質(zhì)粒的提取及濃度檢測PPT課件

1、1 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 任 課 教 師: 張淑平(62773628) 李英姿 (62781668) 助教博士生: 李穎華 (62773628) 黃 波 (62783845) 唐 穎 (62772214) 2課程基本情況簡介課程基本情況簡介/質(zhì)粒質(zhì)粒dna提取提取3基本技術(shù)基本技術(shù)核酸核酸 的分離純化的分離純化(isolation and purification of dna and rna)；電泳技術(shù)電泳技術(shù)(gel electrophoresis)；基因重組、亞克隆及表達(dá)（基因重組、亞克隆及表達(dá)（gene recombination, subcloning and expression)；pc

2、r技術(shù)技術(shù) ( polymerase chain reaction)；分子雜交及互作分子雜交及互作(molecular hybridization and interaction)；dna測序技術(shù)測序技術(shù)(dna sequencing)；基因功能的研究技術(shù)基因功能的研究技術(shù)(gene function)；基因的染色體定位（基因的染色體定位（localization of gene to chromosomes）生物芯片技術(shù)（生物芯片技術(shù)（bio-chips or bioarray).4 以完整、常用、重要為原則，經(jīng)典與先進(jìn)以完整、常用、重要為原則，經(jīng)典與先進(jìn)技術(shù)相結(jié)合，同時介紹相關(guān)知識，盡量讓

3、學(xué)生技術(shù)相結(jié)合，同時介紹相關(guān)知識，盡量讓學(xué)生在有限的學(xué)時內(nèi)掌握更多的分子生物學(xué)技術(shù)以在有限的學(xué)時內(nèi)掌握更多的分子生物學(xué)技術(shù)以及相關(guān)的知識。及相關(guān)的知識。 我們的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)計(jì)從整體我們的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)計(jì)從整體上可以說是一個完整的大實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樽允贾两K，上可以說是一個完整的大實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樽允贾两K，各實(shí)驗(yàn)之間相互連貫，要求學(xué)生每一次實(shí)驗(yàn)既各實(shí)驗(yàn)之間相互連貫，要求學(xué)生每一次實(shí)驗(yàn)既得到本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，同時也為下一次更深入得到本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，同時也為下一次更深入的實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備（提供實(shí)驗(yàn)材料）。的實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備（提供實(shí)驗(yàn)材料）。課程基本情況：課程基本情況：5次次 序序?qū)崒?shí) 驗(yàn)驗(yàn) 名名 稱稱周次周次

4、學(xué)學(xué) 時時備注備注1課程基本情況簡介課程基本情況簡介/質(zhì)粒質(zhì)粒dna提取提取36.02質(zhì)粒質(zhì)粒dna酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電泳泳45.03聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增擴(kuò)增dna56.04dna回收純化及重組體的構(gòu)建回收純化及重組體的構(gòu)建66.55大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、重組大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、重組dna的轉(zhuǎn)化及克隆篩選的轉(zhuǎn)化及克隆篩選76.56重組克隆的鑒定重組克隆的鑒定87.07植物總植物總rna的提取與電泳的提取與電泳95.08核酸轉(zhuǎn)膜、探針標(biāo)記核酸轉(zhuǎn)膜、探針標(biāo)記105.09核酸雜交核酸雜交124.510綜合測驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)討論與總結(jié)綜合測驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)討論與

5、總結(jié)134.0實(shí)驗(yàn)安排與實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)安排與實(shí)驗(yàn)報(bào)告注：實(shí)驗(yàn)報(bào)告分為注：實(shí)驗(yàn)報(bào)告分為12、3、4 (實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)6的設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)) 、45 、 6、7、89、106(6)(6)重組克隆的鑒定實(shí)驗(yàn)重組克隆的鑒定實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)說明的幾點(diǎn)說明手工提取質(zhì)粒方法手工提取質(zhì)粒方法將在將在“實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一”中講到，中講到，“實(shí)實(shí)驗(yàn)六驗(yàn)六”上課時間將提前到下午上課時間將提前到下午1:00；接種培養(yǎng)將在接種培養(yǎng)將在“重組克隆的鑒定重組克隆的鑒定”實(shí)驗(yàn)課的實(shí)驗(yàn)課的前一前一天的晚上進(jìn)行（天的晚上進(jìn)行（7:30-9:00pm? 9:00-10:20?）；助博將準(zhǔn)備好試管助博將準(zhǔn)備好試管lb培養(yǎng)基，用前別忘了加你需培養(yǎng)基，用前別忘了

6、加你需要的要的抗生素抗生素;提供的酶包括提供的酶包括ecoecori, ri, xhoxhoi, i, bambamhi, hi, hindhindiii, iii, xbaxbai i。自己選擇正確的酶使用。自己選擇正確的酶使用。 。實(shí)驗(yàn)方案由學(xué)生自己設(shè)計(jì)！要提前進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方案由學(xué)生自己設(shè)計(jì)！要提前進(jìn)行。(目的意義、材料和方法、目的意義、材料和方法、結(jié)果及討論結(jié)果及討論)以下幾點(diǎn)請注意：以下幾點(diǎn)請注意：7實(shí)驗(yàn)操作基本要求實(shí)驗(yàn)操作基本要求認(rèn)真預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；認(rèn)真預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；按照操作規(guī)程使用儀器設(shè)備按照操作規(guī)程使用儀器設(shè)備, 注意個人以及注意個人以及公共設(shè)施安全；公共設(shè)施安全；節(jié)約實(shí)驗(yàn)試劑及材料

7、；節(jié)約實(shí)驗(yàn)試劑及材料；實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)器皿清洗干凈，并清理實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)器皿清洗干凈，并清理實(shí)驗(yàn)臺面；實(shí)驗(yàn)臺面；按時、按質(zhì)、按量完成實(shí)驗(yàn)工作，不遲到，按時、按質(zhì)、按量完成實(shí)驗(yàn)工作，不遲到，不早退；不早退；實(shí)事求是、認(rèn)真而及時地寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)事求是、認(rèn)真而及時地寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。8評分考慮評分考慮平時實(shí)驗(yàn)課成績平時實(shí)驗(yàn)課成績 70%；綜合技術(shù)測驗(yàn)綜合技術(shù)測驗(yàn) 30%。9實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒質(zhì)粒dna的提取及濃度檢測的提取及濃度檢測10 目的與要求 通過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒dna的提取、測定，學(xué)習(xí)用堿變性法提取質(zhì)粒dna的方法，了解用分光光度計(jì)測定dna含量的方法。112. 相關(guān)知識及原理質(zhì)粒質(zhì)

8、粒(plasmid) (plasmid) ：獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈dnadna分子。分子。存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。121314dna超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)15細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒: 細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從群，其大小從1kb-200kb，它們復(fù)，它們復(fù)制時利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身基因組制時利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身基因組dna的同一組酶系。的同一組酶系。 16

9、 嚴(yán)謹(jǐn)型：嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝；往往在一個細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝； 松馳型：松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個細(xì)胞中含有控制之下的，每個細(xì)胞中含有10-200份拷貝，份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會使質(zhì)粒拷貝數(shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒才會使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pbr322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉

10、素處理即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。質(zhì)粒類型：質(zhì)粒類型：17載體載體(vector)(vector)：用于攜帶重組用于攜帶重組dnadna，并且能夠使外源，并且能夠使外源dnadna一起復(fù)制一起復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒與表達(dá)的質(zhì)粒( (運(yùn)載工具運(yùn)載工具) )。具備的條件：具備的條件： 易于鑒定；易于鑒定； 在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制；在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制； 易于篩選；易于篩選； 易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。18 抗性基因（抗性基因（antibiotic resistance antibiotic resistance gene,such as am

11、picillin gene,such as ampicillin resistance gene, kanamycine resistance gene, kanamycine resistance gene)resistance gene) 啟始復(fù)制子（啟始復(fù)制子（oriori, origin of , origin of replication)replication)； 多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)(msc, multiple cloning (msc, multiple cloning site or polylinker)site or polylinker)； 標(biāo)記基因標(biāo)記基因(marke

12、r gene, such as (marker gene, such as lacz gene)lacz gene)。載體的結(jié)構(gòu)：載體的結(jié)構(gòu)：19insertecorixhoi1.9kb20dna dna 是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會導(dǎo)致境會導(dǎo)致dnadna的變性，如加熱、極端的變性，如加熱、極端phph值、值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使境又可以使dnadna復(fù)性。復(fù)性。原理：原理：21sdssds是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白

13、質(zhì)變性，所以菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以sdssds處理細(xì)菌細(xì)胞后，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的處理細(xì)菌細(xì)胞后，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒破裂，從而使質(zhì)粒dnadna以及基因組以及基因組dnadna從細(xì)胞從細(xì)胞中同時釋放出來。釋放出來的中同時釋放出來。釋放出來的dnadna遇到強(qiáng)堿遇到強(qiáng)堿性（性（naohnaoh）環(huán)境，就會變性。然后，用酸性）環(huán)境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒dnadna將迅速復(fù)性，而基因組將迅速復(fù)性，而基因組dnadna，由于分子巨，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒d

14、nadna將在上清將在上清中，而基因組中，而基因組dnadna則與細(xì)胞碎片一起沉淀到則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒dnadna從細(xì)菌中提取出來。從細(xì)菌中提取出來。22細(xì)菌裂解的方法： 堿裂解法：0.2molnaoh+1%sds 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 sds裂解法：10%sds,一般用于質(zhì)粒大量提取。23測定測定dnadna濃度的方法主要有兩種，即利用分濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計(jì)法測定光光度計(jì)法測定dnadna的紫外光吸收值；第二的紫外光吸收值；第二種方法是測定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光的種方法是測定樣品中溴化乙錠發(fā)

15、射的熒光的強(qiáng)度來計(jì)算核酸的含量。另外還有一種用于強(qiáng)度來計(jì)算核酸的含量。另外還有一種用于粗略檢測粗略檢測dnadna濃度的方法是通過凝膠電泳，濃度的方法是通過凝膠電泳，與標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較。與標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較。dnadna濃度的測定：濃度的測定：24紫外光吸收法：紫外光吸收法：因?yàn)榻M成核酸的堿基因?yàn)榻M成核酸的堿基(g,a,t,c(g,a,t,c）在）在260nm260nm處處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測定具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測定260nm260nm的吸收的吸收峰即可對峰即可對dnadna進(jìn)行定量。但有時也會因?yàn)樗M(jìn)行定量。但有時也會因?yàn)樗幦芤旱奶幦芤旱膒hph值不同而導(dǎo)致吸光系數(shù)的不同。值不同而導(dǎo)

16、致吸光系數(shù)的不同。因此，一般在中性因此，一般在中性phph值左右的環(huán)境中進(jìn)行值左右的環(huán)境中進(jìn)行測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。253. 材料與試劑材料與試劑材料材料:含有質(zhì)粒含有質(zhì)粒pcmv-myc-t10的大腸桿菌的大腸桿菌dh5。pcmv-mycpcmv-myc是一種哺乳細(xì)胞表達(dá)載體，它含有一個是一種哺乳細(xì)胞表達(dá)載體，它含有一個n n端端c-c-myc myc 尾，常用于免疫反應(yīng)的檢測和蛋白純化以及作為誘尾，常用于免疫反應(yīng)的檢測和蛋白純化以及作為誘餌蛋白檢測酵母雙雜交結(jié)果。餌蛋白檢測酵母雙雜交結(jié)果。suitable host strains: d

17、h5a, hb101, and other general purpose strains.selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to e. coli hosts.e. coli replication origin: puccopy number: 500 26insertecor1xho11.9kbpcmv-myc-t10274. 步驟 質(zhì)粒dna的提取a. 堿裂解法堿裂解法28溶液溶液1get緩沖液：緩沖液： 50mmol/l葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/l edta， 25mmt

18、ris-hcl ph8.0。溶液溶液20.2mol/l naoh, 1%sds溶液溶液3乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(3m, ph=4.8)： 60ml的的5mol/l kac, 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5ml h2ote緩沖液或水（緩沖液或水（+ 20m mg/ml rnase ）: 10mmol/l，tris-hcl, 1mmol/l，edta ， ph8.0, 100%乙醇，乙醇，70乙醇乙醇29注意：注意： 用移液器操作時，每一步都要格用移液器操作時，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液外小心，特別是在加入溶液ii ii 和和iiiiii后，一定不要劇烈振蕩，以免后，一定不要劇烈振

19、蕩，以免切碎切碎dna(dna(包括質(zhì)粒包括質(zhì)粒dnadna和基因組和基因組dna)dna)！30培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)培養(yǎng)1216小時小時;取液體培養(yǎng)液取液體培養(yǎng)液1.5-3ml于于eppendorf管中，管中，10000r/min離心離心1min，去掉上清液，加入，去掉上清液，加入100m ml溶液溶液1(get) ，充分混勻放置，充分混勻放置3-5分鐘分鐘;加入加入200m ml新配制的新配制的0.2mol/l naoh+1sds（變性液），加蓋顛倒（變性液），

20、加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上次使之混勻，冰上放置放置5min;質(zhì)粒小量提取的方法（手工提?。嘿|(zhì)粒小量提取的方法（手工提?。?1加入加入150 m m l乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(溶液溶液ii)，加蓋后顛倒，加蓋后顛倒6-7次混勻，次混勻，冰上放置5min;用臺式高速離心機(jī)，用臺式高速離心機(jī)，10000r/min離心離心7min，上，上清移入另一干凈離心管，并加清移入另一干凈離心管，并加1ml 100乙醇混乙醇混勻，勻，12000r/min離心離心5min，棄去上清液，棄去上清液;沉淀用沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次，乙醇清洗一次， 12000r/min離心離心5min，棄去上清液，小管倒

21、置于吸水紙上，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥，除盡乙醇，室溫自然干燥;加入加入30-50m ml含有含有20m mg/ml rnase的滅菌蒸餾水的滅菌蒸餾水或或te 緩沖液溶解提取物，室溫放置緩沖液溶解提取物，室溫放置15-30min，使，使dna充分溶解充分溶解(有時需要酚有時需要酚:氯仿抽提氯仿抽提);將分離出的質(zhì)粒將分離出的質(zhì)粒dna置于置于-20保存?zhèn)溆谩１４鎮(zhèn)溆谩?2biodevbiodev（博大泰克）質(zhì)?？焖伲ú┐筇┛耍┵|(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校ㄌ崛≡噭┖校╬lasmid rapid plasmid rapid isolation kitisolation ki

22、t） 堿裂解法；離心柱結(jié)構(gòu)；特殊硅基質(zhì)吸附材料。堿裂解法；離心柱結(jié)構(gòu)；特殊硅基質(zhì)吸附材料。使用前按說明再溶液使用前按說明再溶液i中加入中加入rnase；向洗脫液；向洗脫液中按中按1:3的比例加入無水乙醇。的比例加入無水乙醇。33操作步驟操作步驟收集收集1.51.53ml3ml菌液沉淀于菌液沉淀于1.5ml1.5ml離心管中。離心管中。加入加入100100m ml溶液溶液1 1，振蕩至徹底懸浮。，振蕩至徹底懸浮。為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒dnadna，培養(yǎng)細(xì)菌的時，培養(yǎng)細(xì)菌的時間不宜過長，一般為間不宜過長，一般為1212小時；小時；細(xì)菌沉淀中加入溶液細(xì)菌沉淀中加入溶液1 1后，一定

23、要徹底懸浮，后，一定要徹底懸浮，否則抽提質(zhì)粒否則抽提質(zhì)粒dnadna的純度及得率會大大降低的純度及得率會大大降低加入加入150150m ml溶液溶液2 2，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。隨后將離心管隨后將離心管冰上冰上放置放置1 12 2分鐘分鐘（時間勿（時間勿超）。超）。34加入加入150150m ml溶液溶液3 3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置室溫放置5 5分鐘。分鐘。12000rpm12000rpm離心離心1212分鐘。分鐘。要獲得更好得質(zhì)粒提取效果，請于步驟要獲得更

24、好得質(zhì)粒提取效果，請于步驟2 2和步和步驟驟3 3后，冰上放置。后，冰上放置。將將420420m ml結(jié)合緩沖液結(jié)合緩沖液加入加入離心柱離心柱中。然后將中。然后將步驟步驟3 3的上清的上清加入離心加入離心吸附柱中吸附柱中（盡量去除雜質(zhì)），（盡量去除雜質(zhì)），混勻?；靹?。12000rpm12000rpm離心離心3030秒鐘。倒掉廢液收集管秒鐘。倒掉廢液收集管中得溶液。中得溶液。加入加入750750m ml洗滌緩沖液洗滌緩沖液于離心吸附柱中，于離心吸附柱中，12000rpm12000rpm離心離心1 1分鐘。分鐘。35濃縮漂洗液配置成工作濃度時，一定要使用無濃縮漂洗液配置成工作濃度時，一定要使用無水

25、乙醇，否則，吸附于硅基質(zhì)材料上的水乙醇，否則，吸附于硅基質(zhì)材料上的dnadna可能可能被洗脫下來，影響回收效率。被洗脫下來，影響回收效率。a.a.重復(fù)步驟重復(fù)步驟5 5一次；一次；b.b.隨后，再次于隨后，再次于12000rpm12000rpm空空管離心管離心2 2分鐘，盡量除去漂洗液。分鐘，盡量除去漂洗液。洗涕時（即步驟洗涕時（即步驟5和和6）一定要盡量除去漂洗液，）一定要盡量除去漂洗液，否則，漂洗液中得乙醇會抑制后續(xù)得各種酶促否則，漂洗液中得乙醇會抑制后續(xù)得各種酶促反應(yīng)。必要時，可適當(dāng)延長離心時間或者用反應(yīng)。必要時，可適當(dāng)延長離心時間或者用tip頭吸凈。頭吸凈。36如果含有較多得蛋白、鹽類

26、等雜質(zhì)，可多洗如果含有較多得蛋白、鹽類等雜質(zhì)，可多洗滌幾次。滌幾次。小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的1.5ml離心管中。加入離心管中。加入50m ml洗脫緩沖液洗脫緩沖液，室溫，室溫放置放置5分鐘后，分鐘后，12000rpm離心離心1分鐘。分鐘。洗脫緩沖液一定要加入離心吸附柱中硅基質(zhì)洗脫緩沖液一定要加入離心吸附柱中硅基質(zhì)材料得正中，以確保被吸附在硅基質(zhì)材料中材料得正中，以確保被吸附在硅基質(zhì)材料中得得dna都能被洗脫下來。為提高回收效率，都能被洗脫下來。為提高回收效率，可適當(dāng)加大洗脫液體積及洗脫次數(shù)?？蛇m當(dāng)加大洗脫液體積及洗脫次數(shù)。37 為了充分除盡為

27、了充分除盡rnarna的污染，可在提取的質(zhì)粒中的污染，可在提取的質(zhì)粒中加入加入0.50.5m ml lrnasearnasea（10mg/ml10mg/ml）。這并不影響其）。這并不影響其他后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所提取的質(zhì)粒的純度足以用來作他后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所提取的質(zhì)粒的純度足以用來作為測序模板和其他酶促反應(yīng)。為測序模板和其他酶促反應(yīng)。 若提取的質(zhì)粒大于若提取的質(zhì)粒大于10kb10kb，在加入洗脫緩沖液后，在加入洗脫緩沖液后，可在可在7070水浴中放置水浴中放置3 35 5分鐘，以確保質(zhì)粒分鐘，以確保質(zhì)粒dnadna的完全洗脫。的完全洗脫。38b. 用分光光度計(jì)法定量用分光光度計(jì)法定量dna 取取2m ml提取的質(zhì)粒提取的質(zhì)粒dna，加入，加入98m ml蒸蒸餾水對待測餾水對待測dna樣品做樣品做1:50(或更高或更高倍數(shù)的稀釋倍數(shù)的稀釋); 蒸餾水作為空白蒸餾水作為空白,在波長在波長260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)讀數(shù)處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)讀數(shù)至零。至零。39加入加入dna稀釋液，測定稀釋液，測定260nm 及及280nm的吸收值。的吸收值。260n