巴西橡膠樹單染色體分離及其高通量測(cè)序分析的研究

1、專業(yè)： 礦物加工工程姓名： 邵雪嫚導(dǎo)師： 張明旭教授安徽理工大學(xué)安徽理工大學(xué)1313級(jí)碩士研究生級(jí)碩士研究生 學(xué)位論文學(xué)位論文答辯答辯報(bào)告報(bào)告報(bào)告主要內(nèi)容報(bào)告主要內(nèi)容n課題來源課題來源n立題依據(jù)立題依據(jù)n國內(nèi)外研究進(jìn)展國內(nèi)外研究進(jìn)展n本研究的目的和意義本研究的目的和意義n研究內(nèi)容研究內(nèi)容 n研究方法和技術(shù)路線研究方法和技術(shù)路線n預(yù)期目標(biāo)預(yù)期目標(biāo)n新穎之處新穎之處 n所需解決的主要問題所需解決的主要問題n研究基礎(chǔ)和條件研究基礎(chǔ)和條件 n研究進(jìn)度及經(jīng)費(fèi)預(yù)算研究進(jìn)度及經(jīng)費(fèi)預(yù)算選題背景選題背景n最近幾年，由于煤炭的降解機(jī)理與降解酶有著直接的關(guān)系，所以煤炭的生物降解研究主要集中在白腐菌所產(chǎn)生的一系列降解

2、酶，由此也聯(lián)想到通過提高酶活性和產(chǎn)酶量來達(dá)到高降解轉(zhuǎn)化率的目的。一般來說，MnP氧化大部分酚類、胺類等底物，LiP與其互為補(bǔ)充，氧化相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)，而漆酶不僅可以氧化胺類物質(zhì)也可氧化酚類物質(zhì) 9,10。微生物降解煤中有機(jī)硫研究已經(jīng)取得很大的進(jìn)展11-12，其中研究最多的屬嗜硫菌對(duì)模型化合物DBT的降解，并且其確定了4S途徑的降解機(jī)理13，對(duì)于其他含硫模型化合的研究較少，因此本課題研究了DBTO2的脫硫情況。1.課題來源課題來源n基于基因工程構(gòu)建煤炭降解工程菌基于基因工程構(gòu)建煤炭降解工程菌降解轉(zhuǎn)化煤炭的機(jī)理研究降解轉(zhuǎn)化煤炭的機(jī)理研究(51374014) n生物酶脫除煤炭中有機(jī)硫的機(jī)理研生物酶脫除煤

3、炭中有機(jī)硫的機(jī)理研究究（ 51474012）2.立題依據(jù)立題依據(jù) 橡膠橡膠是我國重要的戰(zhàn)略物資是我國重要的戰(zhàn)略物資。國內(nèi)外國內(nèi)外已從橡膠中已從橡膠中克隆了近克隆了近420420種基因或種基因或cDNAcDNA，然而這些基因基本，然而這些基因基本均是從均是從橡膠樹橡膠樹cDNAcDNA文庫或其總基因組中獲得文庫或其總基因組中獲得，無法確定其在無法確定其在橡膠樹染色體上的位置和分布特點(diǎn)，從而導(dǎo)致無法進(jìn)橡膠樹染色體上的位置和分布特點(diǎn)，從而導(dǎo)致無法進(jìn)一步確定其所在的連鎖群。研究者也先后發(fā)表了利用一步確定其所在的連鎖群。研究者也先后發(fā)表了利用各種各種分子標(biāo)記構(gòu)建的橡膠樹連鎖遺傳圖分子標(biāo)記構(gòu)建的橡膠樹連鎖

4、遺傳圖，但均是但均是從總從總基因組中獲得基因組中獲得，并存在著不同程度的連鎖群不穩(wěn)定，并存在著不同程度的連鎖群不穩(wěn)定，豐度小而且分布不均勻，許多功能基因在染色體組上豐度小而且分布不均勻，許多功能基因在染色體組上的連鎖關(guān)系和位置都不清楚，的連鎖關(guān)系和位置都不清楚，直接利用分子標(biāo)記輔助直接利用分子標(biāo)記輔助橡膠樹育種難度較大。橡膠樹育種難度較大。3.國內(nèi)外研究進(jìn)展國內(nèi)外研究進(jìn)展目前木質(zhì)素降解酶已成為國內(nèi)研究的熱點(diǎn)，石開儀等人目前木質(zhì)素降解酶已成為國內(nèi)研究的熱點(diǎn)，石開儀等人發(fā)現(xiàn)白腐真菌通過發(fā)現(xiàn)白腐真菌通過Lac和和Lip的催化作用可以使百里酚的催化作用可以使百里酚脫酚基、脫甲基、開環(huán)、氧化等。何寶燕、

5、尹華、彭脫酚基、脫甲基、開環(huán)、氧化等。何寶燕、尹華、彭輝等人研究了黃孢原毛平革菌輝等人研究了黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)對(duì)十溴聯(lián)苯醚對(duì)十溴聯(lián)苯醚(BDE209)的降解；發(fā)現(xiàn)的降解；發(fā)現(xiàn)在含在含1mg/LBDE209的降解體系中，生物量為的降解體系中，生物量為1.74g降解降解率達(dá)到最大率達(dá)到最大(86.76%)；盧永等利用黃抱原毛平革菌對(duì)；盧永等利用黃抱原毛平革菌對(duì)焦化廢水進(jìn)行降解研究，找到了降解的最優(yōu)條件焦化廢水進(jìn)行降解研究，找到了降解的最優(yōu)條件19；曾斌等研究了白腐真菌對(duì)五氯酚的降解情況曾斌等研究了白腐真菌對(duì)五氯酚的降解情況 20；這；這些都為進(jìn)

6、一步探索微生物對(duì)有機(jī)物的降解打下了基礎(chǔ)。些都為進(jìn)一步探索微生物對(duì)有機(jī)物的降解打下了基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容n （1）紫外誘變對(duì)黃孢原毛平革菌酶活性的）紫外誘變對(duì)黃孢原毛平革菌酶活性的影響以及酶活性與降解率之間的關(guān)系。影響以及酶活性與降解率之間的關(guān)系。n （2）微波誘變后的誘變菌的酶活性變化以及）微波誘變后的誘變菌的酶活性變化以及對(duì)低階煤的降解狀況。對(duì)低階煤的降解狀況。n （3）紫外，微波處理的球紅假單胞菌對(duì)）紫外，微波處理的球紅假單胞菌對(duì)DBT的降解狀況及最適誘變時(shí)間。的降解狀況及最適誘變時(shí)間。n（4）利用響應(yīng)面處理的方法探索影響）利用響應(yīng)面處理的方法探索影響DBT降降解效果的因素。解效果的因素。n

7、（5）球紅假單胞菌對(duì)其他含硫模型化合物的）球紅假單胞菌對(duì)其他含硫模型化合物的降解。降解。創(chuàng)新點(diǎn)創(chuàng)新點(diǎn) n （1）目前，對(duì)于利用紫外、微波誘變方法，篩選誘變菌種已做了大量的研究工作，但是這兩種處理方法對(duì)降解酶系的活性和產(chǎn)量有無影響，以及降解酶活性與降解轉(zhuǎn)化率之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步探索。n（2）球紅菌可以降解轉(zhuǎn)化DBT已被我們所熟知，但是紫外或是微波處理后的菌種對(duì)其降解效果還未被探究。n（3）球紅菌對(duì)其他的含硫模型化合有無降解能力，降解效果如何，降解產(chǎn)物具體是那些等問題還未被探究。n（4）首次利用響應(yīng)面的方法探索了球紅菌降解DBT的影響因素的最佳組合n（5）結(jié)合生物酶提純技術(shù)，首次探索了紫外，微

8、波誘變處理后降解酶的濃度變化與酶活性變化。. . 已發(fā)表的已發(fā)表的采用高通量測(cè)序采用高通量測(cè)序的的植物全基因組植物全基因組 De nove 測(cè)測(cè)序序: : 黃瓜黃瓜( (Cucumis sativus) )（Huang S等等,2009） 蘋果蘋果( (MalusdomesticaBorkhMalusdomesticaBorkh)()(Velasco R等等,2010) 野生大豆野生大豆( (Glycine soja)()(Kim M Y等等,2010) ) 森林草莓（森林草莓（Shulaev V等等,2011)、 可可樹可可樹( (Argout X等等,2011) ) 麻風(fēng)樹麻風(fēng)樹( (Ja

9、tropha curcas)(Sato S)(Sato S等等,2011),2011) 棗椰樹棗椰樹( (Phoenix dactylifera)()(Al-Dous E K等等,2011) )馬鈴薯馬鈴薯( (Solanum tuberosum)(Xu X等等,2011) 白菜白菜( (Brassica rapa)()(Wang X等等,2011) ) 大麻大麻( (Cannabis sativaCannabis sativa)()(van Bakel H等等,2011) ) 木豆木豆( (Cajanus cajan)()(Varshney R K等等, ,2012) ) 蒺藜苜蓿蒺藜苜蓿(

10、 (Medicago truncatula)()(Young N 等等,2011) ) 橡膠樹的橡膠樹的全基因組全基因組 DeDe nove nove 測(cè)序測(cè)序目前還為發(fā)布。目前還為發(fā)布。在植物方面對(duì)植物單條染色體進(jìn)行高通量測(cè)序僅在小在植物方面對(duì)植物單條染色體進(jìn)行高通量測(cè)序僅在小麥的單條染色體臂（聶小軍等麥的單條染色體臂（聶小軍等, ,2013）的研究中有過報(bào)）的研究中有過報(bào)道，在橡膠樹中尚未見報(bào)道。道，在橡膠樹中尚未見報(bào)道。 基因組測(cè)序只能測(cè)出整個(gè)基因組測(cè)序只能測(cè)出整個(gè)DNADNA的堿基對(duì)排列順序，的堿基對(duì)排列順序，不能直接測(cè)出不能直接測(cè)出DNADNA上的基因及其功能，必須上的基因及其功能，

11、必須通過生物信通過生物信息學(xué)方法，結(jié)合蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對(duì)測(cè)出來的序息學(xué)方法，結(jié)合蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對(duì)測(cè)出來的序列進(jìn)行分析，將基因及其功能加以挖掘、注釋，列進(jìn)行分析，將基因及其功能加以挖掘、注釋，這稱這稱作作基因注釋基因注釋。基因組注釋主要包括四個(gè)研究方向：。基因組注釋主要包括四個(gè)研究方向：重重復(fù)序列的識(shí)別；非編碼復(fù)序列的識(shí)別；非編碼RNARNA的預(yù)測(cè)；基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和基的預(yù)測(cè)；基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和基因功能注釋因功能注釋。在國內(nèi)外。在國內(nèi)外在植物方面在植物方面已有對(duì)已有對(duì)花生花生(陳華陳華等等, ,2009)、水稻、水稻(王宏斌等王宏斌等, ,2010)、大豆大豆(王茵茵王茵茵等等, ,2010)

12、、杜仲杜仲(李鐵柱李鐵柱, ,2012)、構(gòu)樹、構(gòu)樹(彭建軍彭建軍, ,2013)，擬南芥擬南芥(張翔張翔, ,2012,2013)等等進(jìn)行基因注釋的相關(guān)報(bào)道。進(jìn)行基因注釋的相關(guān)報(bào)道。在橡膠樹上的基因注釋比較少。在橡膠樹上的基因注釋比較少。4.本研究目的和意義本研究目的和意義 本研究采用本研究采用顯微玻璃針分離技術(shù)顯微玻璃針分離技術(shù)對(duì)巴西橡膠樹部分染色體進(jìn)對(duì)巴西橡膠樹部分染色體進(jìn)行單染色體顯微分離，再利用行單染色體顯微分離，再利用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增法對(duì)橡膠樹部單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增法對(duì)橡膠樹部分單染色體進(jìn)行體外擴(kuò)增，分單染色體進(jìn)行體外擴(kuò)增，并對(duì)其第二輪并對(duì)其第二輪PCR產(chǎn)物采用產(chǎn)物采用Illumi

13、na/Solexa高通量測(cè)序高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而對(duì)相應(yīng)染色體的技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而對(duì)相應(yīng)染色體的序列進(jìn)行序列進(jìn)行序列分析序列分析、功能注釋功能注釋，從而進(jìn)一步，從而進(jìn)一步明確橡膠樹已知的重明確橡膠樹已知的重要功能基因和預(yù)測(cè)功能的基因在橡膠樹染色體組上的位置要功能基因和預(yù)測(cè)功能的基因在橡膠樹染色體組上的位置，初步，初步對(duì)現(xiàn)有的對(duì)現(xiàn)有的橡膠樹連鎖群進(jìn)行歸類橡膠樹連鎖群進(jìn)行歸類。 本項(xiàng)目可為篩選橡膠樹染色體特異片段、單染色體或其區(qū)段本項(xiàng)目可為篩選橡膠樹染色體特異片段、單染色體或其區(qū)段的特異探針或特異標(biāo)記，為構(gòu)建橡膠樹單條染色體功能基因的分的特異探針或特異標(biāo)記，為構(gòu)建橡膠樹單條染色體功能基因的分

14、離和定位及基因組物理圖譜構(gòu)建提供有效工具，從而有效的應(yīng)用離和定位及基因組物理圖譜構(gòu)建提供有效工具，從而有效的應(yīng)用于橡膠樹分子輔助育種。于橡膠樹分子輔助育種。5.研究內(nèi)容研究內(nèi)容5.1巴西橡膠樹熱研巴西橡膠樹熱研7-33-97單染色體分離技單染色體分離技術(shù)體系的建立。術(shù)體系的建立。 主要通過借助主要通過借助顯微操作儀的顯微操作儀的玻璃針分離法玻璃針分離法，進(jìn)行巴西橡膠樹熱研進(jìn)行巴西橡膠樹熱研7-33-97部分部分單條染色體分單條染色體分離和技術(shù)體系的優(yōu)化。離和技術(shù)體系的優(yōu)化。5.2單條染色體體外擴(kuò)增與鑒定單條染色體體外擴(kuò)增與鑒定 采用采用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增法單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增法對(duì)已分離出的對(duì)已分

15、離出的巴 西 橡 膠 樹 染 色 體 進(jìn) 行 體 外 擴(kuò) 增 ， 通 過巴 西 橡 膠 樹 染 色 體 進(jìn) 行 體 外 擴(kuò) 增 ， 通 過SouthernSouthern雜交鑒定雜交鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物來自巴西橡膠樹基擴(kuò)增產(chǎn)物來自巴西橡膠樹基因組，經(jīng)因組，經(jīng)熒光原位雜交熒光原位雜交（FISH)驗(yàn)證驗(yàn)證并結(jié)合并結(jié)合核核型分析確定型分析確定染色體染色體序序號(hào)號(hào)。5.3巴西橡膠樹單染色體巴西橡膠樹單染色體PCR產(chǎn)物高通量測(cè)序與產(chǎn)物高通量測(cè)序與序列的功能注釋序列的功能注釋 對(duì)已鑒定的對(duì)已鑒定的單染色體第二輪的單染色體第二輪的PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行Illumina/Solexa高通量高通量測(cè)序測(cè)序，并對(duì)，

16、并對(duì)測(cè)序結(jié)果測(cè)序結(jié)果通過相應(yīng)生通過相應(yīng)生物信息學(xué)分析物信息學(xué)分析進(jìn)行其功能注釋。進(jìn)行其功能注釋。如單條染色體測(cè)得的如單條染色體測(cè)得的序列片段進(jìn)行編號(hào)、片段大小分析，通過序列片段進(jìn)行編號(hào)、片段大小分析，通過BLASTBLAST在線進(jìn)在線進(jìn)行各橡膠樹序列與基因庫中橡膠樹已知功能基因或未行各橡膠樹序列與基因庫中橡膠樹已知功能基因或未知基因知基因序列比對(duì)序列比對(duì)，進(jìn)一步，進(jìn)一步明確橡膠樹重要功能基因在明確橡膠樹重要功能基因在橡膠樹染色體組上的位置橡膠樹染色體組上的位置，同時(shí)對(duì)同源染色體的序列，同時(shí)對(duì)同源染色體的序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而分析同源染色體之間在進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而分析同源染色體之間在DNADNA水平上可

17、能水平上可能存在的差異等。存在的差異等。6.研究方法與技術(shù)路線研究方法與技術(shù)路線6.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 本研究的主要實(shí)驗(yàn)材料是：本研究的主要實(shí)驗(yàn)材料是：黃孢原毛黃孢原毛平革菌，球紅假單胞菌，平革菌，球紅假單胞菌，DBTDBT。6.2研究方法研究方法n1紫外誘變n（1）首先打開紫外燈預(yù)熱）首先打開紫外燈預(yù)熱30min穩(wěn)定光波穩(wěn)定光波 取制備好的孢子懸液各取制備好的孢子懸液各6ml于于9ml的平的平板培養(yǎng)平皿中，放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊照射控制照射距離板培養(yǎng)平皿中，放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊照射控制照射距離30cm。輻射處理。輻射處理時(shí)間梯度為：時(shí)間梯度為：0s；20s；40s；80s；120s

18、；160s；200s；250s。所有操作必須在紅。所有操作必須在紅燈下進(jìn)行，照射后的菌體不可直接接到平板培養(yǎng)基上，必須轉(zhuǎn)入無菌試管中并立燈下進(jìn)行，照射后的菌體不可直接接到平板培養(yǎng)基上，必須轉(zhuǎn)入無菌試管中并立即放入無光照的冰水中即放入無光照的冰水中1-2h，防止細(xì)胞修復(fù)，影響實(shí)驗(yàn)效果。，防止細(xì)胞修復(fù)，影響實(shí)驗(yàn)效果。n（2）取上述誘變處理的菌懸液）取上述誘變處理的菌懸液0.5ml均勻涂布于平板固體培養(yǎng)基上，四天后觀察均勻涂布于平板固體培養(yǎng)基上，四天后觀察菌落生長狀況，圖片記錄。將上述各自生長狀況良好的菌落同上制成菌落生長狀況，圖片記錄。將上述各自生長狀況良好的菌落同上制成106/ml的孢的孢子懸液

19、，接子懸液，接1ml菌懸液于菌懸液于50ml的發(fā)酵液中，搖床培養(yǎng)的發(fā)酵液中，搖床培養(yǎng)7天后，分別取天后，分別取10ml樣品裝入樣品裝入小錐形瓶，加入各種酶提取用緩沖溶液（小錐形瓶，加入各種酶提取用緩沖溶液（LiP采用緩沖液采用緩沖液A，MnP采用緩沖液采用緩沖液B，漆酶采用漆酶采用100mmol/L的醋酸鈉緩沖液，的醋酸鈉緩沖液，PH5.0）振蕩提?。┱袷幪崛?h，150rpm。離心。離心（4200rpm,20min），取上清液用），取上清液用0.45um濾膜過濾，濾液用于測(cè)定酶活。濾膜過濾，濾液用于測(cè)定酶活。n2微波誘變n打開微波爐，選取中檔功率，取制備好的打開微波爐，選取中檔功率，取制備好

20、的106/ml孢子懸液孢子懸液30ml與錐形瓶中，取與錐形瓶中，取1000ml大燒杯，其中加入蒸餾水適量，將錐形瓶放入，確保蒸餾水液面淹沒錐形大燒杯，其中加入蒸餾水適量，將錐形瓶放入，確保蒸餾水液面淹沒錐形瓶中孢子懸液的液面。每照射瓶中孢子懸液的液面。每照射20S后取出錐形瓶，用移液槍取后取出錐形瓶，用移液槍取1ml于配置好的發(fā)酵于配置好的發(fā)酵液中，然后用溫度測(cè)量儀檢測(cè)蒸餾水的溫度，當(dāng)超過液中，然后用溫度測(cè)量儀檢測(cè)蒸餾水的溫度，當(dāng)超過40時(shí)必須換掉燒杯中的蒸時(shí)必須換掉燒杯中的蒸餾水，如此反復(fù)操作，直到照射時(shí)間達(dá)到餾水，如此反復(fù)操作，直到照射時(shí)間達(dá)到160S，預(yù)先設(shè)置的最大時(shí)間梯度。將處，預(yù)先設(shè)

21、置的最大時(shí)間梯度。將處理好的發(fā)酵液放在搖床培養(yǎng)箱中理好的發(fā)酵液放在搖床培養(yǎng)箱中30,120轉(zhuǎn)，培養(yǎng)一周，取出測(cè)其酶活性轉(zhuǎn)，培養(yǎng)一周，取出測(cè)其酶活性49-51。研究方法研究方法n2.3.3酶活性測(cè)定方法n(1)LiP活性測(cè)定活性測(cè)定52：采用藜蘆醇法，一個(gè)酶活力單位定義為：采用藜蘆醇法，一個(gè)酶活力單位定義為(U)每分鐘氧化藜蘆醇產(chǎn)生每分鐘氧化藜蘆醇產(chǎn)生1mol藜蘆藜蘆醛所需的酶量。取醛所需的酶量。取0.6ml藜蘆醇溶液（藜蘆醇溶液（10mmol/L）加入）加入1.2ml緩沖液緩沖液A與與1.2ml粗酶液混勻，得反應(yīng)液粗酶液混勻，得反應(yīng)液3ml，向，向反應(yīng)液中加入反應(yīng)液中加入60LH2O2溶液（溶

22、液（2mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，在）啟動(dòng)反應(yīng)，在310nm下測(cè)定反應(yīng)下測(cè)定反應(yīng)1min吸光度值的變化。吸光度值的變化。n（2）MnP活性測(cè)定活性測(cè)定53：一個(gè)酶活力單位：一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化定義為每分鐘氧化Mn2+產(chǎn)生產(chǎn)生1molMn3+所需酶量。取所需酶量。取2.4ml含含MnSO4(1.25mmol/L)的酒石酸緩沖液的酒石酸緩沖液B加入加入0.6ml粗酶液混勻得到粗酶液混勻得到3ml反應(yīng)液，加入反應(yīng)液，加入60LH2O2溶液溶液（2mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)在）啟動(dòng)反應(yīng)在290nm下測(cè)定反應(yīng)下測(cè)定反應(yīng)1min吸光度值的變化。吸光度值的變化。n（3）Lac活性方法見文獻(xiàn)活性方法見

23、文獻(xiàn)54：一個(gè)酶活力單位定義：一個(gè)酶活力單位定義(U)為為1mol的的ABTS所需的酶量，以不加啟動(dòng)因子的混所需的酶量，以不加啟動(dòng)因子的混合液為空白樣。以合液為空白樣。以ABTS為底物在為底物在420nm下測(cè)定下測(cè)定3min內(nèi)吸光度的變化。內(nèi)吸光度的變化。3ml反應(yīng)液包括：緩沖液反應(yīng)液包括：緩沖液C，0.4ml粗粗酶液，酶液，0.6mlABTS(1.0mmol/L)55。n2.3.4降解率的測(cè)定n用紫外誘變后的平板制成用紫外誘變后的平板制成106/ml的菌懸液，分別取的菌懸液，分別取1ml于于50ml的發(fā)酵液中，置于搖床培養(yǎng)的發(fā)酵液中，置于搖床培養(yǎng)2天后分別加入天后分別加入0.4g處理過的內(nèi)蒙

24、褐煤煤樣，搖床培養(yǎng)一周，取發(fā)酵液處理過的內(nèi)蒙褐煤煤樣，搖床培養(yǎng)一周，取發(fā)酵液3500rpm離心，將離心后的上清液加鹽酸，出現(xiàn)絮狀沉淀，離心，將離心后的上清液加鹽酸，出現(xiàn)絮狀沉淀，將沉淀干燥后稱重，計(jì)算降解率將沉淀干燥后稱重，計(jì)算降解率56，即：，即：n=M1/M0100%(3)n式中：式中：nM0加入的每樣質(zhì)量加入的每樣質(zhì)量gn M1煤炭降解后上清液中的質(zhì)量煤炭降解后上清液中的質(zhì)量gn煤炭降解轉(zhuǎn)化率煤炭降解轉(zhuǎn)化率%n2.3.5 2-HBP測(cè)試方法nGibbs 試劑在弱堿性條件下可與酚羥基對(duì)位的活潑氫縮合成藍(lán)色絡(luò)合物，可用來檢測(cè)酚羥基對(duì)位無取代基的試劑在弱堿性條件下可與酚羥基對(duì)位的活潑氫縮合成藍(lán)

25、色絡(luò)合物，可用來檢測(cè)酚羥基對(duì)位無取代基的化合物，化合物，0.2g的的2.6二氯醌亞胺溶于二氯醌亞胺溶于200ml的乙醇溶液中，備用。的乙醇溶液中，備用。nGbbs試劑方法為：將菌液離心后，取上清液試劑方法為：將菌液離心后，取上清液1ml加入加入2ml的的pH9.0的緩沖液中，加入的緩沖液中，加入12滴滴20%的的Na2CO3以以保證反應(yīng)體系中的保證反應(yīng)體系中的pH9,最后加入最后加入60ul的的Gibbs試劑，混勻后加入試劑，混勻后加入30水浴鍋振蕩水浴鍋振蕩30min,以不加上清液的作為以不加上清液的作為對(duì)照，在對(duì)照，在610nm下測(cè)定光密度下測(cè)定光密度57。紫外誘變白腐菌酶紫外誘變白腐菌酶

26、酶活性檢測(cè)酶活性檢測(cè)褐煤降解率檢測(cè)褐煤降解率檢測(cè)微波誘變白腐菌微波誘變白腐菌酶活性檢測(cè)酶活性檢測(cè)酶活性大小對(duì)比，最適誘變時(shí)間酶活性大小對(duì)比，最適誘變時(shí)間6.3 技術(shù)路線技術(shù)路線紅外分析紅外分析掃描電鏡分析掃描電鏡分析降解率對(duì)比，最適誘變時(shí)間降解率對(duì)比，最適誘變時(shí)間紫外，微波誘變效果大小對(duì)比分析紫外，微波誘變效果大小對(duì)比分析褐煤降解率檢測(cè)褐煤降解率檢測(cè)紅外分析紅外分析掃描電鏡分析掃描電鏡分析技術(shù)路線技術(shù)路線紫外誘變白腐菌降解紫外誘變白腐菌降解DBT紫外誘變球紅菌降解紫外誘變球紅菌降解DBT2-HBP檢測(cè)檢測(cè)2-HBP檢測(cè)檢測(cè)脫硫效果對(duì)比分析脫硫效果對(duì)比分析球紅假單胞菌降解球紅假單胞菌降解DBT的

27、響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面結(jié)果分析響應(yīng)面結(jié)果分析7.研究成果研究成果n1）1）在紫外誘變條件下，白腐菌三種降解酶的濃度與酶活性均出現(xiàn)了規(guī)律的變化，酶濃度變化為LiP濃度隨著誘變時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先增大后減小，在40-160S之間LiP生成量較大，繼續(xù)增加誘變時(shí)間時(shí)。濃度下降，推測(cè)誘變時(shí)間太長，殺死了大量的菌株，從而使產(chǎn)酶量下降。MnP濃度開始階段無太大變化，但是隨著時(shí)間的增加出現(xiàn)大幅度上升，推測(cè)此誘變時(shí)間段為最適誘變時(shí)間，得到的誘變菌產(chǎn)酶量最大，120S酶濃度最大。Lac濃度整體呈下降趨勢(shì)，誘變菌的濃度均低于對(duì)照組，由此推測(cè)對(duì)于Lac來說，紫外誘變?yōu)樨?fù)突變。酶活性測(cè)試結(jié)果與酶濃度大體相同，說

28、明酶活性與濃度有著直接的線性關(guān)系，即酶濃度基本上決定著酶活性的大小n2）在微波誘變條件下，1）隨著微波誘變時(shí)間的增加LiP酶活性整體上呈現(xiàn)先增大后下降的現(xiàn)象，這與紫外誘變相類似，并且酶活性均大于對(duì)照組，MnP酶的活性整體上變化幅度較小，在150S左右時(shí)酶活得到稍微提高，隨著時(shí)間的增加，進(jìn)而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，Lac的活性基本上未出現(xiàn)變化。說明微波誘變對(duì)漆酶的產(chǎn)生沒有影響。綜合考慮降解酶活性的變化，微波誘變時(shí)間在150S時(shí)的酶活性最大，因此為了提高降解率，微波誘變時(shí)間應(yīng)控制在120S到180。與紫外誘變相比，微波誘變時(shí)酶活性變化幅度較小，且微波誘變操作復(fù)雜。條件難以控制。誤差較大，不建議使用。n3）

29、通過兩個(gè)不同濃度DBT的脫硫體系的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加DBT的濃度可以提高降解數(shù)量，有利于充分利用降解體系的降解作用，避免資源的浪費(fèi)。從兩個(gè)誘變體系，發(fā)現(xiàn)隨著DBT濃度的增加，脫硫效率并沒有呈現(xiàn)相應(yīng)幅度的增加，推測(cè)高濃度DBT對(duì)菌種的發(fā)酵培養(yǎng)起到抑制的作用，因此后續(xù)的工作應(yīng)該從解除抑制作用著手。微波誘變與紫外誘變對(duì)球紅菌的脫硫能力仍有一定的影響，兩者相比，紫外誘變的的效果較好，而微波誘變降解率基本無多大的波動(dòng)，說明球紅菌對(duì)于紫外誘變較敏感，而微波由于操作復(fù)雜，過程難以控制，實(shí)驗(yàn)誤差較大，所以從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得出，不建議使用。為解除DBT對(duì)菌種生長的抑制作用，設(shè)計(jì)了菌種的馴化實(shí)驗(yàn)，馴化菌的降解率均大

30、于自然菌種，推測(cè)DBT作為誘導(dǎo)物起到了促進(jìn)作用。n4）響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)篩選出了影響DBT降解的顯著性因素，即pH，接菌量，DBT含量，為以后含硫模型化合物的高效脫除提供了依據(jù)。n5)黃孢原毛平革菌與紅球假單胞菌均有降解低階煤的作用，但是黃孢菌的降解效果優(yōu)于球紅菌，而對(duì)于含硫模型化合物DBT與DBTO2的降解，球紅菌的脫硫效果卻明顯高于黃孢菌。n6）綜合兩者的優(yōu)缺點(diǎn)，使用混合菌種的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，旨在先利用黃孢菌的降解作用，再進(jìn)行脫硫，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了優(yōu)于球紅菌單一菌種的脫硫效果。進(jìn)一步完善橡膠樹單染色體微分離技術(shù)體系，為功能基因的發(fā)現(xiàn)、分離與轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。8.展望展望n1）為了克服木質(zhì)素降解菌在煤炭降解體系

31、中生長繁殖受限制的問題，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，如利用黃孢原毛平革菌與哈慈木霉融合，不僅可以利用黃孢原毛平革菌作為模式菌種的優(yōu)勢(shì)，又可以利用哈慈木霉適應(yīng)性強(qiáng)、生長繁殖快的特點(diǎn)。n（2）為了提高酶產(chǎn)量，可以通過從高產(chǎn)酶的降解菌種中克隆出產(chǎn)酶基因，然后導(dǎo)入一些耐受性較強(qiáng)的菌種中，也可以利用DNA改組技術(shù)，定向改變菌種一些特性。n（3）要實(shí)現(xiàn)煤炭生物降解的工業(yè)化生產(chǎn)還必須解決生物降解底物的抑制問題，因此生物降解過程必須脫離活菌，這就要求我們?cè)谑炀氄莆丈锝到鈾C(jī)理的同時(shí)，模擬其降解轉(zhuǎn)化過程，研制出生物降解轉(zhuǎn)化催化劑。n（4）此外我們也可以應(yīng)用定向進(jìn)化技術(shù)和快速比色篩選法獲得突變基因，這些突變基因所編碼的

32、酶對(duì)一些底物有更好的穩(wěn)定性以及更高的降解活性。n（5）為了提高降解效率和優(yōu)化脫硫效率，以后的研究可以考慮從混合菌種著手，充分利用各個(gè)菌種的優(yōu)勢(shì)，達(dá)到理想效果。n6)從本研究內(nèi)容發(fā)現(xiàn)，無論是低階煤的降解還是模型化合物的脫硫均存在底物抑制，因此可以此為出發(fā)點(diǎn)尋找高效誘導(dǎo)物，進(jìn)行菌種馴化，提高實(shí)驗(yàn)效果。9.擬解決的擬解決的關(guān)鍵性問題關(guān)鍵性問題 本項(xiàng)目的關(guān)鍵性問題之一是本項(xiàng)目的關(guān)鍵性問題之一是制備高質(zhì)量橡膠染色體制備高質(zhì)量橡膠染色體標(biāo)本標(biāo)本并從并從中期分裂中期分裂相中相中分離出分離出無污染的無污染的單條染色體單條染色體。在國內(nèi)外有關(guān)高通量測(cè)序和基因注釋方面的文獻(xiàn)大多在國內(nèi)外有關(guān)高通量測(cè)序和基因注釋方面

33、的文獻(xiàn)大多是與全基因組和轉(zhuǎn)錄組相關(guān)，對(duì)于整條染色體進(jìn)行測(cè)是與全基因組和轉(zhuǎn)錄組相關(guān)，對(duì)于整條染色體進(jìn)行測(cè)序分析和基因注釋的，報(bào)道較少，因此對(duì)橡膠樹單條序分析和基因注釋的，報(bào)道較少，因此對(duì)橡膠樹單條染色體測(cè)序后如何對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因注釋是本實(shí)驗(yàn)染色體測(cè)序后如何對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因注釋是本實(shí)驗(yàn)要解決的另一個(gè)關(guān)鍵性問題。要解決的另一個(gè)關(guān)鍵性問題。10.研究基礎(chǔ)和條件研究基礎(chǔ)和條件n課題組主要成員長期從事作物遺傳育種教學(xué)與研究工作，具有豐課題組主要成員長期從事作物遺傳育種教學(xué)與研究工作，具有豐富的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，已研究了木薯染色體核型和帶型，甘富的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，已研究了木薯染色體核型和帶型，甘蔗基因組熒光原位雜交研究，正在開展橡膠樹基因的原位蔗基因組熒光原位雜交研究，正在開展橡膠樹基因的原位PCRPCR研研究以及木薯基因的原位究以及木薯基因的原位PCRPCR研究。研究。n在植物單染色體方面本課題組成員已經(jīng)開始對(duì)具有中、小染色體在植物單染色