(完整版)巴西橡膠樹乙烯途徑中抑制因子Ein3的western印跡畢業(yè)設計.doc

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2、文）的印刷本和電子版本；學校有權保存畢業(yè)設計（論文）的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服務；學?？梢圆捎糜坝?、縮印、數(shù)字化或其它復制手段保存論文；在不以贏利為目的前提下，學?？梢怨颊撐牡牟糠只蛉績热?。作者簽名：日期：學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明： 所呈交的論文是本人在導師的指導下獨立進行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標注引用的內容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫的成果作品。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔。作者簽名：日期：年月日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解學校有關保留、使用

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4、文字數(shù)不少于1 萬字（不包括圖紙、程序清單等），文科類論文正文字數(shù)不少于1.2 萬字。3.附件包括：任務書、開題報告、外文譯文、譯文原文（復印件）。4.文字、圖表要求：1）文字通順，語言流暢，書寫字跡工整，打印字體及大小符合要求，無錯別字，不準請他人代寫2）工程設計類題目的圖紙，要求部分用尺規(guī)繪制，部分用計算機繪制，所有圖紙應符合國家技術標準規(guī)范。圖表整潔， 布局合理， 文字注釋必須使用工程字書寫，不準用徒手畫3）畢業(yè)論文須用A4 單面打印，論文50 頁以上的雙面打印4）圖表應繪制于無格子的頁面上5）軟件工程類課題應有程序清單，并提供電子文檔5.裝訂順序1）設計（論文）2）附件：按照任務書、開

5、題報告、外文譯文、譯文原文（復印件）次序裝訂摘要天然橡膠是一種非常重要的工業(yè)原料，也是經濟建設和國防建設不可缺少的稀缺資源和戰(zhàn)略物資， 可以說它是現(xiàn)代經濟的命脈 ,還是一種軍事和外交資源并且直接關系到國家的經濟和政治的穩(wěn)定。 世界上超過 90% 的天然橡膠是來自巴西橡膠樹。因此對巴西橡膠樹的研究有著極其重要的經濟價值和戰(zhàn)略作用。在巴西橡膠研究中發(fā)現(xiàn)對樹干的機械損傷會對其乙烯途徑產生影響，而乙烯的排放量對排膠量有一定的影響，因此我們探究對葉片的損傷是否和對樹干損傷一樣對其乙烯途徑產生影響。此實驗通過刮傷葉片后不同時間的處理后提取葉片蛋白，而后通過特異性乙烯抗體的免疫印跡來檢測刮傷對其乙烯途徑的影

6、響。在此過程中運用三種不同的方法測定葉片蛋白的濃度，并對其準確性進行對比分析。關鍵詞：巴西橡膠、定蛋白、乙烯途徑、免疫印跡目錄摘要Abstract1 前言1.1 巴西橡膠及中國橡膠產業(yè)介紹1.2 巴西橡膠的乙烯途徑1.3 轉錄核心調控因子EIN3/EIL11.4 本研究的目的和意義2 實驗器材及試劑配方2.1 實驗器材2.2、試劑配方3 方法步驟3.1 材料處理3.2 提蛋白3.3 定蛋白濃度：3.4 十二烷基硫酸鈉（ SDS)- 聚丙烯酰胺凝膠電泳3.5 蛋白免疫印跡3.6 顯色鑒定4 結果與分析4.1 三種方法定蛋白及比較分析1 前言1.1 巴西橡膠及中國橡膠產業(yè)介紹天然橡膠是經濟建設和國

7、防建設不可缺少的稀缺資源和戰(zhàn)略物資,它與石油、鐵礦石、有色金屬并列為四種緊缺型工業(yè)原料,在生產地域和產品的性能上具有不可替代的作用。它是現(xiàn)代經濟的命脈 ,還是一種軍事和外交資源并且直接關系到國家的經濟和政治的穩(wěn)定。天然橡膠資源的安全對于國家經濟的安全甚至國家的安全都具有非常重要的意義。目前我國天然橡膠資源供需缺口日趨擴大、進口依賴性日益增強、自給能力不斷下滑等問題的存在 ,這對于我國經濟發(fā)展和國防建設是極其危險的。保障我國的天然橡膠資源的安全 ,事關中國經濟的發(fā)展和穩(wěn)定,對世界天然橡膠的安全保障也具有非常重要的意義。1.1.1 原產地及我國的主要分布巴西橡膠的原產地在亞馬遜河盆地，雖然巴西橡膠

8、生長在整個亞馬遜河盆地，但每公頃只能發(fā)現(xiàn)與其他樹種極端混生少量的幾株。經常被認為是擴大種植才引種到其他地方的，但是，病害也是其中很重要的原因。1中國植膠區(qū)地處熱帶和南亞熱帶地區(qū), 水熱條件充沛 , 具有發(fā)展橡膠樹的一定條件 , 特別是海南、云南的西雙版納等地, 常年基本無霜 , 年均日照時數(shù)達到17 00 一 2400hr , 年均氣溫在 19.5 一 23.0 , 最冷月均溫也在 15.0 以上 ; 年降雨量 1500 一 2500mm,但干濕季節(jié)明顯 ,11 月至翌年 4月為旱季 ,5 月一 10 月為雨季 ,降雨量占全年的 60 一 90%，相對濕度在 80%以上 , 由于中國植膠區(qū)位于

9、赤道以北18 一 24 度 , 大大超過了世界植膠的熱帶地區(qū) ( 赤道以南10 度至赤道以北15 度) 的界限 , 是公認的不宜植膠地 ,主要問題是臺風和低溫兩大自然災害, 對橡膠樹的影響帶來了一系列的問題。 21.1.2 巴西橡膠的分子研究進展橡膠樹的分子生物學在各方面的研究都取得了一系列的成果，但相對于模式植物和糧食等經濟作物來說，橡膠樹的分子生物學研究起步較晚，研究難度較大，研究明顯滯后。目前，對于天然橡膠的生物合成途徑雖有一定的了解，與橡膠樹合成相關的一些基因也相繼克隆，并研究它們的一些基本功能，但所報道克隆的cDNA 大都用異源同類基因從巴西橡膠樹構建的 cDNA文庫獲取，從巴西橡膠

10、樹克隆的新基因不多，難以從整體水平上解釋膠乳再生的分子機制，此外橡膠樹死皮病發(fā)生的分子機理的相關研究也有待深入。另外，分子標記技術在橡膠育種中的應用的研究，橡膠樹的遺傳轉化體系完善的研究力度都有待進一步的加大。31.1.3 我國橡膠的產業(yè)發(fā)展我國橡膠產業(yè)發(fā)展的戰(zhàn)略定位是“鞏固”、“提升”、“穩(wěn)定”、“發(fā)展”。按照全國天然橡膠優(yōu)勢區(qū)域布局規(guī)劃，科學合理地開展植膠生產，不斷鞏固現(xiàn)有產業(yè)基礎。目前應做好做足現(xiàn)有生產技術執(zhí)行和膠園管理工作，深刻理解領會橡膠樹栽培技術規(guī)程和割膠技術規(guī)程，結合實際情況，制定更為細致可行的實施細則，力爭做到科學合理，穩(wěn)步推進我國植膠業(yè)發(fā)展提升。 41.2 巴西橡膠的乙烯途徑

11、1.2.1 乙烯的生物合成及其在植物生命活動中的作用在所有的維管植物生命活動中乙烯都是通過楊氏循環(huán)合成的，即S-腺苷甲硫氨酸被 ACC合成酶所催化形成乙烯前體1- 氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）。ACC被其氧化酶催化形成乙烯、HCN和二氧化碳。 ACC合成酶（ ACS)和 ACC氧化酶是乙烯合成的關鍵所在。5乙烯對植物的代謝調節(jié)是貫穿其整個生活周期的。首先，在種子萌發(fā)期，乙烯可以促進下胚軸膨脹變粗，使其容易破土而出；乙烯還對陸生植物莖的延伸有著抑制作用，可以使樹干變得更粗以抵抗大風的侵襲，而對半水生植物莖的生長有很強的促進作用；它還可以幫助水淹植物維持生命，還可以抵抗病菌對植物的侵襲；其次，在植物成

12、熟期，乙烯可以影響植物的性別分化并促進其果實成熟；乙烯在葉片和花的衰老中亦起到重要的作用。乙烯最重要的生物學反應是黃化胚芽的三重反應：即莖桿的偏向水平生長、下胚軸膨脹變粗和頂端鉤狀芽彎曲的加劇。51.2.2 植物傷害乙烯的產生切割、碰撞和擦傷等均可引起植物組織、器官的乙烯釋放量的增加，這種增加釋放的乙烯稱之為傷害乙烯。6 橡膠的割膠也是一種機械傷害，因此，橡膠割膠后會產生大量的傷害乙烯，增加了依稀的釋放量。7除此之外，物理壓力、昆蟲或微生物的侵襲、化學處理、輻射、干旱和極端溫度等也能刺激植物組織產生乙烯。對巴西橡膠樹木質器官進行的錘擊實驗結果表明，巴西橡膠樹木質器官遭到機械創(chuàng)傷后與離體的組織器

13、官一樣，會產生傷害乙烯。 81.3 轉錄核心調控因子EIN3/EIL1乙烯途徑信號轉導的下游事件是發(fā)生在細胞核內的基因轉錄調控，由植物特有的核蛋白EIN3/EIL1 所介導，EIN3 是一個乙烯反應的正調控因子。9 大部分與乙烯相關的生物學過程都通過核心轉錄因子EIN3/EIL1調控下游的靶基因來實現(xiàn)的。 EIN3 編碼一個由 628 個氨基酸組成的轉錄因子 . EIN3/EIL1 可以劃分為和 C 端 . 101.4 本研究的目的和意義2 實驗器材及試劑配方2.1 實驗器材-20 度冰箱、 -80 度冰箱、研缽、量筒、試劑瓶、烘箱、氣浴鍋、分析天平、各個量程的移液槍、通風櫥、電泳儀、轉膜儀、

14、滅菌鍋、制冰機、搖床、 1.5ml 試管、 2.0ml 試管、 50ml 離心管、微波爐、鑷子、剪刀、培養(yǎng)皿、各個規(guī)格的槍頭、離心機、分光光度計、真空干燥儀2.2 、試劑配方（ 1）Esen fixing buffer (蛋白固定液）異丙醇25%乙酸10%去離子水65%（ 2）Esen staining buffer(蛋白染色液）0.1% coomassie brilliant blue G250 dissolved in Esen fixing buffer（ 3）Protein extraction buffer(蛋白提取液）Tris-cl ph6.862.5mmGlycerin20%SD

15、S2%Bromphend bluea little-merkapto ethanol1%（ 4）SDS-PAGE 凝膠10%7ml40% Acrylamid1.75ml1.5M Tris-cl ph8.81.9ml10% SDS70l10% APS70lddH2O3.25mlTEMED7l4%2.5ml l40% Acrylamid250l1M Tris-cl ph6.8630l10% SDS25l10% APS12.5 lddH2O1.90mlTEMED5l（ 5）Loading buffer( 上樣緩沖液）SDS10% w/vGlycerol20% v/vTris-cl ph6.80.02

16、mMBromphend blue0.05% w/v-merkapto ethanol10mM（ 6）Staining buffer( 蛋白膠染色液）Methanol( 甲醇）91mlAcetate( 冰醋酸）18.4mlcoomassie brilliant blue R2500.8gH2O91mlDistaining buffer I(蛋白脫色液）Methanol50%Acetate10%H2O40%Distaining buffer II( 蛋白脫色液）Methanol30%Acetate10%H2O60%（ 7）TBST bufferTris-cl ph7.550mMNacl150mMT

17、ween-200.1%3 方法步驟3.1 材料處理在溫室中選取兩株長勢良好且葉片健康的巴西橡膠樹，在兩株橡膠樹上各選取 6 片葉齡相、無蟲咬痕的幼嫩葉片并標記。每片葉片都用鑷子在其正反兩面進行刮傷，刮傷完成之后兩株各取一片用鋁箔包裹保存于-80 度冰箱。后面分別隔1h、4h、6h、 12h、24h 從兩株橡膠樹上取葉片鋁箔包裹并標記后保存于 -80 度冰箱。取葉片的時間分別為2014年 3月 18日 9點、 10 點、 13 點、 15 點、 21 點、次日 9 點。（處理葉片及取葉片過程中必須戴手套操作且鑷子需經過嚴格消毒）3.2 提蛋白取處理過的低溫避光保存的葉片放入-20度預冷的陶瓷研缽

18、中加入液氮沿一個方向快速研磨，待其研磨成粉末狀時加入蛋白提取液繼續(xù)研磨一定時間后，吸取沉淀裝入2ml 試管中，然后放入95 度氣浴鍋中高溫加速提取蛋白 10min。提取完成后稱其重量配平后在14000rpm 的離心機中離心10min，離心完成后用移液槍吸取上清液于1.5ml試管中保存于-20度冰箱。其他幾個時間處理按此步驟提取蛋白并-20度保存。3.3 定蛋白濃度：3.3.1Bradford法Bradford 法屬于染料結合法 , 即考馬斯亮藍 G-250 在酸性溶液中呈紅棕色 , 與蛋白質結合后轉變?yōu)樗{色 , 顏色深淺與蛋白濃度呈正比關系。 Bradford 法法測定蛋白濃度的范圍 為 31

19、 .25 2 000 g/mL。影響B(tài)radford法的主要因素有甘油、乙酸、去污劑和一些堿性緩沖系統(tǒng)。13.3.2CBA 法BCA 法的測定原理為蛋白質價銅離子還原成亞銅離子 , 后者在堿性溶液中與 BCA 結合生成紫紅色絡合物。 BCA 法標準蛋白濃度設置在 20 10 g/mL 時 r 值仍大于 0.998 。影響 BCA 法測蛋白的主要因素有蔗糖、NH+4、尿素、EDTA。尿素和 - 巰基乙醇會干擾 BCA 法的測定 , 所以 BCA 法不適于含有尿素和 - 巰基乙醇的變性液中蛋白含量的測定。 2 3.3.3Esen method（ 1）在高通量蛋白定性濾紙上畫出 1cm×

20、1cm的方格。（ 2）配置濃度梯度為 0.25mg/ml 、0.5mg/ml 、 1.0mg/ml 、2.0mg/ml 的牛血清蛋白液，并準備 0h、1h、4h、 6h、 12h、 24h 的樣品蛋白液。（ 3）在格子中心用移液槍滴加 5 l 牛血清蛋白和蛋白樣品，每個濃度和樣品各兩個格子，待其自然干燥。（ 4）干燥后置于培養(yǎng)皿中，加入配置好的Esen fixing buffer在搖床上固定蛋白 5min。（ 5）棄去蛋白固定液后加入Esen stainingbuffer在搖床上染色 15min。（ 6）染色后取出用開水沖洗兩次，每次10min。（ 7）待其風干后用剪刀沿染液邊緣剪下放入2ml

21、 試管中 , 加入0.5%的SDS溶液1.5ml ，放入55 度氣浴鍋中煮1h。（ 8）取恢復室溫后的液體 1ml 在分光光度計中測 OD612。（ 9）記錄數(shù)據(jù)并做標準曲線（相似度 R2>0.99 才能根據(jù)標準曲線進行蛋白濃度的計算。3.4 十二烷基硫酸鈉（ SDS)- 聚丙烯酰胺凝膠電泳3.4.1 分離膠灌制按照試劑配方配置10%分離膠7ml，按電泳槽說明書組裝凝膠電泳模具 , 用移液槍吸取 10%分離膠溶液 , 沿隔板緩慢加入模具內中 , 避免產生氣泡 , 當加入的溶液至前玻璃板 2cm 時即可停止 . 輕輕在分離膠溶液上加入一層 15mm的去離子水層 , 這使凝膠表面平整 . 等

22、待 15 30min，待凝膠聚合 . TEMED 要在注膠前再加入，混合后快速注膠 . 注膠過程一次性完成 ,避免產生氣泡。3.4.2 濃縮膠灌制按照試劑配方配置 4%濃縮膠 2.5ml ，用移液槍吸取濃縮膠溶液緩慢加入分離膠上面 , 直至凝膠溶液將要到達前玻璃板的頂端 , 插入梳子 , 凝膠聚合時間約 30 min, 然后小心拔出梳子 , 將凝膠放入電泳槽內 , 接好電極 , 將電泳緩沖液加入電泳槽中，要求凝膠的上下端均能浸泡在電泳緩沖液中 . 需同時放置兩塊制好的膠 , 一塊用考馬斯亮藍進行染色后脫色觀察對照，另一塊則進行轉膜后的免疫印跡。3.4.3 制備樣品和上樣把 -20 度保存的已經

23、確定蛋白濃度的6 組不同處理的蛋白樣品按10g 的上樣量吸取一定量于1.5ml 試管中并標記，按照試劑配方配置一定量的上樣緩沖液，在各個樣品中加入等體積的上樣緩沖液混勻后在95 度氣浴鍋中煮10min。在凝膠的左邊第一個孔中各加入6l的雙色預染寬分子量蛋白Marker 。用來轉膜雜交的凝膠從左到右第3、4、5、7、8、9孔中分別用移液槍加入10g 處理時間為 0、 1、4、6、12、 24h 的樣品至孔底部，另一塊染色觀察的膠從左到右第2-8 孔分別上樣 10 g 處理時間為 0、1、 4、 6、 12、24、24 小時葉片蛋白樣品。3.4.4 電泳打開電泳儀，將電流調至15mA，等加入溴酚藍

24、上樣緩沖液的樣品跑完濃縮膠濃縮成一條粗線進入分離膠后將電流調至30mA進行蛋白的分離，待溴酚藍跑的距離膠底部0.5-1cm 時關閉電源停止跑膠。3.4.5 染色與脫色電泳完成后將兩塊膠分別拆下去掉濃縮膠后在其右上角切去一小塊膠以確定膠的正反面。然后一塊膠進行染色脫色，另一塊膠進行轉膜及后續(xù)工作。配置含0.8g 考馬斯亮藍 R250的蛋白染色液200ml，將膠放入玻璃皿中后加入蛋白染色液侵沒整塊膠，然后放在低轉速的搖床上染色1.5h 。染色完成后將膠從染色液中取出放入另一玻璃皿中并加入脫色液I 在低轉速搖床上脫色30min，棄去脫色液，加入脫色液在相同轉速的搖床上脫色過夜。3.5 蛋白免疫印跡（

25、 1）取膠：電泳完成后將膠取下后用去離子水沖洗。（ 2）平衡：將膠放入轉移液中在搖床上平衡以除去SDS。（ 3）PVDF膜：剪和膠大小相當?shù)?PVDF膜，將膜放入 100%的甲醇 中浸泡10min，然后將膜放入轉移液中浸泡10-20min 。（ 4）裝板：裝板順序：黑板海綿 三層濾紙 膠 PVDF膜 三層濾紙海綿 白板。裝板全過程在盛有轉移液的培養(yǎng)皿中進行，濾紙之間以及濾紙和 PVDF膜要趕走所有的氣泡。然后將夾板放入轉移槽中，黑板相對黑極，白板對白極 ( 正極）。（ 5）轉膜與驗證：將組裝好的轉移槽放入冰盒的冰上，電流調到 70mA左右開始轉膜， 1.5-2h 后轉膜停止。轉膜完成后的凝膠取

26、下浸入含 0.8g 考馬斯亮藍 R250 的蛋白染色液中，在低轉速的搖床上染色 1.5h 。染色完成后將膠從染色液中取出放入另一玻璃皿中并加入脫色液 I 在低轉速搖床上脫色 30min，棄去脫色液，加入脫色液在相同轉速的搖床上脫色過夜。第二天觀察經過染色脫色后的凝膠上是否還有條帶， 以確定轉膜是否成功。（ 6）交聯(lián)和封閉：將膜取出后，先用去離子水清洗，然后入 1×TBS中浸洗 5min，再加入 0.2%戊二醛的 TBS中交聯(lián) 45min。將膜放入 1×TBS 中漂洗，除去固定交聯(lián)劑，5min/ 次， 2 次。封閉糖基：浸入高碘酸鉀溶液中在暗處封閉1h。 TBS漂洗 5min

27、，加入含 10%的脫脂奶粉的TBS封閉液在 4 度的環(huán)境下封閉過夜。（ 7）一抗孵育與清洗：一抗孵育：將膜從封閉液中取出浸入用封閉液稀釋1000 倍的一抗Ein3 中，放入搖床，在37 度 60rpm下孵育 2-3h 。一抗清洗：用含0.05%（v/v ）的 tween-20 的封閉液室溫下清洗3次，每次 20min。（ 8）、二抗孵育與清洗：二抗孵育：將清洗掉一抗的膜浸入用封閉液稀釋2000 倍的二抗羊抗兔中，放入搖床，在37 度 60rpm 下孵育 2-3h 。二抗清洗：用1×TBS搖床清洗 3 次，每次 20min。3.6 顯色鑒定二氨基聯(lián)苯胺（ DAB）是過氧化物酶的生色底物

28、，在過氧化氫存在的情況下失去電子從而呈現(xiàn)出顏色的變化和積累，形成淺棕色不溶性的產物。用來檢測過氧化氫酶的活性時靈敏度高且特異性好。二氨基聯(lián)苯胺（DAB)是辣根過氧化物酶最敏感、最常用的顯色底物，所得產物為不溶于水、醇和二甲苯的棕色沉淀物而被廣泛用于蛋白免疫印跡。取二氨基聯(lián)苯胺40 倍濃縮液、雙氧水40 倍濃縮液、 TBS40倍濃縮液各一滴于 2ml 試管中，加入 2ml 的去離子水震蕩使其混合均勻。然后用移液槍加到二抗孵育后的PVDH膜上，在搖床上顯色10-30min 。最后觀察顯色后的 PVDH膜。4 結果與分析4.1 三種方法定蛋白及比較分析4.1.1Esen method定蛋白濃度（ 1

29、）OD612數(shù)據(jù)記錄表Protein probeOD612 wert1OD612 wert2averageBSA（ mg/ml）0.250.0640.0720.0680.50.1060.0880.0971.00.1530.1430.1482.00.2210.2350.228Sample 0h0.1560.1580.1571h0.1720.1660.1694h0.1790.1950.1876h0.1500.1500.15012h0.1670.1630.16524h0.1750.1630.169（ 2）標準曲線OD6120.25y = 0.090x + 0.050R2= 0.9940.2280.2

30、0.150.1480.10.0970.0680.050OD612線性 (OD612)00.511.522.5（ 3）樣品蛋白濃度（ OD612 值代入 y=0.090x+0.050 ）樣品蛋白濃度 ( g/ l)上樣量 ( l)0h1.198.41h1.327.64h1.526.66h1.119.012h1.281.824h1.327.64.1.2Bradford法定蛋白濃度（ 1）Bradford 數(shù)據(jù)記錄表Protein probeBradfordBradford wert2averagewert1BSA（ mg/ml）00000.1220.1120.1170.020.1800.1820.

31、1810.040.2700.2880.2790.060.3310.3250.3280.080.4100.4000.4050.10Sample0h4.895.014.951h5.035.075.054h5.895.815.856h4.514.394.4512h5.455.455.4524h5.114.995.05(2) 標準曲線OD值0.450.4y = 3.615x + 0.0450.4050.35R2= 0.9920.3280.30.2790.25OD值0.20.1810.15線性 (OD值 )0.1170.10.05000.020.040.060.080.10.12（ 3）樣品蛋白濃度（

32、OD 值代入 y=3.615x+0.045 ）樣品蛋白濃度 ( g/ l)上樣量 ( l)0h1.367.351h1.387.254h1.616216h1.228.1912h1.506.6724h1.387.254.1.3BCA 法定蛋白濃度（ 1）BCA數(shù)據(jù)記錄表Protein probeBCA wert1BCA wert2averageBSA（mg/ml）0.250.4960.4900.4930.50.7770.7790.7781.01.1811.2391.2102.02.1232.0972.110Sample0h1.1631.1411.1521h1.2591.2731.2664h1.77

33、01.7341.7526h1.0230.8250.92412h1.5091.5571.53324h1.2431.1971.220(2) 標準曲線（ 3）樣品蛋白濃度（ OD 值代入 y=0.911x+0.293 ）樣品蛋白濃度 ( g/ l)上樣量 ( l)0h0.9410.631h1.079.354h1.606.256h0.6914.1912h1.367.3524h1.029.804.1.4 重復實驗比較分析三種定蛋白的方法所用到的牛血清蛋白和樣品蛋白是在同一條件下保存的同一試管中取得的，因此其蛋白濃度理論上應該是相等的，但是從三種方法的結果來看，不同方法所得的結果有一定的差距。首先，配置的

34、標準濃度的牛血清蛋白液做標準曲線時， Esen method 和 BCA法測得的牛血清蛋白相同濃度的 OD值接近，而 Bradford 法把牛血清蛋白稀釋了 20 倍左右后所得 OD 值與另外兩種方法相差很大，說明稀釋過程中操作不當引起了濃度的誤差。相對于 BCA法而言， Esen method 和 Bradford 法所得樣品的 OD 值比較接近，且各個處理的濃度變化差異也相差不大。重復實驗所得數(shù)據(jù)表明 Esen method 的重復性好，兩次實驗得出的蛋白濃度比較接近，而另兩種方法兩次實驗的結果差異較大，說明Esen method 在定植物蛋白濃度時比 BCA 法和 Bradford 法精

35、確。本實驗主要采用的就是 Esen method 定蛋白濃度，用 BCA法和 Bradford 法可以更好地驗證 Esen method的精確性，同時也可大致確定所提取的橡膠葉片蛋白的濃度。4.2SDS-PAGE分離結果和轉膜后驗證通過十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳所得的凝膠染色脫色后與雙色預染寬分子量蛋白Marker 的說明書中的條帶大小進行比對得出橡膠葉片總蛋白的大小介于40kD-55kD 之間。從顯色的明暗程度來說， 0h、1h、6h、12h 的比較明顯，而4h 的比較暗，而且24h 的觀察不到蛋白的存在。4.3 免疫印跡的顯色結果觀察顯色后的PVDF膜，可以看到在5. 討論2蔣菊生 ,王如松 .中國熱帶北緣橡膠種植生態(tài)工程A.中國科協(xié)2004 年學術年會海南論文集 C.:,2004:5.3黃炎 ,郭慶水 ,徐立新 ,陳守才 .巴西橡膠樹的分子生物學研究進展J.安徽農業(yè)科4祁棟靈 ,王秀全 ,張志揚 ,黃月球 .中國天然橡膠產業(yè)現(xiàn)狀及其發(fā)展建議 J.熱帶農5潘