病毒感染細胞實驗整體流程及原理

1、病毒感染細胞實驗整體流程及原理 目的基因不能直接整合到大多數(shù)真核細胞，常用的手段是將目的基因包裝成病毒來感染細胞，從而得到表達滿足實驗需求。1、病毒的種類病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的siRNA / miRNA慢病毒載體，與化學合成的siRNA 和基于瞬時表達載體構(gòu)建的普通 siRNA 載體相比，一方面可以擴增替代瞬時表達載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態(tài)的細胞，并且在感染后可以整

2、合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩(wěn)定表達。1.1.2特點1） 直接包裝成為假病毒顆粒，對分裂和非分裂細胞均有感染作用，適合 RNAi 研究和體內(nèi)實驗中難于轉(zhuǎn)染的細胞 (比如神經(jīng)元細胞、干細胞或其它原代細胞)。 2） 可以通過簡單方式，在短時間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達特定基因的多種細胞株。3） 可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動物研究。4） 無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡便。5） 可以根據(jù)客戶需要制備多種標記。1.1.3慢病毒包裝簡要流程：1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。 2） 慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞293T等。 3） 培養(yǎng) 48hrs - 72

3、hrs 左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。 4） 病毒的純化和濃縮。 5） 分裝、- 80 保存。 6） 滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報告。1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復(fù)制不依賴于宿主細胞的分裂。有近50個血清型，大多數(shù)Ad載體都是基于血清型2和5，通過轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復(fù)制能力。這些重組病毒僅在高水平表達E1和E3基因的細胞中復(fù)制，因此是一種適用于治療的高效控制系統(tǒng)。1.2.2特點1） 幾乎可以感染所有類型的細胞2） 可以獲得復(fù)制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒3） 病毒滴度高，產(chǎn)生病

4、毒經(jīng)過濃縮后可以達到 1012 PFU/mL，能有效的進行增殖。4） 腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡單.5） 感染細胞時，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險，生物安全性高。1.2.3腺病毒包裝簡要流程1） 構(gòu)建表達 siRNA/miRNA 的腺病毒載體2） 采用 PacI 消化純化的質(zhì)粒。3） 消化好的腺病毒表達載體轉(zhuǎn)染 293A 細胞，收獲細胞以制備病毒粗提液。4） 將病毒粗提液感染 293A 細胞以擴增病毒。5） 分裝，-80保存。1.3、慢病毒和腺病毒的比較慢病毒載體系統(tǒng)和腺病毒載體系統(tǒng)比較病毒表達系統(tǒng)慢病毒表達系統(tǒng)（Lentivirus）腺病毒表達系

5、統(tǒng)（Adenovirus）病毒基因組RNA病毒雙鏈DNA病毒復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制是否整合病毒基因組整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達外源基因病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時表達外源基因感染細胞類型感染分裂和不分裂細胞，適用于難轉(zhuǎn)染的原代細胞（如神經(jīng)細胞）及體內(nèi)實驗感染分裂和不分裂細胞表達風度中水平表達高水平表達表達時間慢（1-3天）快（1-2天）滴度滴度最高可達10*8pfU/ml滴度最高可達10*11pfU/ml克隆容量可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入高達8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、構(gòu)建目的基因到載體2.1構(gòu)

6、建手段一般是根據(jù)原始質(zhì)粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。1）如果原始質(zhì)粒與載體有匹配酶切位點，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到載體，酶切，并測序鑒定2）如果沒有匹配的酶切位點，則設(shè)計帶有特殊接頭的引物進行PCR擴增，得到目的片段，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并測序鑒定2.2質(zhì)粒載體2.2.1概念能夠進行自主復(fù)制的環(huán)狀DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細菌細胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子2.2.2特征質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類

7、質(zhì)粒能夠整合進真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)粒在宿主細胞體內(nèi)外都可復(fù)制。通過個些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構(gòu)建在質(zhì)粒中，通過轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，利用選擇培養(yǎng)基來篩選從而不斷的復(fù)制，來得到目的產(chǎn)物。3、質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴增，然后提取質(zhì)粒，以下是質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化的三步驟。3.1大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備1）從大腸桿菌平板上挑取一個單菌落于3mlLB培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜。2）取0.4ml菌液轉(zhuǎn)接到40mlLB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)23h3）菌液轉(zhuǎn)移到50ml離

8、心管中，冰上放置10min4）4離心10min（4000r/min）5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡6）用冰浴的0.1mol/L氯化鈣10ml懸浮細胞沉淀，立即冰浴30min7）4離心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化鈣2ml懸浮細胞（冰上放置）9）分裝細胞，200ul一份，4保存3.2質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化1）取200ul新鮮制備的感受態(tài)細胞，加入質(zhì)粒DNA2ul混勻，冰浴30min2）離心管放到42保溫90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1h（150r/min）5）取適當體積（100ul）的復(fù)蘇細胞，涂布在選擇性培養(yǎng)

9、基上，正置30min6）倒置平皿37，1216h，出現(xiàn)菌落3.3質(zhì)粒提取步驟1）取14ml在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，12000轉(zhuǎn)離心1min，棄上清2）加250ul溶液/RNaseA（溶液為細胞懸浮液）混合液，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮，室溫靜置1-2min。3）加入250ul溶液（細胞裂解液），輕柔的反復(fù)顛倒混勻5-6次。室溫放置1-2min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。4）加入350ul溶液（中和液），立刻輕柔地反復(fù)顛倒混勻5-6次，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。5）12000室溫離心10min，收集上清。6）將上清置于DNA純化柱中，靜置1-2min。7）12000轉(zhuǎn)離心

10、1min，棄濾液。8）加入500ul溶液PB（洗滌液）12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，目的是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)量質(zhì)粒DNA。9）加入500ul溶液W（去鹽液），12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，重復(fù)一次。10）12000轉(zhuǎn)離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。11）將DNA純化柱置于新的離心管中，懸浮滴加50-100ul溶液Eluent（為無菌的雙蒸水，PH為8.0-8.5），室溫放置2min。12）12000轉(zhuǎn)離心1min，此時管底即為高純度的質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒于-20保存。質(zhì)粒提取步驟：吸取液體培養(yǎng)基于1.5ml離心管中12000轉(zhuǎn)離心1min，棄上清，吸

11、取培養(yǎng)基重復(fù)離心棄上清離心，留取少量菌液作為菌種保存，可直接置于-20加250ulBufferS1懸浮細菌，懸浮均勻加250ulBufferS2溫和充分的上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻，使菌體裂解加350ulBufferS3溫和上下翻轉(zhuǎn)12000離心10min取上清液轉(zhuǎn)移到專用的制備管（2ml）12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液加500ulBufferW112000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液加500ulBufferW212000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，重復(fù)一遍將制備管置回2ml離心管12000轉(zhuǎn)離心1min將制備管移入新的1.5ml離心管中，加6080ulEluent或離子水，室溫1min12000轉(zhuǎn)離心

12、1min移去制備管，將有質(zhì)粒的離心管于4或是-20保存4、質(zhì)粒DNA和其他包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞產(chǎn)生病毒（即病毒包裝）4.1名詞解釋4.1.1293T細胞是由293細胞派生, 表達SV40大T抗原的人腎上皮細胞系, 被廣泛應(yīng)用于瞬時轉(zhuǎn)染以過表達各種目標蛋白, 或是用以包裝病毒。4.1.2脂質(zhì)體：某些細胞質(zhì)中的天然脂質(zhì)小體，可作為生物膜，用于捕獲外源性物質(zhì)后更有效地運送到靶細胞，經(jīng)同細胞融合而釋放。4.2共轉(zhuǎn)染的操作步驟第一天：用無抗生素DMEM+10%FBS鋪板293FT細胞，2ml/孔。確保第二天細胞密度達到80%-90%融合度第二天：1. 500ul 無血清培養(yǎng)基稀釋2ug 表達質(zhì)粒+

13、1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G 2. 500ul 無血清培養(yǎng)基稀釋15ul 脂質(zhì)體20003. 5min后，將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液混合，室溫靜止20min 4. 從6孔板中吸出1ml無血清培養(yǎng)基，然后滴加入1ml質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物。5. 6-10h后，移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以正常培養(yǎng)液DMED+10%FB（從此刻開始算時間）。第三天：1.轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達到70%以上第四天：1.轉(zhuǎn)染后48和72h分別收獲含病毒的上清。2.3000 rpm 離心20min，0.45um濾膜過濾，去除細胞沉淀。3.12000轉(zhuǎn)離心濃縮細胞、分裝-

14、80°C貯存。4.滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報告。4.3病毒包裝的原理質(zhì)粒DNA為能轉(zhuǎn)錄出慢病毒遺傳物質(zhì)（RNA），但不能翻譯出慢病毒的外殼及蛋白成分的載體質(zhì)粒，其同時連有目的基因和報告基因，psPAX2為能表達慢病毒外殼的質(zhì)粒，其表達產(chǎn)物可通過粘附機制更易穿過細胞膜， pMD2.G為慢病毒的膜蛋白質(zhì)粒，通過 lipofectamine2000進行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到靶細胞基因組中，宿主基因組在表達時，隨宿主基因轉(zhuǎn)錄出的目的基因RNA與psPAX2、pMD2.G基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用該病毒感染靶細胞，病毒進入細胞后，其遺傳物質(zhì)R

15、NA反轉(zhuǎn)錄出DNA，該基因再整合到靶細胞的基因組中，完成轉(zhuǎn)染過程，因為質(zhì)粒DNA只能轉(zhuǎn)錄出病毒RNA和表達目的基因卻不能表達出病毒的外殼和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一樣在宿主細胞能反復(fù)增殖，故對宿主細胞是無害的并且高效的將目的基因轉(zhuǎn)然到靶細胞基因組中。5、慢病毒感染細胞5.1流程圖5.2感染步驟1）鋪板：將對數(shù)生長期的細胞消化重懸后，按1*105/L密度接種于12孔板，生長過夜2）感染：將70-80%鋪滿12孔板中的培養(yǎng)液吸除，換新鮮的培養(yǎng)液，同時加入PBS濃度梯度稀釋的病毒液，混合均勻后即可放入孵箱培養(yǎng)。3) 24h左右可換液，48小時即可看熒光，具體根據(jù)細胞狀態(tài)來看。5.3熒光顯微

16、鏡的操作流程打開熒光器（30min內(nèi)不能關(guān)閉，否則影響顯微鏡壽命），細胞培養(yǎng)板置于載物臺，調(diào)節(jié)物鏡和光圈，先用自然光觀察視野內(nèi)細胞，再關(guān)閉光，開啟熒光通道，觀察熒光強度，判定感染率。圖片取樣前可以調(diào)節(jié)曝光時間，增益值和彩色度使熒光照片最完美。（針對leica）5.4注意事項內(nèi)容1.病毒濃度要適宜，太少的話細胞被感染的也少，但是病毒濃度太大，對細胞有傷害。2.感染病毒時培養(yǎng)基量少，以保證病毒的濃度，在培養(yǎng)10h左右可根據(jù)培養(yǎng)基顏色加培養(yǎng)基。3.在不明確細胞感染復(fù)數(shù)情況下，可進行濃度梯度感染，計算細胞感染復(fù)數(shù)。4.在加病毒后一般24h左右可換液，48小時即可看熒光，具體時間根據(jù)細胞狀態(tài)來看。6、感

17、染后的細胞檢測方法6.1熒光初步檢測若有熒光，則表示病毒感染成功，但并不能確定目的基因是否整合到細胞中，待進一步檢測，熒光有強弱之分，與病毒加入的量有關(guān)。6.2RNA的提取及RT-PCR檢測6.2.1原理因為真核細胞DNA含有很多非編碼區(qū)，真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA之后，經(jīng)過剪切和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才能形成真正的mRNA，是否表達真核生物的基因并表達相應(yīng)的蛋白，只能通過提取其mRNA并RT-PCR這條途徑來測定6.2.2RNA提取步驟加1mlTrizol，吹打后移至1.5ml無菌的離心管中；加100ul氯仿劇烈振蕩30s混勻，12000轉(zhuǎn)15min，可看到明顯分層；取上層透明液體至新

18、的1.5ml離心管中，加等體積的異丙醇，混勻靜置10min，12000轉(zhuǎn)離心10min，棄上清，加1ml70%乙醇，12000轉(zhuǎn)，離心10min，棄上清，風干剩余液體，最后加DEPC-水溶解RNA，電泳，粗步判定RNA純度。6.2.3RT-PCR步驟：RT是一個逆轉(zhuǎn)錄的過程，用前一天提取好的總RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR儀的溫度設(shè)置下，RNA可逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下進行復(fù)制成雙鏈DNA。（具體步驟省略）6.3蛋白提取及Western檢測western-Bloting：蛋白免疫印跡（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學檢測三個部分組成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。 第