該區(qū)進(jìn)行：下述操作在該區(qū)進(jìn)行：dnadna或或rnarna擴(kuò)增。擴(kuò)增。在巢式在巢式pcrpcr測定中，通常第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢測定中，通常第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增由較高的危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。式擴(kuò)增由較高的危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。不能從本區(qū)再進(jìn)入任何不能從本區(qū)再進(jìn)入任何“上游上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。氣溶膠從本區(qū)漏出。為避

8、免氣溶膠所致的污染，盡量減少在本區(qū)的走動(dòng)。為避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在本區(qū)的走動(dòng)。下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測定。下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測定。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、本區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。丙稀酰胺、甲醛或同位素等，應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。本區(qū)如采用負(fù)壓或減壓情況下可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至

9、前本區(qū)如采用負(fù)壓或減壓情況下可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性面區(qū)域的可能性 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)所有階段，即測定分析前的標(biāo)本采集處理、測定中增檢驗(yàn)所有階段，即測定分析前的標(biāo)本采集處理、測定中的核酸提取，擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報(bào)告等。的核酸提取，擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報(bào)告等。（一）標(biāo)本的采集（一）標(biāo)本的采集（二）標(biāo)本的穩(wěn)定化處理（二）標(biāo)本的穩(wěn)定化處理 （三）標(biāo)本的運(yùn)送（三）標(biāo)本的運(yùn)送 （四）標(biāo)本的貯存（四）標(biāo)本的貯存 （五）標(biāo)本的處理（五）標(biāo)本的處理( (核酸提取核酸提取) ) （六）靶核酸的

10、逆轉(zhuǎn)錄（六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄cfit)cfit)和擴(kuò)增和擴(kuò)增 （七）污染（七）污染 （八）擴(kuò)增產(chǎn)物的分析（八）擴(kuò)增產(chǎn)物的分析 （九）質(zhì)量控制（九）質(zhì)量控制 常用于基因擴(kuò)增檢測的臨床標(biāo)本包括常用于基因擴(kuò)增檢測的臨床標(biāo)本包括edtaedta或構(gòu)櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、或構(gòu)櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、一次性密閉容器，如真空采血管。當(dāng)使用非密閉采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污分泌物和骨髓的

11、采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時(shí)必須戴一次性手套。染。采樣時(shí)必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理。玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理。臨床用于臨床用于rnarna（如（如hcv rnahcv rna）擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并）擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快（盡快（3 3小時(shí)以內(nèi)）分離血漿，以避免小時(shí)以內(nèi)）分離血漿，以避免rnarna的降解。如未作抗凝處理，的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在則抽血后，必須在1 1小時(shí)內(nèi)分離血清。小時(shí)內(nèi)分離血清。用于用于dnadna擴(kuò)增檢測的標(biāo)本，應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。擴(kuò)增檢測的標(biāo)本，應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。用 于用 于

12、r n ar n a 測 定 的 標(biāo) 本 應(yīng) 進(jìn) 行 穩(wěn) 定 化 處 理 ， 異 硫 氰 酸 胍 鹽測 定 的 標(biāo) 本 應(yīng) 進(jìn) 行 穩(wěn) 定 化 處 理 ， 異 硫 氰 酸 胍 鹽(guanidine thiocyanate(guanidine thiocyanate，citc)citc)可使可使dnadna酶和酶和rnarna酶立即失活，酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1 1：4 4的比例加的比例加至含有至含有5mol5moll gitcl gitc的試管中，從而使血清的試管中，從而使血清( (漿漿) )中的中的rnarna酶

13、不可酶不可逆失活。逆失活。q標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本采集后必須盡快送至實(shí)驗(yàn)室。q經(jīng)過穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下郵寄運(yùn)送。經(jīng)過穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下郵寄運(yùn)送。q用于用于rnarna檢測的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，須速凍后，檢測的標(biāo)本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。放在干冰中運(yùn)送。 臨床體液標(biāo)本如血清血漿等可于臨床體液標(biāo)本如血清血漿等可于-70-70下長時(shí)間貯存。下長時(shí)間貯存。用于用于dnadna測定的已純化核酸樣本可在測定的已純化核酸樣本可在10 mmol10 mmoll trisl tris1mmol1mmoll edtal edta緩沖液緩沖液(ph7.5(ph

14、7.58.0)8.0)中中44保存。保存。用于用于rnarna測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中-80-80或液氮或液氮中貯存。中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20-20即可。即可。用用gitcgitc處理的處理的rnarna標(biāo)本在室溫可保存標(biāo)本在室溫可保存7 7天。天。 標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測成敗的關(guān)鍵性步標(biāo)本處理即核酸提取純化是決定擴(kuò)增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標(biāo)本中的核酸模板前，應(yīng)對其進(jìn)行充分評價(jià)以驗(yàn)證其提取的有效性。前，應(yīng)對其進(jìn)行充分評價(jià)

15、以驗(yàn)證其提取的有效性。當(dāng)靶核酸為當(dāng)靶核酸為rnarna時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄pcrpcr測定失敗的常見原因是標(biāo)本測定失敗的常見原因是標(biāo)本在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的在運(yùn)送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的rnarna酶的酶的污染。故建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。污染。故建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。 1 1靶靶rnarna的逆轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄 下述因素通常影響下述因素通常影響cdnacdna合成的效率：合成的效率：(1)(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯(cuò)全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解

16、變質(zhì)或加樣錯(cuò)誤等；誤等；(2)(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或taqtaq酶的抑制物酶的抑制物( (如酚、如酚、氯仿、血紅素等氯仿、血紅素等) )；(3)rna(3)rna酶的存在導(dǎo)致酶的存在導(dǎo)致rnarna的降解。的降解。2 2核酸的擴(kuò)增核酸的擴(kuò)增 有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測的假陽性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測的假陽性或假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、靶核酸中抑制劑存在、taqtaq酶失活、退火溫度不對、酶失活、退火溫度不對、mgmg2+2+濃度不佳、患濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須者標(biāo)本

17、或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以定期對擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。避免假陰性結(jié)果。 在實(shí)際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴(kuò)增片段的污染（產(chǎn)在實(shí)際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴(kuò)增片段的污染（產(chǎn)物污染）、天然基因組物污染）、天然基因組dnadna的污染、試劑污染（儲(chǔ)存液或工作液）以的污染、試劑污染（儲(chǔ)存液或工作液）以及標(biāo)本間交叉污染（如氣溶膠從一個(gè)陽性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)及標(biāo)本間交叉污染（如氣溶膠從一個(gè)陽性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本）。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中污染的最主

18、要來源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污本）。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中污染的最主要來源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。染。 1 1測定分析前的污染源測定分析前的污染源 2 2測定分析階段的污染源測定分析階段的污染源 3 3污染的避免污染的避免 工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的即是為了預(yù)防污染。為避免以工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的即是為了預(yù)防污染。為避免以 前測定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴(kuò)增前測定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴(kuò)增 反應(yīng)中用反應(yīng)中用dutpdutp取代部分取代部分dttpdttp，持續(xù)的長波紫外燈照射，不能用其來，持續(xù)的長波紫外燈照射，不能用其來 替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，尤其是這些方

19、法不能防止外來非擴(kuò)替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴(kuò) 增的天然增的天然dnadna的污染。的污染。 4 4去除污染的措施去除污染的措施 : : 次氯酸鈉、紫外線照射、高壓消毒次氯酸鈉、紫外線照射、高壓消毒擴(kuò)增產(chǎn)物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、擴(kuò)增產(chǎn)物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床pcrpcr檢驗(yàn)項(xiàng)目基本檢驗(yàn)項(xiàng)目基本上都使用探針雜交方法。上都使用探針雜交方法。 雜交檢測時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序盒雜交條件。雜交檢測時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序盒雜交條件。必須對必須對dnadna和和rnarna分析的