microRNA 技術(shù)

1、miRNA技術(shù)詳述摘要 : miRNAs是一類(lèi)重要的內(nèi)源性小的非編碼RNA分子，大約由21-25個(gè)核苷酸組成。miRNA通常靶向一個(gè)或者多個(gè)mRNA，通過(guò)抑制翻譯或降解靶標(biāo)mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。人類(lèi)基因組中大約存在超過(guò)1000條miRNA，其在多種人體細(xì)胞類(lèi)型中大量表達(dá)，估計(jì)其調(diào)節(jié)超過(guò)60%的哺乳動(dòng)物基因。引述精準(zhǔn)的基因表達(dá)調(diào)控對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育和功能至關(guān)重要。過(guò)去對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面(激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄)。而RNA一度被認(rèn)為是DNA和蛋白質(zhì)之間的“過(guò)渡”，但越來(lái)越多的證據(jù)清楚的表明RNA在生命的進(jìn)程中扮演的角色遠(yuǎn)比早前的設(shè)想重要，晚近發(fā)現(xiàn)一系列小

2、分子非編碼RNA(small noncoding RNA)，包括miRNA (micrornA)，siRNA (small interfering RNA)，piRNA (piwi-interacting RNA)和esiRNA (endogenous siRNA)等，這些小RNA組成了RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后及表觀(guān)遺傳等水平控制基因的表達(dá)，參與調(diào)控包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等進(jìn)程，影響著生物體的生長(zhǎng)發(fā)育和多種病理過(guò)程。小RNA的發(fā)現(xiàn)也揭示了真核生物全新的基因表達(dá)調(diào)控方式。miRNAs是一類(lèi)重要的內(nèi)源性小的非編碼rna分子，大約由21-25個(gè)核苷酸組成。miRNA通常靶向一個(gè)或者多個(gè)m

3、RNA，通過(guò)抑制翻譯或降解靶標(biāo)mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。人類(lèi)基因組中大約存在超過(guò)1000條miRNA，其在多種人體細(xì)胞類(lèi)型中大量表達(dá)，估計(jì)其調(diào)節(jié)超過(guò)60%的哺乳動(dòng)物基因。miRNA在植物界和后生動(dòng)物界間表現(xiàn)不同的特性。在植物中，miRNA與其靶基因通過(guò)近乎完美互補(bǔ)的方式相結(jié)合;而在后生動(dòng)物中，經(jīng)常是一條miRNA可以和靶基因的多個(gè)位點(diǎn)相結(jié)合，或是一條miRNA調(diào)節(jié)多種靶基因。另外,在后生生物中，miRNA靶位點(diǎn)位于mRNA的3UTR，而在植物中，miRNA靶位點(diǎn)可以位于3 UTR，更多情況下是位于mRNA的編碼區(qū)內(nèi)。第一個(gè)miRNA在上世紀(jì)九十年代被發(fā)現(xiàn)，直到本世紀(jì)初才認(rèn)識(shí)到這是一類(lèi)在功能上

4、保守的生物調(diào)節(jié)因子。在此時(shí)起，miRNA研究揭示其存在不同基因表達(dá)負(fù)調(diào)控形式，包括轉(zhuǎn)錄本降解和扣留(sequestering)，翻譯抑制等，并可能參與了對(duì)基因表達(dá)的正調(diào)控(轉(zhuǎn)錄和翻譯活化作用)。總之，在不同形式的細(xì)胞和組織類(lèi)型中發(fā)現(xiàn)了不同的miRNA表達(dá)形式，miRNA可能參與了多數(shù)生理過(guò)程;并且在多種病理狀態(tài)下，miRNA呈現(xiàn)異常表達(dá)，這些異常表達(dá)miRNA在疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮了重要作用，當(dāng)前，基于miRNA的治療方式研究當(dāng)前正在進(jìn)行中。miRNA的發(fā)現(xiàn)歷史miRNA是由Victor Ambros, Rosalind Lee和Rhonda Feinbaum等人在研究lin-14基因在

5、調(diào)節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育中作用時(shí)發(fā)現(xiàn)的。他們發(fā)現(xiàn)LIN-14蛋白豐度受到一個(gè)由lin-4編碼的短RNA產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，來(lái)自lin-4基因的61個(gè)核苷酸前體生成一個(gè)22個(gè)核苷酸的RNA，該RNA含有與lin-14 mRNA 3 UTR部分互補(bǔ)的序列。這種互補(bǔ)特性為抑制lin-14翻譯生成LIN-14蛋白的充分必要元件。然而在當(dāng)時(shí)，lin-4卻被認(rèn)為是線(xiàn)蟲(chóng)中特有的現(xiàn)象而被忽視。直到2000年，第二個(gè)小rna let-7被發(fā)現(xiàn)，let-7可以抑制lin-41, lin-14, lin-28, lin-42和daf-12等在發(fā)育轉(zhuǎn)型中發(fā)揮重要作用基因的翻譯。很快又發(fā)現(xiàn)let-7在多個(gè)物種間保守存在，表明在更廣泛的生物

6、物種中存在這種調(diào)節(jié)。miRNA的命名術(shù)語(yǔ)當(dāng)前，發(fā)展了一套標(biāo)準(zhǔn)的miRNA命名系統(tǒng)，前綴mir后緊跟“-”和相應(yīng)數(shù)字，數(shù)字通常顯示名字的先后次序。而小寫(xiě)的mir-指pre-miRNA，如果使用大寫(xiě)的miR-則指成熟的miRNA。對(duì)于差別只有一到兩個(gè)核苷酸的近似相同的miRNA，在命名時(shí)通常另外添加一個(gè)小寫(xiě)字母，例如miR-200a和miR-200b。為了區(qū)分物種來(lái)源，通常在miRNA的前面加上三個(gè)字母組成的前綴，如人源性的使用has，而綿羊(Ovis aries)來(lái)源的使用oar，其他如v表示來(lái)自病毒基因組，D表示果蠅源性的等。如果定位于不同基因組位置的前體miRNA可以生成完全一致的成熟miR

7、NA，則通常使用外加的“-”加數(shù)字后綴來(lái)區(qū)別這種情況，例如hsa-mir-194-1和hsa-mir-194-2位于基因組的不同位置，而剪切生成相同的成熟miRNA序列hsa-miR-194。當(dāng)兩個(gè)成熟的miRNA來(lái)自于相同的前體miRNA的相反的兩個(gè)臂，則使用“-3p”和“-5p”后綴(過(guò)去曾使用s和as表示，分別來(lái)自sense和antisense)。當(dāng)相對(duì)表達(dá)水平已知時(shí)，通常使用星號(hào)表示該miRNA在表達(dá)水平上較其對(duì)應(yīng)的反向臂miRNA低。例如miR-31和miR-31*分別來(lái)自于同一前體miRNA的兩對(duì)應(yīng)臂，且miR-31為主要存在形式。miRNA的生物起源約40%的miRNA基因位于蛋

8、白的內(nèi)含子中或是不編碼蛋白的基因序列中，甚至位于外顯子中。雖有例外，它們通常呈正向分布。因此，它們多數(shù)與其宿主基因一起受到調(diào)節(jié)。另有42-48% miRNA基因呈多順?lè)醋有问脚挪?，雖然這并不表示這成簇分布的miRNA在結(jié)構(gòu)和功能上存在相似性，但它們共用一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，由2-7個(gè)不同的環(huán)結(jié)構(gòu)經(jīng)剪切加工而來(lái)。其啟動(dòng)子在模序結(jié)構(gòu)上與由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的其它啟動(dòng)子，如編碼功能蛋白基因的啟動(dòng)子相似。DNA模版并不是成熟miRNA的最終形式，部分人類(lèi)miRNA存在RNA剪輯，位點(diǎn)特異的RNA序列修飾導(dǎo)致其產(chǎn)物和DNA模版不一致，從而增加了miRNA的多樣性，超出了基因組模版的數(shù)量范圍。miRNA的轉(zhuǎn)錄

9、miRNA通常由RNA聚合酶II (Pol II)轉(zhuǎn)錄生成。Pol II結(jié)合在以后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸環(huán)DNA序列附近。生成的轉(zhuǎn)錄本經(jīng)修飾添加5帽子結(jié)構(gòu)和3末端多腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)，并剪切，生成的產(chǎn)物稱(chēng)為初級(jí)miRNA (pri-miRNA)，該產(chǎn)物可能長(zhǎng)達(dá)數(shù)千或數(shù)百核苷酸，可能包含多個(gè)miRNA環(huán)結(jié)構(gòu)。RNA聚合酶III (Pol III)轉(zhuǎn)錄生成部分miRNA，尤其是上游為Alu序列，tRNAs和哺乳動(dòng)物廣泛散步重復(fù)(mammalian wide interspersed repeat (MWIR)啟動(dòng)子單元的miRNA。miRNA的核內(nèi)處理過(guò)程單個(gè)pri-miRNA可能含一到六個(gè)miRNA前體。

10、這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)每個(gè)由約70 nt左右的核苷酸組成。每個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)附以部分序列以利于有效剪切處理。pri-miRNA中的雙鏈發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)被叫做DGCR8的核蛋白(DiGeorge Syndrome Critical Region 8，該蛋白與DiGeorge綜合癥關(guān)系密切，在非脊椎動(dòng)物中稱(chēng)為"Pasha")辨認(rèn)，DGCR8同Drosha酶一起形成微處理(microprocessor)復(fù)合體。在該復(fù)合體中，DGCR8組織Drosha蛋白的RNase III結(jié)構(gòu)域使其在距離發(fā)卡結(jié)構(gòu)約11個(gè)核苷酸處切割pri-miRNA，使其釋放發(fā)卡結(jié)構(gòu)。釋放的發(fā)卡結(jié)構(gòu)即為前miRNA(pre-mi

11、RNA), pre-miRNA在3存在兩個(gè)懸空的核苷酸，pre-miRNA 5為磷酸集團(tuán)，3為羥基集團(tuán)。在果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)中存在由內(nèi)含子直接剪切產(chǎn)生的pre-miRNA，并不經(jīng)過(guò)微處理復(fù)合體過(guò)程，這種miRNA稱(chēng)為mirtrons。部分pre-miRNA可發(fā)生核RNA剪輯。多數(shù)情況下，作用于RNA的腺苷酸脫胺酶(adenosine deaminases acting on RNA, ADAR)催化腺苷酸生成次黃嘌呤核苷(inosine)，RNA剪輯能夠阻礙核內(nèi)處理過(guò)程(例如導(dǎo)致pri-miR-142被核糖體酶Tudor-SN降解)，并改變下游處理過(guò)程，包括在胞漿的miRNA處理和靶向特異性(如在中樞

12、神經(jīng)系統(tǒng)中改變miR-376種子區(qū)序列)。miRNA的細(xì)胞核輸出Pre-miRNA發(fā)卡通過(guò)Exportin-5蛋白的核胞漿穿梭完成從核輸出到胞漿過(guò)程。Exportin-5蛋白為karyopherin家族蛋白成員，該蛋白通過(guò)辨認(rèn)Drosha RNase III酶切割留下來(lái)的3兩個(gè)懸空的核苷酸，介導(dǎo)pre-miRNA的輸出，該過(guò)程由GTP提供能量完成。miRNA的胞漿處理過(guò)程在胞漿中，pre-miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)經(jīng)RNase III Dicer切割處理。這種內(nèi)源性核糖核酸酶(endoribonuclease)與發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3相互作用并在環(huán)的3和5臂上完成切割，產(chǎn)生長(zhǎng)約22 nt并不完美匹配的miRNA

13、:miRNA*雙鏈結(jié)構(gòu)。不但發(fā)夾結(jié)構(gòu)和頸環(huán)的大小影響了Dicer酶切割效率，miRNA:miRNA*雙鏈結(jié)構(gòu)的不完全匹配特性也影響了Dicer酶的切割效率。雖然雙鏈結(jié)構(gòu)中的任何一條都可能成為功能miRNA，但是通常只一鏈可能進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)，在RISC中與其相應(yīng)靶基因mRNA發(fā)生相互作用。miRNA在植物中的生成情況(Biogenesis)miRNA在植物中的生成過(guò)程與在后生動(dòng)物中不同，區(qū)別主要在核處理和輸出過(guò)程上。與后生動(dòng)物在核和胞漿中由兩種不同的酶切割不同，在植物中，由Dicer酶的同源基因Dicer樣酶1

14、(Dicer-like1, DL1)完成切割處理過(guò)程。DL1只在植物細(xì)胞核中表達(dá)，表明兩種反應(yīng)都發(fā)生在核內(nèi)。植物miRNA:miRNA*雙鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)出核前，其3突出序列經(jīng)RNA甲基化轉(zhuǎn)移蛋白Hua-Enhancer1 (HEN1)甲基化修飾。而后此雙鏈結(jié)構(gòu)被Hasty (HST)由核輸出至胞漿，在胞漿中解離生成成熟的miRNA，進(jìn)入RISC。Hasty蛋白即為后生動(dòng)物中Exportin 5蛋白的同源蛋白。RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)除了包括成熟的miRNA外，還包含Dicer蛋白和多種其它相關(guān)蛋白。RISC也被稱(chēng)為microRNA核酸蛋白復(fù)合體(microRNA r

15、ibonucleoprotein complex, miRNP)，摻入RISC的miRNA也被稱(chēng)為miRISC?，F(xiàn)在認(rèn)為Dicer對(duì)pre-miRNA的處理與雙鏈螺旋的解旋是偶聯(lián)在一起的。通常情況下只有一條鏈進(jìn)入miRISC，對(duì)雙鏈中某一條鏈的偏好選擇基于相對(duì)另一條鏈的熱動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性和更差的堿基配對(duì)能力。頸環(huán)的位置可能也影響了摻入鏈的選擇性。不進(jìn)入RISC的鏈被稱(chēng)為passenger鏈，其miRNA被冠以星號(hào)(*)，具有更低的穩(wěn)定性，通常情況下被降解掉。在某些情況下，兩條鏈都具有活性，成為針對(duì)不同靶基因mRNA的功能miRNA。Argonaute (Ago)蛋白成員在RISC功能中處于中心地

16、位，該類(lèi)蛋白為miRNA誘導(dǎo)的基因沉默的必需組分，其含有兩個(gè)保守的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PAZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合成熟miRNA的3序列，PIWI結(jié)構(gòu)域組裝核酶H (ribonuclease-H)，并與導(dǎo)引鏈(miRNA)5端結(jié)合。Ago蛋白與成熟miRNA結(jié)合使其正確朝向，以便對(duì)靶基因mRNA完成切割。一些Ago蛋白，例如人Ago2，直接切割靶轉(zhuǎn)錄本;另外，Ago蛋白也可能招募其它蛋白行使翻譯抑制功能。在人類(lèi)基因組中含有8個(gè)Argonaute蛋白，根據(jù)序列相似性分為兩個(gè)家族：AGO和PIWI。AGO蛋白有4個(gè)成員，存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，在人類(lèi)這類(lèi)蛋白稱(chēng)為E1F2C/hAgo;PIWI存在于精細(xì)胞和造血

17、干細(xì)胞中。RISC的其它組成成分還包括TRBP human immunodeficiency virus (HIV) transactivating response RNA (TAR) binding protein，PACT (protein activator of the interferon induced protein kinase (PACT),SMN復(fù)合體，脆性X智障蛋白(fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)和Tudor-SN (Tudor staphylococcal nuclease-domain-containing pr

18、otein)等。miRNA介導(dǎo)的基因沉默模式miRNA與靶mRNA的典型作用方式主要有兩種。在大多數(shù)情況下，復(fù)合物中的單鏈miRNA與靶mRNA的3 UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)，阻斷靶基因的翻譯，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這種方式主要影響蛋白表達(dá)水平，并不影響mRNA的穩(wěn)定性。近來(lái)，有研究對(duì)翻譯抑制理論提出質(zhì)疑，發(fā)現(xiàn)被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞漿中被稱(chēng)為P小體(processing bodies，P-bodies)的區(qū)域，這個(gè)區(qū)域還濃縮了許多參與mRNA降解的酶類(lèi)。P小體可能是作為未翻譯mRNA進(jìn)行暫時(shí)的可逆儲(chǔ)存的容器，減少一些特定P小體組成蛋白的表達(dá)能夠緩和miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制作

19、用。P小體是胞漿中的一定區(qū)域，它包含參與多種轉(zhuǎn)錄后過(guò)程的蛋白質(zhì)，例如：mRNA降解(mRNA degradation)、無(wú)義介導(dǎo)mRNA衰退(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)，轉(zhuǎn)錄抑制及RNA介導(dǎo)的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)。另一種作用方式與siRNA類(lèi)似，當(dāng)miRNA與mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，Ago2蛋白通過(guò)切割mRNA直接導(dǎo)致其降解，實(shí)現(xiàn)基因沉默。以siRNA參與的RNAi為例：siRNA可與RISC結(jié)合，作為模板識(shí)別mRNA靶子，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，mRNA與siRNA中的反義鏈結(jié)合，置換出正義鏈。雙鏈mRNA

20、在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下產(chǎn)生22 nt左右的siRNA，siRNA繼續(xù)同RISC形成復(fù)合體，與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，使mRNA被RNA酶裂解。這個(gè)過(guò)程也稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)?？傊?dāng)前認(rèn)為miRNA以何種方式與目的基因作用和miRNA與目的基因的配對(duì)程度有關(guān)。miRNA與目的基因配對(duì)不完全時(shí)，miRNA就以抑制目的基因的表達(dá)發(fā)揮作用;miRNA與目的基因某段序列配對(duì)完全時(shí)，就可能引起目的基因在互補(bǔ)區(qū)斷裂而導(dǎo)致基因沉默。另外，miRNAs有時(shí)候也導(dǎo)致組氨酸修飾和啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化，從而影響靶基因的表達(dá)。除此外，近來(lái)發(fā)現(xiàn)快速脫腺苷酸化(accelerated

21、deadenylation)是miRNA抑制基因表達(dá)的新機(jī)制。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-125b和let-7能夠促進(jìn)mRNA聚腺苷酸尾巴(polyA tail)的去除。用3組蛋白莖-環(huán)結(jié)構(gòu)取代聚腺苷酸尾巴，不但可以消除miR-125b對(duì)mRNA含量的影響，還可以降低對(duì)蛋白質(zhì)合成的作用，可見(jiàn)miRNA能通過(guò)降低翻譯效率和聚腺苷酸化mRNA的濃度來(lái)抑制基因表達(dá)。miRNA的翻譯起始抑制目前對(duì)miRNA翻譯起始抑制機(jī)制主要有如下幾種觀(guān)點(diǎn)：認(rèn)為miRNA可能通過(guò)抑制全能性核糖體的組裝而阻斷翻譯起始。EIF6是一種可以抑制核糖體40S和60S亞基結(jié)合、阻斷80S全能性核糖體形成的蛋白，EIF6與Ago

22、/RISC直接相互作用，并且在哺乳動(dòng)物和線(xiàn)蟲(chóng)中，缺失EIF6影響miRNA介導(dǎo)基因沉默。然而，RISC是否通過(guò)與EIF6相互作用誘導(dǎo)40S和60S核糖體解聚還有待于進(jìn)一步的研究。第二種觀(guān)點(diǎn)根據(jù)miRNA抑制要求靶mRNA m7G帽子的存在，認(rèn)為miRISC可能抑制翻譯起始復(fù)合物的形成。研究發(fā)現(xiàn)，增加體外系統(tǒng)中eIF4F復(fù)合物(含有m7G帽子結(jié)合蛋白、翻譯起始因子eIF4E)水平可回復(fù)miRNA翻譯抑制;另一個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，Ago2中間結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合m7G帽子的活性，Ago2經(jīng)miRNA招募到靶mRNA 3 UTR，與起始復(fù)合物eIF4E/G競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合m7G帽子，抑制翻譯起始復(fù)合物的形成。第三種觀(guān)點(diǎn)

23、認(rèn)為miRNA可能通過(guò)阻止polyA結(jié)合蛋白polyA binding protein (PABP)與mRNA結(jié)合影響翻譯起始。miRNA引起靶mRNA脫腺嘌呤反應(yīng)，導(dǎo)致RNA的polyA尾巴縮短，使PABP結(jié)合mRNA受阻，從而影響翻譯起始。miRNA翻譯起始后抑制研究發(fā)現(xiàn)一些被miRNA抑制的mRNA與翻譯活躍的多核糖體偶聯(lián)，說(shuō)明這些miRNA的抑制作用不是發(fā)生在翻譯起始水平。此外，經(jīng)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site, IRES)起始、不依賴(lài)于mRNA m7G帽子的翻譯過(guò)程也可以被miRNA抑制，證明miRNA抑制發(fā)生在翻譯起始之后。雖然有如上證

24、據(jù)，但是關(guān)于miRNA究竟如何在翻譯起始后發(fā)揮抑制作用，目前還沒(méi)有一致的結(jié)論。有研究者推測(cè)miRNA可能引起新生多肽鏈的翻譯同步降解，或者是在翻譯延伸過(guò)程中，miRNA能引發(fā)翻譯提前終止。miRNA介導(dǎo)mRNA衰減miRNA可以誘導(dǎo)與之不完全配對(duì)靶mRNA衰減，下調(diào)靶mRNA的水平。發(fā)現(xiàn)Ago蛋白定位于降解mRNA的RNA顆粒(RNA granules)，如P小體中，這些RNA顆粒中包含mRNA降解酶，提示這些mRNA降解酶可能參與miRNA介導(dǎo)的mRNA衰減。此外，miRISC的核心成分Ago家族蛋白有多種異構(gòu)體，其中一些成員的內(nèi)切酶活性也可能協(xié)助miRNA介導(dǎo)的mRNA切割或衰減。這些證據(jù)

25、支持miRNA可以直接或間接介導(dǎo)靶mRNA的降解。RNA顆?？垩?、降解或儲(chǔ)存靶mRNA胞漿的RNA顆粒，如P小體和SG(Stress Granules)顆粒，是細(xì)胞儲(chǔ)存處于翻譯抑制狀態(tài)mRNA的場(chǎng)所，在此，mRNA被降解或/和釋放重新進(jìn)入翻譯機(jī)器，在轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控中具有重要的作用。P小體被認(rèn)為是細(xì)胞mRNA代謝場(chǎng)所;SG顆粒因特異性地在受脅迫條件下形成而得名，P小體和SG顆?？赡苁莔iRNA胞內(nèi)發(fā)揮作用的重要場(chǎng)所：在miRNA存在下，miRISC中的核心組分及與miRISC結(jié)合的mRNA定位于P小體和SG顆粒中;抑制P小體的形成可抑制miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制，抑制RISC也同樣抑制P

26、小體的形成。推測(cè)被miRISC結(jié)合的mRNA進(jìn)入P小體和SG顆粒中，RNA顆粒的翻譯抑制子使mRNA處于翻譯抑制狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默，靶mRNA被扣押后隨即進(jìn)行一個(gè)mRNA衰減或儲(chǔ)存的分揀步驟，P小體和SG顆?？赡芊止?zhí)行mRNA降解和暫時(shí)儲(chǔ)存功能。miRNA正調(diào)控和去抑制最近的研究發(fā)現(xiàn)了一些新型的miRNA作用方式，如miRNA正調(diào)控和去抑制作用等。miRNA不總是基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，在一些條件下，miRNA上調(diào)基因表達(dá)。在細(xì)胞周期過(guò)程中，miRNA效應(yīng)在抑制和活化作用間擺動(dòng)，在G0期細(xì)胞中，miRNA活化翻譯上調(diào)基因表達(dá)，而在其它時(shí)期發(fā)揮抑制作用。另外還發(fā)現(xiàn)一些增殖細(xì)胞中表達(dá)的mRNA

27、 3 UTR保守性地縮短，導(dǎo)致miRNA的靶位點(diǎn)減少，從而避免miRNA負(fù)調(diào)控作用。miRNA的周期(turnover)miRNA需要快速實(shí)現(xiàn)周期輪轉(zhuǎn)以滿(mǎn)足miRNA表達(dá)譜快速改變的需求。當(dāng)miRNA在胞漿中成熟時(shí)，Argonaute蛋白結(jié)合miRNA過(guò)程普遍被認(rèn)為具有穩(wěn)定引導(dǎo)鏈的作用，而同時(shí)互補(bǔ)的passenger鏈被降解消除。argonaute蛋白傾向于保留下可以調(diào)控大量靶基因的miRNAs，而清除靶向基因較少和沒(méi)有任何靶基因的miRNA。在動(dòng)物中，成熟miRNA的衰減由5-3外切核酸酶XRB2(又稱(chēng)為Rat1p)負(fù)責(zé)，在植物體內(nèi)由SDN (small RNA degrading nucl

28、ease)家族成員來(lái)執(zhí)行此功能，但方向相反(3'-5')，在動(dòng)物基因組內(nèi)也編碼與植物SDN酶相似的酶，但其作用還不清楚。在多種模式生物(包括擬南芥)的研究均表明miRNA的多種個(gè)修飾影響miRNA的穩(wěn)定性，植物成熟的miRNA可通過(guò)3的甲基化增強(qiáng)miRNA的穩(wěn)定性。而2'-O甲基化阻止尿苷酰轉(zhuǎn)移酶在此位添加尿嘧啶(該位點(diǎn)的尿嘧啶化和miRNA的降解有關(guān))，同時(shí)，有觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為尿嘧啶化具有保護(hù)miRNA的作用，因此，當(dāng)前對(duì)該種修飾的確切作用還沒(méi)有定論。尿嘧啶修飾不止在植物，在動(dòng)物中也存在。植物和動(dòng)物miRNA都可以在3發(fā)生腺苷酸修飾，例如肝臟高豐量表達(dá)miRNA miR-12

29、2，miR-122在丙型肝炎中具有重要作用，miR-122的腺苷酸修飾具有穩(wěn)定miRNA的作用，在植物中的研究也發(fā)現(xiàn)腺苷酸修飾可以延緩miRNA的降解速率。miRNA的演化歷程(進(jìn)化)miRNA因其低的進(jìn)化率成為重要的分類(lèi)學(xué)標(biāo)志物。miRNA的起源與形態(tài)進(jìn)化有關(guān)，使基因表達(dá)調(diào)節(jié)更精細(xì)，更具有特異性，更有利于復(fù)雜器官的生成，并可能最終導(dǎo)致復(fù)雜生命的出現(xiàn)。事實(shí)上，形態(tài)學(xué)進(jìn)化上的大爆發(fā)通常伴隨了miRNA的激增。miRNA通常起源于位于DNA非編碼區(qū)域隨機(jī)生成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(常位于內(nèi)含子和基因間)，部分miRNA源于已存在miRNA的復(fù)制和修飾。最近起源的miRNA進(jìn)化的速度(如核酸置換)與其它非編碼D

30、NA相當(dāng)，暗示其通過(guò)中性漂變進(jìn)化;起源古老miRNA均有很低的進(jìn)化速度，通常每百萬(wàn)年一個(gè)堿基置換的速率都不到，表明miRNA取得一項(xiàng)功能經(jīng)歷了極其精準(zhǔn)的選擇過(guò)程。在這種情景下，miRNA很難在基因組中丟失。而最近起源的miRNA，通常可能沒(méi)有重要的功能，也更容易在進(jìn)化中丟失。這種特性使miRNA在進(jìn)化學(xué)上成為杰出的分子標(biāo)志物，可能有利于解決在分類(lèi)學(xué)上存在爭(zhēng)議的類(lèi)群(如節(jié)肢動(dòng)物)。miRNA是在多數(shù)真核生物中普遍存在的特性，從褐藻到后生動(dòng)物都存在。到2011年3月止，已經(jīng)在各個(gè)物種界共發(fā)現(xiàn)了15170多miRNA。雖然在細(xì)菌中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)miRNA，但是在細(xì)菌中同樣存在短的RNA序列(通常50到數(shù)百

31、個(gè)核苷酸長(zhǎng))，發(fā)揮了與miRNA相類(lèi)似的功能。miRNA的識(shí)別和預(yù)測(cè)miRNA具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物特性：包括miRNA前體具有發(fā)夾或折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不含有大的內(nèi)部環(huán)狀結(jié)構(gòu)和突起，成熟的miRNA位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸部，由Dicer加工而成，成熟miRNA長(zhǎng)約22 nt左右，其序列在不同物種間保守等。現(xiàn)今有多種發(fā)現(xiàn)miRNA的技術(shù)，可分為計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法兩類(lèi)。計(jì)算機(jī)分析法利用miRNA結(jié)構(gòu)和構(gòu)相特征預(yù)測(cè)基因組中可能存在的miRNA，然后在此基礎(chǔ)上通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)。隨著不同生物基因組測(cè)序的完成和對(duì)miRNA結(jié)構(gòu)和生化特征的深入認(rèn)識(shí)，利用計(jì)算機(jī)程序?qū)蛐蛄羞M(jìn)行搜索大大提高了miRNA

32、的鑒定效率。人們?cè)O(shè)計(jì)了多種miRNA預(yù)測(cè)軟件，包括miRseeker，snarloop，MirScan等。計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)法的主要依據(jù)包括以下三個(gè)方面：首先，發(fā)夾結(jié)構(gòu)是miRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本特性，幾乎所有的預(yù)測(cè)程序均將這一特征作為預(yù)測(cè)的首要標(biāo)準(zhǔn);其次，miRNA序列和結(jié)構(gòu)的保守性，這是區(qū)分miRNA候選基因和其它不相關(guān)發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列關(guān)鍵因素;最后，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性和序列、結(jié)構(gòu)的相似性等。各種預(yù)測(cè)軟件在預(yù)測(cè)依據(jù)上各有側(cè)重。MiRscan軟件就是利用預(yù)測(cè)序列與已知miRNA的相似性來(lái)鑒定潛在miRNA，并對(duì)保守發(fā)夾結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類(lèi)，預(yù)測(cè)了多個(gè)C.elegans和人的新候選miRNAs，且通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到確

33、認(rèn)。其次是根據(jù)靶標(biāo)序列的保守性進(jìn)行預(yù)測(cè)，靶標(biāo)的3 UTRs都存在保守序列，而且這些保守序列能與miRNAs seed序列互補(bǔ)配對(duì)。最后，根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用這一特性能區(qū)別miRNAs和其它具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列。miRNAs折疊的自由能比tRNAS和rRNAs低。RNAz軟件為一款結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性和序列保守性開(kāi)發(fā)的miRNA預(yù)測(cè)軟件。很多miRNAs以多拷貝或基因簇等形式存在于基因組中，因此利用已知miRNAs基因附近的序列來(lái)尋找潛在的miRNAs基因也是一個(gè)很有效的方法。但是，軟件分析法存在一個(gè)明顯的缺陷：目前對(duì)miRNAs的認(rèn)識(shí)還不足以到使用計(jì)算機(jī)可以精確鑒定mi

34、RNA的程度。設(shè)置嚴(yán)格的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)將降低預(yù)測(cè)的敏感性。而較寬松的標(biāo)準(zhǔn)則其準(zhǔn)確度會(huì)下降。其預(yù)測(cè)僅局限于在表型或序列保守的RNA，不能預(yù)測(cè)那些不具有保守性的稀有miRNA。miRNA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與基因操控技術(shù)遺傳學(xué)策略(genetic method)遺傳學(xué)策略包括正向和反向遺傳學(xué)分析。把突變的基因從產(chǎn)生非正常表型的生物體或者組織當(dāng)中分離出來(lái)進(jìn)行研究鑒定，這種研究方式為正向遺傳學(xué)分析方法。第一個(gè)小非編碼RNA基因lin-4在線(xiàn)蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)就是使用的這種方法。在研究時(shí)序發(fā)育混亂的突變體時(shí)，發(fā)現(xiàn)這種混亂是由于小非編碼RNA基因lin-4發(fā)生突變?cè)斐?。然而miRNA分子序列短小，對(duì)不影響seed序列的突變具有“容忍

35、性”，都給使用正向遺傳學(xué)方法研究miRNA帶來(lái)困難。反向遺傳學(xué)分析方法原理是在體外引入特定的突變，然后通過(guò)同型基因化或換位將突變基因?qū)胨拗黧w內(nèi)原來(lái)的位置，觀(guān)察表型的改變。在研究miRNAs的時(shí)候，反向遺傳學(xué)分析方法常常與生物信息學(xué)分析相結(jié)合，通過(guò)預(yù)測(cè)miRNA基因，然后引進(jìn)突變，觀(guān)察表型?；蚪M實(shí)驗(yàn)方法鑒定miRNA基因該方法需要制備小RNA的文庫(kù)?，F(xiàn)今發(fā)展了多種克隆小RNAs的實(shí)驗(yàn)方法，不同的小RNA克隆方法設(shè)計(jì)基本原理一致。首先將提取的總RNA通過(guò)變性PAGE膠電泳分離回收長(zhǎng)度20-25 nt的小RNA，接著分別將5和3端接頭結(jié)合于小RNA兩端，RT-PCR擴(kuò)增小RNA片段，獲得cDNA

36、片段后克隆入載體表達(dá)，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，再通過(guò)測(cè)序分析、同源性比對(duì)確定這些小RNA的來(lái)源。在合成cDNA的第一條鏈時(shí)，先將3端接頭接于小RNA上，為了避免小RNA和接頭的自身連接，連接之前對(duì)RNA進(jìn)行去磷酸化處理，對(duì)3端接頭的3進(jìn)行化學(xué)處理或在3端接頭的5末端加上一個(gè)腺苷酸，采用T4連接酶連接，不加入ATP，這樣就可以避免去磷酸化處理小RNA。3接頭連接之后可進(jìn)行5接頭連接，連接之前最好先對(duì)其5磷酸化處理。部分?jǐn)U增測(cè)序是一種PCR擴(kuò)增技術(shù)，它使用一條部分覆蓋miRNAs序列的引物，另一條引物為cDNA克隆的適配體。根據(jù)預(yù)測(cè)的miRNAs設(shè)計(jì)一段生物素標(biāo)記的寡聚核苷酸，再用這段核苷酸去捕文庫(kù)中同

37、源的miRNAs，對(duì)被捕獲的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。大量已知生物的高豐度和組成性表達(dá)miRNA基因都是通過(guò)這種直接克隆而獲得的。然而對(duì)于在生物體內(nèi)濃度很低的miRNA，直接克隆法成效較差。miRNA表達(dá)水平的定量研究如果某種miRNA在某種特定組織、細(xì)胞或者某個(gè)發(fā)育階段中特異性表達(dá)，說(shuō)明此miRNA可能在其中發(fā)揮某種調(diào)控作用;要了解miRNA在機(jī)體中時(shí)間、空間的表達(dá)情況及其在機(jī)體生理、病理過(guò)程中所發(fā)揮的作用，必須有合適的方法檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平，在此基礎(chǔ)上開(kāi)展更深入的功能研究?，F(xiàn)階段檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平的方法主要包括基于核苷酸雜交和基于PCR的miRNA檢測(cè)方法?；谔结橂s交技術(shù)的mi

38、RNA檢測(cè)方法是一種直接檢測(cè)法，不需要對(duì)樣本RNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，包括RNA印跡技術(shù)、原位雜交技術(shù)、微陣列技術(shù)和基于微球的流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)。RNA印跡技術(shù)是檢測(cè)RNA的經(jīng)典方法?；驹砣缦拢菏紫仍谳d體(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA樣本，再與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的探針雜交，洗滌多余的雜交探針后進(jìn)行信號(hào)檢測(cè);也可以在載體上先固定與靶miRNA序列互補(bǔ)的DNA探針，然后與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的樣本miRNA雜交，再進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。信號(hào)標(biāo)記的方法包括同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記和納米金標(biāo)記等。原位雜交技術(shù)能夠顯示miRNA表達(dá)的位置，尤其適用于石蠟包埋或福爾馬林固定后的標(biāo)本，LNA特異的構(gòu)造使其具有更強(qiáng)的雜交特性和敏感性選擇性，

39、用于原位檢測(cè)miRNA是最理想的選擇。微陣列技術(shù)(microarray)也稱(chēng)生物芯片、特點(diǎn)是高通量，現(xiàn)今廣泛應(yīng)用于功能miRNA的初步篩選?；谖⑶虻牧魇郊?xì)胞術(shù)(bead-based flow cytometry)是一種液相芯片技術(shù)，該方法將流式細(xì)胞檢測(cè)與芯片技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，兼有通量大、檢測(cè)速度快、靈敏度高和特異性好等特點(diǎn)。miRNA僅為22nt左右，相當(dāng)于一個(gè)引物的長(zhǎng)度，基于PCR基礎(chǔ)上的miRNA檢測(cè)方法需通過(guò)接頭增加miRNA的長(zhǎng)度來(lái)使miRNA適于PCR擴(kuò)增檢測(cè)，包括有莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(stem-loop RT-PCR)法、RNA加尾和引物延伸RT-PCR法等?；跀U(kuò)增反

40、應(yīng)的方法還包括滾換擴(kuò)增法(RCA)，引物浸入法(Invader)，測(cè)序法等。(1) Northern雜交為最經(jīng)典的檢測(cè)真核生物RNA大小，估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法。待測(cè)樣本經(jīng)變性凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、烘干等步驟，使RNA牢固地結(jié)合在膜上。將膜與標(biāo)記好的變性RNA探針雜交、洗膜、顯影后對(duì)條帶進(jìn)行光密度掃描，根據(jù)條帶分子大小以及密度確定miRNA表達(dá)量。但Northern技術(shù)過(guò)程煩瑣，操作費(fèi)力，對(duì)RNase污染非常敏感，更有難于檢出表達(dá)量很低的miRNA的缺點(diǎn)。(2) miRNA表達(dá)譜芯片原理同樣是使用標(biāo)記探針檢測(cè)固相支持物上的目標(biāo)分子。通過(guò)設(shè)計(jì)芯片上miRNA基因及內(nèi)參序列，可精確分析出樣品中相應(yīng)miRN

41、A的表達(dá)水平?；蛐酒哂懈咄康膬?yōu)點(diǎn)，可以一次在同一樣本中檢測(cè)出幾百個(gè)基因的全部表達(dá)。Luminex公司研制的液相芯片(Liquid chip)又稱(chēng)多功能懸浮點(diǎn)陣(Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新一代生物芯片技術(shù)。液相芯片體系由許多小球體為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種小球體上固定有不同的探針?lè)肿?，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標(biāo)記探針的球形基質(zhì)都帶有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號(hào)，將這些小球體懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以對(duì)同一個(gè)微量樣本中的多個(gè)不同分子同時(shí)進(jìn)行快速的定性、定量分析，這種檢測(cè)技術(shù)被稱(chēng)為FMAP(Flexible multia

42、nalyte profiling)技術(shù)。分子雜交在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測(cè)速度極快。(3) 核酶保護(hù)分析技術(shù)(RPA)miRNA的檢測(cè)還可以采用核酶保護(hù)分析技術(shù)，將標(biāo)記好的探針和待測(cè)RNA樣本混合，熱變性后雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受保護(hù)的RNA分子，最后通過(guò)變性PAGE電泳分離探針，顯色。這種基于液相雜交的新方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。(4) RAKE法RAKE法(RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基礎(chǔ)上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miR

43、NA與固定的DNA探針雜交的方法。RAKE可以敏感特異地檢測(cè)miRNA，適用于大量快速的篩選所有己知的miRNA。能夠在特定的細(xì)胞和腫瘤中檢測(cè)miRNA表達(dá)譜情況。不僅如此，RAKE法還可以從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中分離出miRNA并對(duì)其進(jìn)行分析，為從存檔標(biāo)本中分析miRNA開(kāi)啟了希望之門(mén)。(5) 原位雜交(in situ hybridization)原位雜交技術(shù)可直觀(guān)了解miRNA表達(dá)方式，是觀(guān)測(cè)miRNA時(shí)空表達(dá)的一種較簡(jiǎn)便的方法，常標(biāo)記方式包括地高辛、生物素、熒光標(biāo)記等。鎖定核酸基礎(chǔ)上的原位雜交(Locked Nucleic Acid (LNA) based in situ h

44、ybridization (LNA-ISH)是當(dāng)前應(yīng)用較多的探針?lè)绞健?6) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR，RT-PCR)熒光檢測(cè)PCR儀可對(duì)整個(gè)PCR過(guò)程中擴(kuò)增序列的累積速率繪制動(dòng)態(tài)變化曲線(xiàn)。在反應(yīng)混合體系中靶序列的起始濃度越大，要求獲得擴(kuò)增產(chǎn)物某特定產(chǎn)量的PCR循環(huán)數(shù)(一般用特定閾值循環(huán)數(shù)Ct來(lái)表達(dá))越少。由于miRNA長(zhǎng)度僅為22 nt，傳統(tǒng)的qRT-PCR不適合擴(kuò)增如此短的片段?，F(xiàn)今有幾種用于miRNA的實(shí)時(shí)定量PCR方法，只簡(jiǎn)要介紹一下頸環(huán)法。頸環(huán)法是一種理想的miRNA檢測(cè)qRT-PCR方法：首先設(shè)計(jì)特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，以待測(cè)miRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

45、第一鏈，該cDNA一端為莖環(huán)狀引物，莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)便增加了cDNA的長(zhǎng)度，隨后以合成的cDNA為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。qRT-PCR具有特異性高、靈敏度好、快速簡(jiǎn)單等多種優(yōu)點(diǎn)。(7) 基于padlock探針和滾環(huán)擴(kuò)增的miRNA檢測(cè)系統(tǒng)Padlock探針是線(xiàn)性的DNA探針，其末端序列分別可以和miRNA的兩端互補(bǔ)雜交。在合適的條件下，當(dāng)其與RNA模板匹配時(shí)，當(dāng)padlock探針與靶miRNA雜交時(shí), DNA連接酶將padlock探針的 3和5末端連接成環(huán)，其中miRNA模板隨后用作滾環(huán)擴(kuò)增的引物, 從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)序列的線(xiàn)性擴(kuò)增。padlock探針技術(shù)不需要特殊的設(shè)備，可以對(duì)納

46、克級(jí)總RNA中的miRNA進(jìn)行檢測(cè)和量化。(8) 克隆測(cè)序法大部分已知的miRNA都是通過(guò)cDNA克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)和鑒定的。該法需要先構(gòu)建miRNA的cDNA文庫(kù)，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物隨后克隆到表達(dá)載體上測(cè)序。Takada開(kāi)發(fā)了一種改進(jìn)的擴(kuò)增克隆法(miRNA amplification profiling，mRAP)，mRAP法先在miRNA的3端連上接頭，然后用與接頭互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樘囟ǖ姆崔D(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸)會(huì)連接到反轉(zhuǎn)錄出的cDNA鏈的3末端。當(dāng)5端接頭與cDNA鏈的poly(C)粘性末端退火后，加入一對(duì)共用引物即可實(shí)現(xiàn)對(duì)cD

47、NA的PCR擴(kuò)增。由于mRAP高度靈敏，可以直接用克隆和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)少量組織中miRNA的表達(dá)量。標(biāo)簽序列克隆法是一種在在基因表達(dá)系列分析(SAGE)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了檢測(cè)效率更高的miRAGE (miRNA SAGE)克隆法，該法通過(guò)生成大的串聯(lián)子，通過(guò)單個(gè)測(cè)序反應(yīng)可檢測(cè)多個(gè)miRNA，明顯提高了檢測(cè)效率。新一代大規(guī)模測(cè)序技術(shù)包括焦磷酸測(cè)序技術(shù)、Solexa合成測(cè)序技術(shù)和SOLID連接測(cè)序技術(shù)等，能在一次測(cè)序過(guò)程中對(duì)幾百萬(wàn)個(gè)樣本進(jìn)行同時(shí)測(cè)序，極大提高了測(cè)序效率。這類(lèi)大規(guī)模測(cè)序技術(shù)極大的提高了多個(gè)物種遺傳信息的解讀速度，為獲取所有miRNA的序列信息，解密miRNA圖譜提供了保證。miRNAs

48、靶標(biāo)的預(yù)測(cè)和鑒定絕大多數(shù)的miRNAs通過(guò)堿基配對(duì)的方式結(jié)合到靶mRNA的3 UTR，通過(guò)抑制靶基因的翻譯達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的，因此miRNA靶標(biāo)的鑒定對(duì)研究miRNA的功能至關(guān)重要。新miRNA發(fā)現(xiàn)的速度相對(duì)其功能研究要快的多。到目前為止，已經(jīng)有15172條miRNA被收錄，但是其功能研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。阻礙miRNA功能研究進(jìn)展的主要原因是：miRNAs與其靶基因并非完全匹配，這給篩選miRNA靶基因帶來(lái)難度;而當(dāng)前缺乏高通量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)是阻礙miRNA靶標(biāo)鑒定進(jìn)程的主要因素。miRNA與其靶基因間存在如下重要特征：靶基因3UTR區(qū)具有與miRNA 5端至少7個(gè)連續(xù)核苷酸的完全配對(duì)區(qū)域(2-

49、8 nt)，miRNA的該部分序列稱(chēng)為“種子”序列;mRNA與miRNA種子序列互補(bǔ)的區(qū)域在物種中經(jīng)常具有保守性。研究人員根據(jù)對(duì)miRNA及其靶mRNA特征的認(rèn)識(shí)，開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的計(jì)算機(jī)軟件推斷miRNA的靶基因。但多種因素影響了靶標(biāo)預(yù)測(cè)的效率。miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)高效性影響因素最初的幾個(gè)miRNAs(如let-7和lin-4)的靶標(biāo)鑒定出來(lái)后，研究人員意識(shí)到miRNA與靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的3 UTRs互補(bǔ)配對(duì)，認(rèn)為可以根據(jù)靶標(biāo)和miRNA互補(bǔ)配對(duì)這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行靶標(biāo)篩選。但是實(shí)踐操作過(guò)程中，只依據(jù)靶標(biāo)和miRNA互補(bǔ)配對(duì)這一原則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，篩選的效率還受以下幾個(gè)方面因素的制約：第一，植物的miRN

50、A與靶標(biāo)基因幾乎完全配對(duì)結(jié)合，靶標(biāo)基因的鑒定相對(duì)容易，但在動(dòng)物中，miRNA與靶基因mRNA以不完全堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合于3 UTRs，給通過(guò)序列相似性來(lái)鑒定動(dòng)物體內(nèi)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)帶來(lái)了相當(dāng)?shù)睦щy。第二，miRNAs是序列短小的小分子，與3 UTRs結(jié)合的方式存在多樣性，結(jié)合位點(diǎn)除了配對(duì)區(qū)還存在突環(huán)和錯(cuò)配區(qū)，一般的分析工具只對(duì)配對(duì)區(qū)較長(zhǎng)，突環(huán)和錯(cuò)配區(qū)很少的靶標(biāo)鑒定相對(duì)效率較高。第三，miRNAs存在2-7nt(seed區(qū))與靶標(biāo)精確的配對(duì)，如果忽略GC含量進(jìn)行大規(guī)模seed區(qū)與已有物種的全基因組序列配對(duì)，在基因組中六個(gè)堿基隨機(jī)出現(xiàn)的幾率相對(duì)較高，預(yù)測(cè)出的靶標(biāo)假陽(yáng)性現(xiàn)象嚴(yán)重。第四，盡管現(xiàn)在很多

51、生物的全基因組序列測(cè)序工作已經(jīng)完成，但是對(duì)3 UTRs堿基序列、座位、剪接多態(tài)性認(rèn)識(shí)尚淺，這也給miRNA靶基因的預(yù)測(cè)帶來(lái)困難。第五，在進(jìn)化過(guò)程中物種間的3 UTR序列相當(dāng)保守，雖然靶標(biāo)預(yù)測(cè)過(guò)程中排除那些不具有保守序列的靶標(biāo)能降低假陽(yáng)性概率，但3 UTR序列保守性也不是絕對(duì)的，排除所有不保守序列降低了預(yù)測(cè)的靈敏度。miRNA預(yù)測(cè)原則和軟件介紹通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法確定miRNAs的作用靶標(biāo)非常耗時(shí)，尚無(wú)高通量的靶標(biāo)鑒定方法。因此，雖然靶基因鑒定存在上述多種困難，通過(guò)理論方法預(yù)測(cè)miRNAs的作用靶標(biāo)依舊是當(dāng)前篩選和識(shí)別miRNAs靶標(biāo)的較為理想的途徑。一般情況下，用于miRNA靶基因預(yù)測(cè)的軟件遵循如下幾

52、個(gè)原理：1 序列互補(bǔ)性：位于miRNA 5端所謂種子序列(第2-7nt)與靶基因3UTR可形成Watson-Crick配對(duì)是所有miRNA靶基因預(yù)測(cè)的最重要因素。配對(duì)包括如下幾種形式：多數(shù)情況下為7nt匹配：第2-7nt與靶基因呈互補(bǔ)配對(duì)，外加在靶基因?qū)?yīng)miRNA第一位核苷酸處為A(7mer-1A site)，或是miRNA第2-8nt與靶基因完全配對(duì)(7mer-m8 site);而對(duì)于miRNA第2-8nt與靶基因完全配對(duì)，且外加靶基因?qū)?yīng)miRNA第一位核苷酸處為A(8mer site)這種類(lèi)型，其特異性更高;對(duì)于僅miRNA第2-7核苷酸與靶基因完全配對(duì)(6mer site)這種方式，

53、其用于搜索靶基因的敏感性更高，特異性相應(yīng)下降。另外，還有種子序列外的3 supplementary site和3 complementary site兩種形式。2 序列保守性及其它因素：除了序列互補(bǔ)性外，靶基因預(yù)測(cè)較關(guān)注的還包括序列保守性、熱動(dòng)力學(xué)因素、位點(diǎn)的可結(jié)合性(accessibility)和UTR堿基分布等多個(gè)因素。序列保守性：miRNA結(jié)合位點(diǎn)在多個(gè)物種之間如果具有保守性，則該位點(diǎn)更可能為miRNA的靶位點(diǎn)。熱動(dòng)力學(xué)因素：miRNA:target對(duì)形成的自由能，自由能越低，其可能性越大。位點(diǎn)的可結(jié)合性(accessibility)：mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響與miRNA的結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)

54、的能力。UTR堿基分布：miRNA結(jié)合位點(diǎn)在UTR區(qū)的位置和相應(yīng)位置的堿基分布同樣影響miRNA與靶基因位點(diǎn)的結(jié)合和RISC的效率。另外，諸如miRNA的分布與靶基因組織分布的相關(guān)性也是在做靶基因預(yù)測(cè)時(shí)要考慮的重要因素。用于miRNA靶基因預(yù)測(cè)的軟件種類(lèi)很多，包括miRanda, EMBL, PicTar, TargetScan(S), DIANA-microT 3.0, PITA, ElMMo, rna22, GenMiR+, TarBase, miRBase, miRGen-Targets等。雖然現(xiàn)有的幾種預(yù)測(cè)程序在技術(shù)細(xì)節(jié)上有所不同，但它們預(yù)測(cè)的基本原理相似，都是基于miRNAs與靶標(biāo)的

55、結(jié)合機(jī)制。2003年，Stark和同事通過(guò)程序?qū)诟构壢蚪M搜尋鑒定潛在的miRNA靶標(biāo)首先得到成功。因?yàn)楹诟构壢蚪M序列提供了豐富而且精確的3 UTRs的信息。把果蠅的3 UTRs與擬南芥、果蠅和岡比亞按蚊的3 UTRs比對(duì)找出保守3 UTRs的序列組成一個(gè)保守的3 UTRs數(shù)據(jù)庫(kù)，然后用HMMer比對(duì)搜尋工具搜尋該數(shù)據(jù)庫(kù)與已知miRNA第2-8個(gè)核苷酸完全互補(bǔ)配對(duì)的3 UTRs序列，再用mfold軟件判斷miRNA靶標(biāo)復(fù)合體的熱力學(xué)穩(wěn)定性。此方法預(yù)測(cè)出果蠅許多未知的靶標(biāo)，其中有6個(gè)靶標(biāo)得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Enright等建立的miRanda法是第二個(gè)公布的miRNAs靶標(biāo)預(yù)測(cè)法。其編程原

56、理依據(jù)主要是：通過(guò)得分矩陣計(jì)算出互補(bǔ)程度大小，尋找互補(bǔ)性最高的3 UTRs;利用vien-naRNA計(jì)算miRNAs和靶標(biāo)復(fù)合體熱力學(xué)穩(wěn)定性，并淘汰不能形成雙連體的假陽(yáng)性靶標(biāo)。TargetScan為了在預(yù)測(cè)的開(kāi)始過(guò)程排除假陽(yáng)性，首先要求seed嚴(yán)格配對(duì)，延伸序列直到不配對(duì)的區(qū)域，然后根據(jù)保守性原則，淘汰不具有3 UTRs保守序列的分子，最后運(yùn)用RNAFold進(jìn)行熱力學(xué)穩(wěn)定性篩選。根據(jù)miRNA-靶標(biāo)復(fù)合體熱力學(xué)穩(wěn)定性這一特性建立的預(yù)測(cè)法有PicTar、RNAHybrid等。miRNAs功能研究方法通過(guò)程序預(yù)測(cè)得到的miRNAs靶標(biāo)常需通過(guò)生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定;miRNA的功能也開(kāi)展詳細(xì)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)

57、研究。常用的方法包括：報(bào)告基因構(gòu)建，突變研究，基因沉默技術(shù)以及經(jīng)典的遺傳學(xué)技術(shù)。研究miRNA對(duì)靶基因的作用與一般的基因研究方法相同，上調(diào)細(xì)胞中miRNA表達(dá)水平獲得gain-of-functon表型，而下調(diào)或抑制miRNA的表達(dá)獲得loss-of-function表型。通過(guò)改變特定miRNA表達(dá)水平可用于鑒定受該miRNA調(diào)節(jié)的基因以及該miRNA所影響和調(diào)控的細(xì)胞反應(yīng)。上調(diào)miRNA主要依靠將化學(xué)合成的miRNA導(dǎo)入細(xì)胞，或構(gòu)建pre-miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)pre-miRNA并通過(guò)細(xì)胞中各種酶以及蛋白作用產(chǎn)生miRNA。下調(diào)則以阻斷miRNA表達(dá)為主。miRNA的活性可以

58、通過(guò)對(duì)與內(nèi)源性miRNAs互補(bǔ)的鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)寡核酸，Morpholino(morpholino phosphorodiamidate antisense oligonucleotides)探針或2-O-甲基RNA寡核酸等技術(shù)實(shí)現(xiàn)。也可以通過(guò)空間位阻寡核酸在多點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的成熟抑制;另外，利用完全互補(bǔ)的antagomir可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定miRNA的沉默;Thermo旗下Dharmacon產(chǎn)品研發(fā)團(tuán)隊(duì)人工合成的miRNA模擬物和阻遏物可轉(zhuǎn)染增強(qiáng)或者抑制內(nèi)源的成熟miRNA，也是研究miRNA功能的重要的工具。miRNA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)(tran

59、sgeneic technology)通過(guò)將外源DNA導(dǎo)入動(dòng)物受精卵或胚胎干細(xì)胞內(nèi)，以隨機(jī)插入或同源重組的方式整合到受體染色體中，并隨細(xì)胞分裂而遺傳給后代?！稗D(zhuǎn)基因動(dòng)物”對(duì)研究特定基因的功能具有重要的作用。從“轉(zhuǎn)基因”表達(dá)水平上看，轉(zhuǎn)基因可分為：過(guò)表達(dá)(over expression)、基因敲除(knockout，KO)及基因敲減(knockdown)等類(lèi)型。因轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虮磉_(dá)水平明顯差異，從而導(dǎo)致動(dòng)物呈現(xiàn)不同表型(phenotype)，為功能實(shí)驗(yàn)提供重要的研究材料。以往轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過(guò)導(dǎo)入外源DNA片段編碼酶、受體等功能蛋白質(zhì)來(lái)研究相應(yīng)分子的功能，隨著對(duì)miRNA的研究深入，已將轉(zhuǎn)基因技術(shù)普遍應(yīng)用到小RNA研究中。2002年起有實(shí)驗(yàn)室嘗試導(dǎo)入編碼短鏈RNA的DNA片段，在動(dòng)物體內(nèi)達(dá)到RNA干擾(RNAi)使基因沉默的目的。前幾年已出現(xiàn)miRNA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，隨著時(shí)間推進(jìn)，miRNA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模