紫外分光光度法和熒光分析法

1、一、紫外一、紫外可見光分光光度法可見光分光光度法光譜分析法光譜分析法二、熒光分析法二、熒光分析法 基本原理基本原理儀器主要部件儀器主要部件主要應用主要應用基本原理概述：紫外概述：紫外-可見分光光度法是通過被測物可見分光光度法是通過被測物質在紫外質在紫外-可見光區(qū)的特定波長或一定波長可見光區(qū)的特定波長或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法。主要用于藥品的鑒別、定量分析的方法。主要用于藥品的鑒別、檢查和含量測定。檢查和含量測定。范圍：范圍： 可見光區(qū)（可見光區(qū)（400760nm） 紫外光區(qū)（紫外光區(qū)（200400nm）Beer-Lambor

2、t 定律A=log=Ecl1T*A為吸收度；*T為透光率；*E為吸收系數（以以 表示，溶液濃度為表示，溶液濃度為1%（g/ml），厚度為），厚度為1cm時的吸光度值時的吸光度值）*c為溶液濃度；*l為樣品總厚度。Ecm%11適用條件：入射光為單色光入射光為單色光溶液是稀溶液溶液是稀溶液固體、固體、 液體和氣體樣品在同一波長液體和氣體樣品在同一波長下，各組分吸光度具有加和性下，各組分吸光度具有加和性儀器主要部件儀器主要部件單色器單色器光源光源檢測器檢測器吸收池吸收池信號顯信號顯示系統(tǒng)示系統(tǒng)儀器分類單光束紫外可見分光光度計準雙光束紫外可見分光光度計雙光束紫外可見分光光度計雙波長紫外可見分光光度計主

3、要應用 利用藥物與雜質對光的選擇性吸收性質的差異，若藥物在雜質的最大吸收波長處沒有吸收，則可在此波長處測樣品溶液的吸收度，通過控制樣品溶液吸收度來控制雜質的量。例：地蒽酚中二羥基蒽醌的檢查 二羥基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm處有最大吸收，而 地蒽酚在該處幾乎無吸收。1、藥物的雜質檢查2、藥物的含量測定 如巴比妥類藥物的含量測定（巴比妥類藥物在堿性介質中電離為具有紫外吸收特征的結構）、芳酸及其脂類藥物含量測定、維生素A含量測定（在325328nm的波長范圍內有最大吸收）等。三點校正法 本方法是在三個波長處測得吸光度，根據校正公式計算吸光度校正值后，再計算含量。其原理主要基于以下兩點： 雜質的

4、無關吸收再310340nm的波長范圍內幾乎呈一條直線，且隨波長的增大吸光度下降。 物質對光吸收呈加和性的原理，即在某一樣品的吸收曲線上，各波長的吸光度是維生素A與雜質吸光度的代數和，因而吸收曲線也是二者吸收的疊加。3、藥物的鑒別 對比吸收光譜特征數據對比吸收光譜特征數據 對比吸收度（或吸收系數）的比值對比吸收度（或吸收系數）的比值 對比吸收光譜的一致性對比吸收光譜的一致性 例苯磺舒：用含鹽酸的乙醇取鹽酸溶液（9-1000）2ml，加乙醇制成100ml制成沒1ml中含20ug的溶液，在225nm與249nm的波長處有最大吸收，在249nm波長處的吸收度為0.67 。甾體激素類藥物：丙酸倍氯米松的

5、乙醇溶液（20ug/ml），在239nm的波長處應有最大吸收，吸光度為0.570.60;在239nm與263nm波長處的吸光度比值應為2.252.451.判別物質的異構體，如互變異構體，順反異構體，開鏈和成環(huán)異構體，旋光異構體，空間異構體等。反式異構體空間位阻小，共軛程度較完全。最大吸收峰波長，最大摩爾吸收系數，大于順式。2.推測物質的共軛體系和部分骨架一般需與色譜，紅外，質譜，波譜等多種儀器聯合作物質的結構分析。4.結構分析紫外分光光度測定方法普通測定分光光度法普通測定分光光度法 1.單組分的測定單組分的測定 通常采用 A-C 標準曲線法定量測定。2.多組分的同時測定多組分的同時測定 若各組

6、分的吸收曲線互不重疊，則可在各自最大吸收波長處分別進行測定。這本質上與單組分測定沒有區(qū)別。 若各組分的吸收曲線互有重疊，則可根據吸光度的加合性求解聯立方程組得出各組分的含量。A1= a1bca b1bcb A2= a2bca b2bcb 差示分光光度法差示分光光度法普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當待測組分含量較高時，將產生較大的誤差。需采用示差法。 即提高入射光強度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標準溶液作參比溶液。設：待測溶液濃度為cx，標準溶液濃度為cs(cs cx)。則： Ax= b cx As = b cs x s =b(cx cs ）=bc 測得的吸光度相當于普通法中待測溶液

7、與標準溶液的吸光度之差。示差法測得的吸光度與c呈直線關系。由標準曲線上查得相應的c值，則待測溶液濃度cx ： cx = cs + c 雙波長分光光度法不需空白溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色光(1和2)；以參比波長1處的吸光度A1作為參比，來消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復雜試樣時顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單波長法有所提高。 A 2 A 1 （2 1 ) b c 兩波長處測得的吸光度差值與待測組分濃度成正比（例子：課本366頁）導數分光光度法導數分光光度法在多組分同時測定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強光譜的精細結構以及復雜光譜的辨析等方面，顯示了

8、很大的優(yōu)越性。 利用吸光度利用吸光度(或透光度或透光度)對波長的導數曲線來進行分對波長的導數曲線來進行分析：析： 0 e-bc假定入射光強度0 在整個波長范圍內保持恒定： dI 0 /d0則：dI/d0 bc e -bc d/d 0 bc d/d（例子：課本（例子：課本233頁）頁）其他卡爾曼濾波法 偏最小二乘法 小波變換三波長分光光度法 系數倍率法與紫外與紫外-可見法異同點可見法異同點應用應用 原理原理原理 熒光熒光分子吸收電磁波后，從其最低激發(fā)分子吸收電磁波后，從其最低激發(fā)態(tài)重新發(fā)射紫外線或可見光的現象態(tài)重新發(fā)射紫外線或可見光的現象 利用某些物質被一定波長的光照射后所產利用某些物質被一定波

9、長的光照射后所產生的，能夠反映該物質特性的熒光來進行生的，能夠反映該物質特性的熒光來進行定性定量的分析方法定性定量的分析方法熒光分析法。熒光分析法。在溶液中，當熒光物質的濃度較低時,其熒光強度與該物質的濃度通常有良好的正比關系,即IF=KC 光照光照 分子基態(tài)分子基態(tài) 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài) 輻射躍遷輻射躍遷 熒光熒光 若光源是：若光源是： 由熒光波長可確定物質分子由熒光波長可確定物質分子 可見可見-紫外光源紫外光源 分子熒光分析法分子熒光分析法 具有結構具有結構 由熒光強度可測物質的含量由熒光強度可測物質的含量 原子特征光譜作光源原子特征光譜作光源 原子熒光分析原子熒光分析 X射線作光源射線作光源 X

10、射線熒光分析射線熒光分析構件構件光源光源 ： 為高壓汞蒸氣燈或為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈氙弧燈，后者能發(fā)射出強度較大的連續(xù)，后者能發(fā)射出強度較大的連續(xù)光譜，且在光譜，且在300nm400nm 范圍內強度幾乎相等，故較常用范圍內強度幾乎相等，故較常用 。激發(fā)單色器激發(fā)單色器 ： 置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。 發(fā)射單色器：發(fā)射單色器：置于樣品室和檢測器之間的為發(fā)射單色器或第二置于樣品室和檢測器之間的為發(fā)射單色器或第二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜單色器，常采用光柵為單色器。

11、篩選出特定的發(fā)射光譜 樣品室：樣品室： 通常由石英池通常由石英池(液體樣品用液體樣品用)或固體樣品架或固體樣品架(粉末或片狀樣粉末或片狀樣品品)組成。組成。 檢測器：檢測器： 一般用光電管或光電倍增管作檢測器?？蓪⒐庑盘柗糯笠话阌霉怆姽芑蚬怆姳对龉茏鳈z測器?？蓪⒐庑盘柗糯蟛⑥D為電信號。并轉為電信號。 熒光分析法與紫外熒光分析法與紫外-可見分析法異同點可見分析法異同點 熒光分析法與紫外熒光分析法與紫外-可見比較：可見比較： 均屬于分子光譜均屬于分子光譜 儀器構造儀器構造 基本相似基本相似 熒光熒光 可見可見-紫外紫外 本質本質 發(fā)射光譜發(fā)射光譜 吸收光譜吸收光譜 靈敏度靈敏度 10-10-10-

12、12 g/ml 10-4-10-7g/ml 選擇性選擇性 高高 一般一般應用應用硫色素熒光法測定維生素硫色素熒光法測定維生素B1 維生素維生素B1 在堿性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素，在紫（在堿性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素，在紫（365nm）照射下呈藍色熒光（照射下呈藍色熒光（435nm）通過與對照品熒光強度比較。即可測得供試品）通過與對照品熒光強度比較。即可測得供試品含量（課本含量（課本260頁）頁）熒光分光光度法測定維生素熒光分光光度法測定維生素E 采用同步熒光掃描法測定血清中維生素采用同步熒光掃描法測定血清中維生素E，有效的消除溶劑拉曼，有效的消除溶劑拉曼光譜的干擾，提高靈敏度和準確性。（課本光譜的干擾，提高靈敏度和準確性。（課本277頁）頁）時間分辨熒光光譜時間分辨熒光光譜 基于不同發(fā)光體發(fā)光衰減速度不同.壽命不同.在進行這種測量時要求帶有時間延遲設備的脈沖光源和帶有門控時間電路的檢測器件,從而可在固定延遲時間td和門控時間tg,用發(fā)射單色器進行掃描.可得到時間分辨發(fā)射光譜。同步掃描 根據激發(fā)光和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系參考文獻參考文獻劉文英，藥物分析劉文英，藥物分析.袁觀宇，生物物理學袁觀宇，生物物理學.李昌厚，紫外分光光度計李昌厚，紫外分光