浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-基本技術(shù)

1、原代細(xì)胞培養(yǎng)的原代細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髮?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵罄湎湎瘻叵瘻叵淮涡韵淮涡韵执蜗执蜗?貼塊法貼塊法消化法消化法原代培養(yǎng)方法分類原代培養(yǎng)方法分類分次消化分次消化 消化法的分類消化法的分類外植塊培養(yǎng)步驟圖解外植塊培養(yǎng)步驟圖解懸液細(xì)胞的傳代培養(yǎng)懸液細(xì)胞的傳代培養(yǎng)1.3 1.3 人體活檢人體活檢( (或手術(shù)或手術(shù)) )材料材料人體活檢人體活檢( (或手術(shù)或手術(shù)) )材料材料需要注意的事項(xiàng)需要注意的事項(xiàng)注意：鏡下偶見有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液臺(tái)盼藍(lán)排除檢測(cè)法臺(tái)盼藍(lán)排除檢測(cè)法活體染色與細(xì)胞計(jì)數(shù)活體染色與

2、細(xì)胞計(jì)數(shù)l 3 3) )繪制曲線繪制曲線 以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度 為縱坐標(biāo)，將全部結(jié)為縱坐標(biāo)，將全部結(jié)果在坐標(biāo)紙果在坐標(biāo)紙 上繪圖，即得所培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)上繪圖，即得所培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng) 曲線。曲線。四唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法四唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法100 L單細(xì)胞懸液接種于96孔板(5104)。37 、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間加入2 mg/ml的MTT液（50 L/孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3 h。 吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150 L/孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物溶解。 酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢

3、測(cè)波長(zhǎng)570 nm）。記錄結(jié)果。高濃度血清可影響光吸收值，在加入異丙醇溶液或DMSO前盡量吸凈培養(yǎng)液。吸去培養(yǎng)液時(shí)動(dòng)作要慢,以免吸去形成的結(jié)晶。甘油或DMSO分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，且對(duì)細(xì)胞無明顯毒性。甘油和DMSO并不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí)，需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷。正常細(xì)胞系正常細(xì)胞系癌細(xì)胞系癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆正常細(xì)胞系建立的程序：正常細(xì)胞系建立的程序：原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)第一次傳代第一次傳代常規(guī)傳代常規(guī)傳代凍存和復(fù)蘇凍存和復(fù)蘇癌癌細(xì)胞系建立的程序：細(xì)胞系建立的程序：步驟類似正常細(xì)胞系建立步驟類似正常細(xì)胞系

4、建立注意：注意：取轉(zhuǎn)移灶組織癌細(xì)胞、癌最外層組織取轉(zhuǎn)移灶組織癌細(xì)胞、癌最外層組織去除癌組織中的間質(zhì)細(xì)胞去除癌組織中的間質(zhì)細(xì)胞-膠原酶法膠原酶法細(xì)胞系的維持細(xì)胞系的維持細(xì)胞系檔案要記錄好：細(xì)胞系檔案要記錄好：組織來源、培養(yǎng)基要求、傳代時(shí)間等；組織來源、培養(yǎng)基要求、傳代時(shí)間等；傳代換液有規(guī)律，否則會(huì)引起生物學(xué)特性改變；傳代換液有規(guī)律，否則會(huì)引起生物學(xué)特性改變；多種細(xì)胞維持傳代，要防止交叉污染；多種細(xì)胞維持傳代，要防止交叉污染；要有充足的凍存儲(chǔ)備，防止因污染造成絕種；要有充足的凍存儲(chǔ)備，防止因污染造成絕種；細(xì)胞暫時(shí)不用，最好凍存，以免老化或性狀改變。細(xì)胞暫時(shí)不用，最好凍存，以免老化或性狀改變。鑒定細(xì)胞系的內(nèi)容鑒定細(xì)胞系的內(nèi)容培養(yǎng)物的常用固定方法染色方法干涉顯微鏡掃描隧道顯微鏡原子力顯微鏡視頻顯微鏡共聚焦顯微鏡此課