分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

1、課題課題2 2土壤中分解尿素的細菌的土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)分離與計數(shù)一、課題背景一、課題背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一種重要的是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥農(nóng)業(yè)氮肥。尿素尿素不不能直接能直接被農(nóng)作物被農(nóng)作物吸收吸收。土壤中的細菌將土壤中的細菌將尿素尿素分解成氨分解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2 2、細菌利用尿素的原因、細菌利用尿素的原因: :它們它們能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )脲酶脲酶+ CO+ CO2 2NHNH3 3+ H+ H2 2O O課題目的課題目的從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌統(tǒng)計每克土壤樣

2、品中究竟含有多少這樣統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣 的細菌的細菌4二二. .研究思路研究思路. .篩選菌株篩選菌株. .統(tǒng)計菌落數(shù)目統(tǒng)計菌落數(shù)目. .設(shè)置對照設(shè)置對照 1 1、實例：、實例：啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因為熱泉溫度原因：因為熱泉溫度707080800 0C C，淘汰了，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有絕大多數(shù)微生物只有TaqTaq細菌被篩選出來。細菌被篩選出來。DNADNA多聚酶鏈?zhǔn)椒炊嗑勖告準(zhǔn)椒磻?yīng)。應(yīng)。. .篩選菌株篩選菌株2 2、實驗室中微生物的篩選原理：、實驗室中

3、微生物的篩選原理：人為提供人為提供有利于目的菌株生長有利于目的菌株生長的條件的條件( (包括營養(yǎng)、溫度、包括營養(yǎng)、溫度、pHpH等等) )，同時，同時抑制抑制或阻止其他微生物或阻止其他微生物生長。生長。什么是選擇性培養(yǎng)基？什么是選擇性培養(yǎng)基？15.0g15.0g瓊脂瓊脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的細菌的分離與、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：計數(shù)所需培養(yǎng)基：從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類

4、？從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的氮源為尿素氮源為尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4 4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理、培養(yǎng)

5、基選擇分解尿素的微生物的原理5 5、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？實驗組實驗組: :對照組對照組: :培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中的的氮源氮源只只加加尿素尿素牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)基接種接種接種接種只生長尿只生長尿素細菌素細菌生長多種生長多種微生物微生物1 1、顯微鏡直接計數(shù)：、顯微鏡直接計數(shù)：利用利用血球計數(shù)板血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。. .統(tǒng)計菌落數(shù)目：統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；需要相對

6、高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點缺點2.2.間接計數(shù)法（間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法活菌計數(shù)法）原理：原理：常用方法：常用方法： 在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。稀釋涂布平板法。稀釋涂布平板法。(3)(3)計算：計算：每克樣品中的菌落數(shù)每克樣品中的菌落數(shù)(C(CV)V)MM其中，其中，C C代表代表 ? ?，V V代表代表?,M?,M代表代表? ?。13注意事項注意事項為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在在3030030300的平板上進行計數(shù)

7、。的平板上進行計數(shù)。為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到加到三個或三個以上三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)平均數(shù)。統(tǒng)計的菌落往往比活菌的統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。實際數(shù)目低。 設(shè)置對照的主要目的是排除實驗設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。提高實驗結(jié)果的可信度。. .設(shè)置對照：設(shè)置對照：16實例：在做分解尿素的細菌的篩選與實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A A同學(xué)從對應(yīng)同學(xué)從對應(yīng)的的

8、10106 6倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約稀釋度下只選擇出大約5050個菌落。分個菌落。分析其原因。析其原因。原因：土樣不同，原因：土樣不同， 培養(yǎng)基污染或操作失誤培養(yǎng)基污染或操作失誤 ( (或者是混入了其他的含氮物質(zhì)或者是混入了其他的含氮物質(zhì)) )方案一：方案一：由其他同學(xué)用與由其他同學(xué)用與A A同學(xué)同學(xué)相同土樣進行實驗相同土樣進行實驗 結(jié)果預(yù)測：結(jié)果預(yù)測： 如果結(jié)果與如果結(jié)果與A A同學(xué)一致，則證明同學(xué)一致，則證明A A無誤；如果結(jié)果不同，則證明無誤；如果結(jié)果不同，則證明A A同

9、同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。問題。 通過這個事例可以看出，實驗通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。必不可少的。方案二：方案二：將將A A同學(xué)配制的培養(yǎng)同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。明培養(yǎng)基是否受到污染。二二. .實驗的具體操作實驗的具體操作 . .土壤取樣土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土層土3cm3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先左右，再取樣，將樣

10、品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。準(zhǔn)備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。使用前都要滅菌。. .制備培養(yǎng)基：制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基。應(yīng)在火焰旁稱取土壤應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行步都要在火焰旁進行 三三 樣品樣品的稀釋的稀釋. .取樣涂布取樣涂布實驗時要對實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。釋度、培養(yǎng)物等。分離不同的微生物采用不同的稀釋度

11、分離不同的微生物采用不同的稀釋度稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)目的目的細菌細菌10104 4、10105 5、10106 6保證獲得菌落保證獲得菌落數(shù)在數(shù)在3030300300之間、適于計之間、適于計數(shù)的平板數(shù)的平板放線菌放線菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同. .微生物的培養(yǎng)與觀察微生物的培養(yǎng)與觀察思考：思考：要將哪些培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)？要將哪些培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)？在菌落計數(shù)時，每隔在菌落計數(shù)時，每隔24h24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，選

12、取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。數(shù)目。 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細菌：細菌：30303737培養(yǎng)培養(yǎng)1 12d2d放線菌：放線菌：25252828培養(yǎng)培養(yǎng)5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的溫度下培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)3 34d4d。25如果得到了如果得到了2 2個或個或2 2個以上個以上菌落數(shù)目菌落數(shù)目在在3030030300的平板，則說明稀釋操的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌

13、落數(shù)同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確相差較大，表明試驗不精確，需要重新，需要重新實驗。實驗。三三. .結(jié)果分析與評價結(jié)果分析與評價1.1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：選擇每個平板上長有提示：選擇每個平板上長有3030030300個個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相

14、同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。四、操作提示四、操作提示 無菌操作無菌操作 做好標(biāo)記做好標(biāo)記 規(guī)劃時間規(guī)劃時間 五五. .課外延伸課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PHPH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。分解尿素。 測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍伊

15、紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑菌落呈現(xiàn)黑色色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌呈黑色中心大腸桿菌呈黑色中心 , ,有或無金屬光澤有或無金屬光澤大腸桿菌在伊大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂紅美藍瓊脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 六、例題解析六、例題解析 例例1 1對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是A A在液體培養(yǎng)基上進行在液體培養(yǎng)基上進行 B B至少接種一種細菌至少接種一種細菌 C C接種一個細菌接種一個細菌 DD及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 解析：細菌群體解析：細

16、菌群體生長規(guī)律的測定生長規(guī)律的測定是人們在一定條件下進行的。是人們在一定條件下進行的。這些條件是：一這些條件是：一種細菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定種細菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時測定細菌總數(shù)時測定細菌總數(shù)。在這些條件下，才能測定出細菌的生長規(guī)律。在這些條件下，才能測定出細菌的生長規(guī)律。測定時只能用一種細菌的子細胞群體的變化規(guī)律表達微生物的測定時只能用一種細菌的子細胞群體的變化規(guī)律表達微生物的生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過樣品推測細菌總數(shù)。若接種多種細菌，則會發(fā)生種間才能通過樣品推測細菌總數(shù)。

17、若接種多種細菌，則會發(fā)生種間斗爭而不能測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時，要保證一斗爭而不能測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時，要保證一定的接種量。定的接種量。答案：答案：A A例例2 2在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈的時期是斗爭最顯著最激烈的時期是A A調(diào)整期調(diào)整期 B B對數(shù)期對數(shù)期 C C穩(wěn)定期穩(wěn)定期 DD衰亡期衰亡期解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應(yīng)了種內(nèi)生物解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應(yīng)了種內(nèi)生物對生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時對生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時候，

18、種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個體數(shù)目的增加，候，種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個體數(shù)目的增加，每個個體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，每個個體每個個體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，每個個體對生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就越來越激烈。對生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就越來越激烈。由此可知，在由此可知，在穩(wěn)定期穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，目已經(jīng)開始減少，pHpH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級代謝產(chǎn)已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時的微生物的生

19、存斗爭主要是與無機環(huán)物積累到很高的程度，這時的微生物的生存斗爭主要是與無機環(huán)境的斗爭。境的斗爭。答案：答案：C C1.1.對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（ ） A.A.在液體培養(yǎng)基上進行在液體培養(yǎng)基上進行 B.B.至少接種一種細菌至少接種一種細菌 C.C.接種一個細菌接種一個細菌 D.D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.A.培養(yǎng)細菌培養(yǎng)細菌 B.B.培養(yǎng)真菌培養(yǎng)真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別表

20、現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( )( ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素A AC CD D4.4.下列說法不正確的是（下列說法不正確的是（ ） A.A.科學(xué)家從科學(xué)家從70708080度熱泉中分離到耐高溫的度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.統(tǒng)計某一稀釋度的統(tǒng)計某一稀釋度的5 5個平板的菌落數(shù)依次為個平板的菌落數(shù)依次為M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C.C.設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度