HPLC法測定阿司匹林中游離水楊酸含量-PowerPoi

1、HPLC法測定阿司法測定阿司匹林中游離水楊匹林中游離水楊酸含量酸含量 戴云堅戴云堅 殷煒銘殷煒銘 邵加安邵加安 陳鐵剛陳鐵剛背景背景v阿司匹林是一非甾體類解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕藥物。在其生產(chǎn)過程中乙?；煌耆騼Σ剡^程中水解產(chǎn)生的水楊酸對人體有毒性.因此有必要對阿司匹林中的水楊酸進(jìn)行限量和含量的測定。中國藥典一直沿用對照品化學(xué)反應(yīng)目視比色法判斷結(jié)果，此方法當(dāng)對照品溶液與供試品溶液顏色相近時易造成判定誤差。此次實驗設(shè)計HPLC法檢查阿司匹林中的水楊酸。實驗儀器及試藥實驗儀器及試藥儀器儀器 agilent高效液相色譜儀高效液相色譜儀, ,島津島津LC-10A(LC-10A(單泵單泵) )高高效液相

2、色譜儀；量筒效液相色譜儀；量筒, ,移液管，容量瓶移液管，容量瓶。試藥試藥 阿司匹林樣品、阿司匹林樣品、 水楊酸對照品、冰醋酸、水楊酸對照品、冰醋酸、無水甲醇、超純水。無水甲醇、超純水。實驗方法實驗方法色譜條件色譜條件 色譜柱：色譜柱：C18C18色譜柱（色譜柱（4.6X150mm4.6X150mm）；流動相：）；流動相：1%1%冰醋酸冰醋酸- -甲醇甲醇(50(50：50)(50)(組組1),1),甲醇：水：冰醋甲醇：水：冰醋酸酸(8(8：4 4：1)(1)(組組2)2) ；檢測波長：；檢測波長：300nm300nm；流速：；流速：0.8ml0.8mlminmin-1-1；柱溫：室溫；柱溫：

3、室溫 溶液的配制溶液的配制水楊酸對照品溶液水楊酸對照品溶液：水楊酸對照品水楊酸對照品0 01g1g100mL100mL量瓶量瓶取此液取此液1.0ml1.0ml100mL100mL量瓶量瓶10g/mol10g/mol阿司匹林樣品溶液：阿司匹林樣品溶液：阿司匹林對照品阿司匹林對照品0.1g0.1g100mL100mL量瓶量瓶1mg/mo1mg/moL組組2: 2: 冰醋酸：甲醇（冰醋酸：甲醇（1 1：1010）組組1: 1%1: 1%冰醋酸冰醋酸- -甲醇甲醇(50(50：50)50)系統(tǒng)適應(yīng)性系統(tǒng)適應(yīng)性 v水楊酸及阿司匹林的高效液相分離圖譜及保留時間的確定: 分別取水楊酸對照品溶液、阿司匹林供試

4、品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。組1組2水楊酸精密度試驗水楊酸精密度試驗按溶液配置中的方法配置水楊酸對照品溶液，從按溶液配置中的方法配置水楊酸對照品溶液，從溶液配置到進(jìn)樣，重復(fù)溶液配置到進(jìn)樣，重復(fù)6次，計算水楊酸峰積分面次，計算水楊酸峰積分面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差（積的相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD5%）。）。最低檢出限試驗最低檢出限試驗( (組組1)1)精密吸取水楊酸對照品溶液，用流動相逐級進(jìn)行精密吸取水楊酸對照品溶液，用流動相逐級進(jìn)行稀釋。當(dāng)記錄的色譜圖中信噪比為稀釋。當(dāng)記錄的色譜圖中信噪比為1010：1 1時。確時。確定水楊酸的定量限，信噪比為定水楊酸的定量限，信噪比為3 3：1 1時確定檢

5、測限時確定檢測限。噪音信號為。噪音信號為2.1ng/ml2.1ng/ml，檢測限為，檢測限為6.3ng/ml6.3ng/ml。 進(jìn)樣進(jìn)樣 峰面積峰面積峰面積峰面積/ /濃度濃度平均（峰面平均（峰面積積/ /濃度）濃度） RSDRSD（% %） 1 1801746.8801746.880174.6880174.6880515.880515.80.380.38 2 2802056.1802056.180205.6180205.61 3 3807673.3807673.380767.3380767.33 4 4804326.7804326.780432.6780432.67 5 5805846.98

6、05846.980584.6980584.69 6 6809299.3809299.380929.9380929.93 進(jìn)樣進(jìn)樣 濃度濃度（g/mlg/ml） 峰面積峰面積峰面積峰面積/ /濃度濃度 平均（峰面平均（峰面積積/ /濃度）濃度） RSDRSD（% %） 1 19.849.84352.25934352.2593435.8035.8035.36535.3650.820.82 2 29.899.89352.25226352.2522635.6235.62 3 310.0510.05352.83932352.8393235.1235.12 4 410.0510.05352.6987635

7、2.6987635.0935.09 5 510.0710.07352.64520352.6452035.2035.20 6 69.979.97352.55164352.5516435.3635.36組：組：水楊酸精密度試驗結(jié)果表水楊酸精密度試驗結(jié)果表組：組：水楊酸精密度試驗結(jié)果表水楊酸精密度試驗結(jié)果表水楊酸的線性試驗水楊酸的線性試驗配制不同濃度的水楊酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取20l依次注入液相色譜儀，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得水楊酸回歸方程。組：4、6、10 、 16 、 20g/ml組：1.5 、 3 、 6 、 9 、 15 、 24 、 30g/ml組1組2回收率試驗

8、回收率試驗100ml100ml量瓶量瓶加入阿司匹林加入阿司匹林50mg50mg（組）（組）100mg(組）0.5mL0.5mL濃度為濃度為1mg/mL1mg/mL的水楊酸溶液的水楊酸溶液/ /5.0ml濃度為10ug/mL的水楊酸溶液稀釋稀釋進(jìn)樣進(jìn)樣20l20l計算平均回收率計算平均回收率1.0mL1.0mL濃度為濃度為1mg/mL1mg/mL的水楊酸溶液的水楊酸溶液/ /15.0ml濃度為10ug/mL的水楊酸溶液1.5mL1.5mL濃度為濃度為1mg/mL1mg/mL的水楊酸溶液的水楊酸溶液/ /25.0ml濃度為10ug/mL的水楊酸溶液組：回收率試驗結(jié)果組：回收率試驗結(jié)果組別組別加 入

9、 阿 司加 入 阿 司匹林量匹林量（mgmg）加 入 水 楊加 入 水 楊酸量酸量(mg) (mg) 水 楊 酸 理水 楊 酸 理論 總 加 入論 總 加 入量量(mg)(mg)實 際 所 測實 際 所 測水 楊 酸 量水 楊 酸 量(g)(g)回收率回收率(%)(%)1 149.549.50.49650.49650.713310.713310.657000.6570092.192.12 251.051.00.9930.9931.216381.216381.310511.31051107.8107.83 349.649.61.48951.48951.706751.706751.885651.8

10、8565110.5110.5組：回收率試驗結(jié)果組：回收率試驗結(jié)果加入阿加入阿司匹林司匹林量量(mg)(mg)樣品含樣品含水楊酸水楊酸量量(mg)(mg)加入水加入水楊酸量楊酸量(mg)(mg)測得量測得量(mg)(mg)回收率回收率(%)(%)平均回平均回收率收率(%)(%) RSD(%)RSD(%)104.7104.70.0937070.0937070.050.050.154245 0.154245 107.33 107.33 105.47105.471.491.49108.2108.20.0968390.0968390.050.050.155000 0.155000 105.56 105.

11、56 101.6101.60.0909320.0909320.150.150.257745 0.257745 106.98 106.98 104.4104.40.0934380.0934380.150.150.256579 0.256579 105.40 105.40 104.3104.30.0933490.0933490.250.250.358701 0.358701 104.47 104.47 103.5103.50.0926330.0926330.250.250.353236 0.353236 103.09 103.09 穩(wěn)定性試驗穩(wěn)定性試驗 配制阿司匹林供試品溶液，分別在配制阿司匹林供

12、試品溶液，分別在0 0、7 7、1414、2121、2828、35 35 、 42分鐘時依法測定。得水楊酸一組峰積分面積，觀分鐘時依法測定。得水楊酸一組峰積分面積，觀察峰面積的變化率，得到試驗溶液的穩(wěn)定時間范圍。察峰面積的變化率，得到試驗溶液的穩(wěn)定時間范圍。時間（時間（minmin）0 07 71414212128283535峰面積峰面積119.46119.46167.03167.03 208.82208.82 250.36250.36 305.76305.76345.91345.91時間（時間（minmin）0 07 714142121282835354242峰面積峰面積205196.220

13、5196.2209214.3209214.3230418.9230418.9250668.4250668.4288797.7288797.7320371.5320371.5351414.4351414.4組：組：穩(wěn)定性試驗結(jié)果表穩(wěn)定性試驗結(jié)果表組：組：穩(wěn)定性試驗結(jié)果表穩(wěn)定性試驗結(jié)果表水楊酸峰面積與時間的變化率（豎軸為峰面積，橫軸為時間）水楊酸峰面積與時間的變化率（豎軸為峰面積，橫軸為時間）組1組2水楊酸峰面積與時間的變化率（豎軸為峰面積，橫軸為時間）水楊酸峰面積與時間的變化率（豎軸為峰面積，橫軸為時間）外標(biāo)法測定阿司匹林中水楊酸含量外標(biāo)法測定阿司匹林中水楊酸含量 水楊酸對照品水楊酸對照品0.1

14、g0.1g100mL100mL量瓶量瓶精密吸取精密吸取1.0mL1.0mL100mL100mL量瓶量瓶對照品溶液對照品溶液( (10ug/ml)記錄色譜圖記錄色譜圖20L阿司匹林阿司匹林0.1g0.1g100mL100mL量瓶量瓶濾膜過濾濾膜過濾供試品溶液供試品溶液(1mg/ml)(1mg/ml)20L記錄色譜圖記錄色譜圖組別組別/ /峰面積峰面積水楊酸平均峰水楊酸平均峰面積面積樣品濃度樣品濃度（mg/mlmg/ml）水楊酸含量水楊酸含量阿司匹林樣品阿司匹林樣品1 13476.530033476.530031.0091.0098.809%8.809%阿司匹林樣品阿司匹林樣品2 2165.103

15、01165.103010.9840.9840.326%0.326%組1:外標(biāo)法測定阿司匹林中水楊酸含量外標(biāo)法測定阿司匹林中水楊酸含量 水楊酸對照品水楊酸對照品10mg10mg100mL100mL量瓶量瓶精密吸取精密吸取3.0mL3.0mL100mL100mL量瓶量瓶對照品溶液對照品溶液( (3ug/ml)記錄色譜圖記錄色譜圖20L阿司匹林阿司匹林0.15g0.15g50mL50mL量瓶量瓶濾膜過濾濾膜過濾供試品溶液供試品溶液(3mg/ml)(3mg/ml)20L記錄色譜圖記錄色譜圖溶液溶液峰面積峰面積水楊酸濃度水楊酸濃度（ug/ml)ug/ml)水楊酸含水楊酸含量量1 12 2平均值平均值供試

16、品供試品205196.2205196.2209214.3209214.3207205.3207205.32.6852.6850.09%0.09%對照品對照品231913.1231913.1231125.6231125.6231519.4231519.43.000 3.000 組2:.流動相的選擇 本實驗兩個流動相相比較, 1%冰醋酸-甲醇(50：50)(組1）理論塔板數(shù)與分離度教好，甲醇：水：冰醋酸(8：4：1)(組2)對稱性較好，但有雜峰。.組所用儀器沒有信噪比參數(shù)，所以沒有確定檢測限。.從分子結(jié)構(gòu)上分析水楊酸中含有羥基和羧酸，而阿司匹林中僅含有一個羧酸且有酯的結(jié)構(gòu)，但從色譜分析中，阿司匹林

17、的保留時間卻小于水楊酸的，就其原因可能是因為水楊酸的分子內(nèi)間氫鍵大大減小了它的極性所致。討論討論.在做樣品的穩(wěn)定性實驗時，發(fā)現(xiàn)阿司匹林的穩(wěn)定性都不好，特別是組1阿司匹林的水解率很大，且隨時間變化呈一定的線性關(guān)系，原因可能有以下幾方面：一是溶液配置過程太長，導(dǎo)致水解發(fā)生；二是所配溶劑酸性控制不好，導(dǎo)致了阿司匹林的水解。由實驗可知用冰醋酸：甲醇(1：10) (pH值約為24） 做溶劑相比1%冰醋酸-甲醇(50：50)可一定程度抑制阿司匹林水解 解決方法解決方法:一.在實驗過程中確定阿司匹林的有效穩(wěn)定時間，在這段時間內(nèi)進(jìn)行水楊酸含量的測定。 二.改用其他溶劑,像乙腈一甲酸(99:1)溶液作為本方法測定溶劑.檢測波長的選擇