一種蛋白純化的新思路新方發(fā)法

1、ssb親和層析使用說明書一、 簡介噬菌體t7 單鏈dna結(jié)合蛋白（ssb, single-stranded dna binding protein）由696bp核苷酸編碼，計算分子量為 25.6kda（sds-page凝膠電泳，該蛋白條帶約在27 kda位置）。它與單鏈dna有很強的親和性，且無序列特異性。利用這一特性，將ssb構(gòu)建到不同宿主的表達載體中，可以實現(xiàn)在不同宿主中表達帶有ssb標簽的融合蛋白，從而與偶聯(lián)在介質(zhì)中的單鏈dna高效、特異性結(jié)合，這種結(jié)合是可逆的，能夠在溫和、非變性的條件下通過改變洗脫液的ph值或鹽濃度對融合蛋白進行洗脫，達到純化某一目標蛋白的目的。 pssb系列載體用于

2、構(gòu)建可誘導、高水平表達的基因或基因片段，表達的融合蛋白的n端或c端帶有ssb標簽。ssb標簽可根據(jù)需要由位點特異的蛋白酶切除，pssb系列質(zhì)粒上多克隆位點上游包含有腸激酶（enterokinase）、凝血酶、tev等識別序列。帶有標簽的蛋白可以通過免疫學方法進行檢測，同時根據(jù)實驗需要決定是否切除標簽。ssb親和層析介質(zhì)（經(jīng)過特殊處理的ssdna-cellulose）是專門設(shè)計用于純化ssb融合蛋白及與目的蛋白有親和作用的蛋白復合體的分離介質(zhì)，通過鹽離子梯度洗脫可得到高純度的ssb融合蛋白。純化條件溫和，不引入其他物質(zhì)，能夠保證蛋白的活性。二、 pssb載體現(xiàn)有的pssb載體系列按宿主不同可以分

3、為以下四類：1）大腸桿菌類; 2）酵母類; 3）人細胞類；4）昆蟲細胞類。每一個類別中均含有帶有n端和c端的ssb標簽質(zhì)粒，每個質(zhì)粒都含有相應(yīng)的蛋白酶切位點，可以根據(jù)實驗需要，將ssb標簽從融合蛋白中切去。在不同的宿主載體中，它們的啟動子也各不相同，通過各自的啟動子實現(xiàn)嚴格調(diào)控插入片段的表達。相關(guān)參數(shù)如下頁表一所示： 表一：pssb系列載體宿主載體ssb位于目的蛋白的n端或c端抗性啟動子蛋白酶切位點是否帶his標簽大腸桿菌e.colipssb-e1n端卡納抗性t7腸激酶否pssb-e2n端卡納抗性t7腸激酶是pssb-e3n端（ssb(26c)標簽）卡納抗性t7腸激酶是pssb-e4n端卡納抗

4、性t7凝血酶是pssb-e5n端卡納抗性t7凝血酶否pssb-e6c端卡納抗性t7腸激酶是酵母yeastpssb-y1n端卡納抗性nmt1腸激酶是pssb-y2n端氨芐抗性nmt1腸激酶是pssb-y3c端氨芐抗性nmt1腸激酶是人細胞humanpssb-h1n端氨芐抗性cmvtev是pssb-h2c端氨芐抗性cmv腸激酶是昆蟲細胞insectpssb-i1n端氨芐抗性ph腸激酶是pssb-i2c端氨芐抗性ph腸激酶是具體信息詳見網(wǎng)站：。三、 插入基因片段 每一個pssb表達載體設(shè)計有多個克隆位點。 根據(jù)需要，dna片段可被插入到某一特定的位點。四、 優(yōu)化表達插入dna片段的方向和載體的連接確

5、定無誤后，下一步將要優(yōu)化帶ssb標簽融合蛋白的表達，確定了最佳的蛋白表達水平及相應(yīng)的生長條件后就可以進行大規(guī)模的培養(yǎng)。生長條件應(yīng)考慮最佳的蛋白表達水平，確定一系列諸如培養(yǎng)基、生長溫度、密度、誘導條件等參數(shù)。保證足夠的通氣條件、縮短各個生長時期的時間以及使用正確的抗生素進行篩選都是非常重要的。同時應(yīng)當確定表達的融合蛋白是在包涵體狀態(tài)或可溶狀態(tài)。ssb在一定程度上可以促進目的蛋白的溶解，但有時候會因為過度表達而導致蛋白不能以正確的方式折疊，從而形成包涵體。為降低包涵體的形成，可以適當調(diào)整培養(yǎng)基條件來提高重組蛋白的溶解能力，如：生長溫度降低至15-30，增加通氣，改變誘導條件如降低蛋白表達的速率等。

6、五、 ssdna-cellulosessdna-cellulose由單鏈dna（ssdna）與處理過的cellulose進行偶聯(lián)所得，大約1g cellulose可以偶聯(lián)2-3mg 的ssdna。ssdna可以與ssb特異性結(jié)合，且1ml 溶脹好的ssdna-cellulose柱料可以結(jié)合1-2mg 的帶有ssb 標簽的融合蛋白。此介質(zhì)是自主設(shè)計合成的，具有優(yōu)良的物理和化學穩(wěn)定性，操作方便，批次重復性好，是研發(fā)的理想選擇，具體性能參數(shù)如表二所示：表二：ssdna-cellulose的性能參數(shù)特點成本低，操作方便基質(zhì)纖維素吸附載量1ml吸附1-2mg的ssb融合蛋白介質(zhì)平均直徑100mph范圍3

7、-10保存溫度4-8保存條件干燥保存六、 純化ssb標簽蛋白可以通過親和層析柱（ssdna-cellulose）比較方便的從細胞裂解物中純化。純化時，標簽蛋白與配體結(jié)合，雜質(zhì)通過結(jié)合緩沖液被洗脫去除，之后標簽蛋白在溫和、非變性的條件下被洗脫下來，可以使蛋白的抗原性能和功能得以保護。如果需要將ssb標簽從目的蛋白上切除，標簽蛋白可以在與ssdna-cellulose結(jié)合時使用合適的位點特異性蛋白酶酶切，也可在洗脫之后再酶切，在標簽蛋白與介質(zhì)結(jié)合時酶切可以節(jié)省分離ssb標簽與目的蛋白的步驟，因為這樣在洗脫目的蛋白時ssb標簽仍舊結(jié)合在介質(zhì)上。七、 操作說明1) 緩沖液配制：te：10mm tris

8、-hcl （ph=8.0），1mm edta;結(jié)合緩沖液：50 mm tris-hcl (ph=8.0), 100 mm nacl 或 100 mm kcl, 5 mm edta, 2 mm dtt, 10% glycerol。（結(jié)合緩沖液的鹽濃度可以根據(jù)要純化的蛋白性質(zhì)來調(diào)節(jié)）2) 操作步驟：1、 取適量ssdna-cellulose干料，用te緩沖液溶脹約2-4個小時。0.2g干料可溶脹為1ml 柱材料。裝入層析柱后，用5-10倍的柱體積的te（ph=8.0）洗滌柱子，將未偶聯(lián)的多余dna去除。 2、用結(jié)合緩沖液平衡柱子5-10個床體積。 3、用上述結(jié)合緩沖液溶解表達的帶有ssb標簽融合蛋

9、白的細胞，然后將其超聲破碎或者裂解破碎，細胞裂解液高速離心后取其上清，緩慢注入層析柱，如果樣品掛柱效率低，可降低流速及重復上樣。上樣完畢后用平衡緩沖液再洗至基線。 4、用5-10個柱床體積的低鹽（0.1 m nacl 或 kcl）緩沖液洗脫雜蛋白。 5、然后，梯度性地提高鹽濃度，洗脫目的蛋白。 3) 柱子再生：如果連續(xù)重復純化同一個蛋白，柱子可以再生：首先用含有1.5m或2m的高鹽緩沖液清洗柱子5-10個柱床體積，然后用大量蒸餾水清洗，最后用結(jié)合緩沖液重新平衡。如果長時間不用或者是純化其它蛋白，建議重新使用新的柱材料進行純化。4) 注意事項： 結(jié)合緩沖液可以隨自己所需的要求進行適當更換，如可以

10、使用pbs等其它buffer，但需注意的是，最好不要加入mg2+，edta的濃度保持在2-5mm左右。 層析柱在純化之前溶脹，時間2-4小時，由于dna與cellulose是物理偶聯(lián)，所以不建議長時間溶脹后使用，重復使用次數(shù)不要超過三次。八、 應(yīng)用舉例實例1：將sap1蛋白的基因重組于質(zhì)粒pssb-e4中，并對表達的融合蛋白ssb-sap1進行純化。在e.coli中表達的ssb融合蛋白，每升細胞培養(yǎng)物可以得到3至30毫克蛋白。不同的目的蛋白，表達起伏較大。下面詳細介紹用ssdna-cellulose純化融合蛋白ssb-sap1并用凝血酶對標簽蛋白進行切割。sap1在裂殖酵母中大量存在，分子量為

11、30kda。通過pcr反應(yīng)從裂殖酵母基因組dna中擴增得到sap1基因的dna片段，插入到pssb-e4載體的bam hi和hind iii位點。通過篩選獲得的編碼融合蛋白6his-ssb-sap1的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.coli bl21(de3)plyss細胞中，次日，挑取單菌落接到50ml含有50g/ml卡那霉素lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。過夜的菌液以1:100的比例接到新鮮的培養(yǎng)基中，在37培養(yǎng)至od600為0.5左右，加iptg到0.1mm的終濃度，繼續(xù)37培養(yǎng)誘導3.5h，然后離心收集細胞，用含有0.4m nacl的結(jié)合緩沖液（50 mm tris-hcl (ph=8.0), 5 mm ed

12、ta, 2 mm dtt, 10% glycerol）懸浮菌體，超聲破碎細胞，37000g離心30分鐘。全細胞提取物，以及隨后的細胞裂解液的沉淀和上清用sds-page檢測，圖一表明：6his-ssb-sap1融合蛋白可溶性高，離心后約90%以上在上清中。由于sap1蛋白對鹽濃度較為敏感，所以我們選擇先高鹽得到可溶性蛋白后，將其稀釋到100mm的鹽濃度，高速離心后取上清再對其進行層析純化。figure1: the overexpression of the fusion proteins 6his-ssb-sap1 in e.coli bl21(de3) plys cells.用50 mm t

13、ris-hcl (ph=8.0) ，5 mm edta, 2 mm dtt, 10% glycerol將6his-ssb-sap1的鹽濃度調(diào)到0.1m，再進行ssdna-cellulose層析：1. 層析柱先用te清洗5-10個柱床體積以去除未偶聯(lián)的dna，后用結(jié)合緩沖液平衡5-10個柱床體積。2. 用注射器或蠕動泵加入已處理好的樣品，為了獲得最好的結(jié)果，上樣時可以調(diào)低流速或者重復上樣。3. 用結(jié)合緩沖液至少洗滌5-10個柱床體積，直到吸收達到平穩(wěn)的基線或在流出物中沒有物質(zhì)流出。4. 低鹽緩沖液50 mm tris-hcl (ph=8.0) ，0.2m nacl，5 mm edta, 2 mm

14、 dtt, 10% glycerol洗滌柱子3-4個柱床體積以進一步去除非特異性結(jié)合的雜蛋白。5. 用高鹽緩沖液50 mm tris-hcl (ph=8.0) ，0.4m nacl，5 mm edta, 2 mm dtt, 10% glycerol洗脫目的蛋白，分管收集。純化結(jié)果如圖二所示，根據(jù)密度測定法，6his-ssb-sap1的純度可達到96%左右。figure2: the purification of 6his-ssb-sap1 in e.coli cell extract with ssdna-cellulose affinity chromatography.取100g6his-

15、ssb-sap1加入1單位的凝血酶在0.1m nacl，2.5m cacl2，50 mm tris-hcl (ph=8.0)，5 mm edta, 2 mm dtt，10% glycerol中室溫溫育2到5個小時，如圖三所示，6his-ssb-sap1融合蛋白被凝血酶充分酶解，6his-ssb可以進一步通過鎳-瓊脂糖層析除去。figure3: removal of 6his-ssb tag by ni2+-nta agarose column after thrombin digestion.實例2：將cds1基因重組入質(zhì)粒pssb-y2中，并對表達的融合蛋白ssb-cds1進行純化在酵母中表

16、達的蛋白，一般表達量都很少，目的蛋白占總蛋白的量比例在1%左右甚至更低，只有用western-bloting才能檢測出來，但是，酵母中表達的蛋白質(zhì)一般不會形成包涵體，所以也是蛋白表達較好的一種宿主菌株。cds1基因全長1383bp，編碼460aa，是一個dna復制過程中細胞周期檢驗點中關(guān)鍵的蛋白激酶。將cds1的dna片段插入到pssb-y2中的not和bgl的兩個酶切位點之間，通過篩選獲得編碼融合蛋白6his-ssb-cds1的質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入酵母細胞ld330，在含有5g/ml的維生素b1與不含有uracil的培養(yǎng)基emm平板上32生長，約三四天后，將平板上適量的菌轉(zhuǎn)入50ml含

17、有5g/ml的維生素b1的emm液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當菌體長到一定濃度后，收集菌體并用滅菌水洗菌體2-3次后，將培養(yǎng)基中的維生素b1去除干凈，最后將其換至新鮮的不含有維生素b1的emm培養(yǎng)基中誘導表達，12.5h后收集菌體并進行蛋白純化。用1.2m sorbital將菌體懸起，加入10mm的dtt及適量的lyticase在30消化細胞，待90%的細胞在1% triton x-100中為ghost cell時，立即加入buffer 1（50 mm tris-hcl (ph=8.0) ，0.1m nacl，5 mm edta, 2 mm dtt, 10% glycerol），同時加入蛋白酶抑制劑和終

18、濃度為1%的triton x-100，上下劇烈震蕩幾次后高速離心（15000rpm，4），得到的上清用ssdna-celllulose柱子進行純化。1） 層析柱先用te清洗5-10個柱床體積以去除未偶聯(lián)的dna，后用buffer1平衡5-10個柱床體積。2） 用注射器或蠕動泵加入已處理好的樣品，為了獲得最好的結(jié)果，上樣時可以調(diào)低流速或者重復上樣。3） 用buffer1至少洗滌5-10個柱床體積，直到吸收達到平穩(wěn)的基線或在流出物中沒有物質(zhì)流出。4） 通過逐漸增加buffer1中的鹽離子濃度達到純化ssb-cds1的目的.純化結(jié)果如圖所示，我們得到了可以考染可見的ssb-cds1樣品，且純度在70%以上。figure 4：the purification of ssb-cds1 expressed in yeast cell extract with ssdna-cellulose affinity chromatography. 九、 純化方法的問題解決 表三：純化方法的問題解決問題可能原因解決方法ssb標簽蛋白不結(jié)合柱子或者結(jié)合非常弱目的蛋白可能改變了ssb的構(gòu)象或影響了ssb與ssdna的結(jié)合，因此降低了ssb標簽蛋白的結(jié)合能力。 當目的蛋白是非常大的時候，可能會碰到這個情況。降低樣品上柱時的鹽濃度或改變ssb融