HPLC指紋圖譜建立的技術(shù)要求PPT課件

1、1第四節(jié)第四節(jié) hplc指紋圖譜建立的關(guān)鍵技術(shù)要求指紋圖譜建立的關(guān)鍵技術(shù)要求一、藥材樣品來源（中間體和注射劑另有規(guī)定）一、藥材樣品來源（中間體和注射劑另有規(guī)定） 應(yīng)固定品種、藥用部位、產(chǎn)地、采收期、產(chǎn)地加工和炮制方法等。應(yīng)固定品種、藥用部位、產(chǎn)地、采收期、產(chǎn)地加工和炮制方法等。供試品的取樣參照供試品的取樣參照中華人民共和國藥典中華人民共和國藥典2010年版中規(guī)定的中藥材年版中規(guī)定的中藥材取樣方法，以保證供試品的代表性和均一性。取樣方法，以保證供試品的代表性和均一性。按按1：10取樣。取樣。二、供試品制備二、供試品制備 必須確保中藥材的主要化學(xué)成分在指紋圖譜中的體現(xiàn)。多種有效組必須確保中藥材的主

2、要化學(xué)成分在指紋圖譜中的體現(xiàn)。多種有效組分應(yīng)分別提取制備。分應(yīng)分別提取制備。三、參照物的制備三、參照物的制備 選擇適宜的對照品作為參照物，如果沒有適宜的對照品，可選擇適選擇適宜的對照品作為參照物，如果沒有適宜的對照品，可選擇適宜的內(nèi)標(biāo)物作為參照物。宜的內(nèi)標(biāo)物作為參照物。2四、測定方法四、測定方法 包括測定方法、儀器、試劑、測定條件等必須固定。建議優(yōu)先包括測定方法、儀器、試劑、測定條件等必須固定。建議優(yōu)先考慮色譜方法。對于成分復(fù)雜的中藥材可以考慮采用多種測定方法，考慮色譜方法。對于成分復(fù)雜的中藥材可以考慮采用多種測定方法，建立多張指紋圖譜。建立多張指紋圖譜。注意方法學(xué)考察。注意方法學(xué)考察。1、指

3、紋圖譜、指紋圖譜 第一，指紋圖譜記錄時間一般為第一，指紋圖譜記錄時間一般為1小時，但應(yīng)提供小時，但應(yīng)提供2小時的記錄小時的記錄圖。第二，圖。第二，tlc法必須提供從原點至溶劑前沿的圖譜。第三，對于化法必須提供從原點至溶劑前沿的圖譜。第三，對于化學(xué)成分復(fù)雜，必要時可建立多張指紋圖譜。學(xué)成分復(fù)雜，必要時可建立多張指紋圖譜。2、共有指紋峰的標(biāo)定、共有指紋峰的標(biāo)定 采用色譜方法制定指紋圖譜，必須根據(jù)參照物的保留時間，計采用色譜方法制定指紋圖譜，必須根據(jù)參照物的保留時間，計算指紋的相對保留時間。根據(jù)算指紋的相對保留時間。根據(jù)10批次的檢測結(jié)果，標(biāo)定中藥材的共有批次的檢測結(jié)果，標(biāo)定中藥材的共有指紋峰。指紋

4、峰。33、共有指紋峰面積的比值、共有指紋峰面積的比值（1）以參照物峰面積作為）以參照物峰面積作為1 （要求能出現(xiàn)穩(wěn)定的峰）（要求能出現(xiàn)穩(wěn)定的峰） ，計算各共有指紋，計算各共有指紋峰面積與參照物峰面積的比值（參照物可以是對照品也可以是內(nèi)標(biāo)峰面積與參照物峰面積的比值（參照物可以是對照品也可以是內(nèi)標(biāo)物）。物）。（2）以內(nèi)標(biāo)物作為參照物的指紋圖譜，則以共有指紋峰中其中一個峰）以內(nèi)標(biāo)物作為參照物的指紋圖譜，則以共有指紋峰中其中一個峰（要求面積相對較大、較為穩(wěn)定的共有峰）的峰面積作為（要求面積相對較大、較為穩(wěn)定的共有峰）的峰面積作為1，計算其，計算其他各共有指紋峰面積的比值。他各共有指紋峰面積的比值。（3

5、）各共有峰的面積比值必須相對固定。）各共有峰的面積比值必須相對固定。（4）共有峰面積要求：單峰面積占共有峰總面積）共有峰面積要求：單峰面積占共有峰總面積 20%的的共有峰共有峰，其差，其差值不得值不得20%；若；若20% 面積面積 10%共有峰共有峰，其差值不得，其差值不得25%； 若若面積面積 10%的的共有峰共有峰，峰面積比值不作要求峰面積比值不作要求，但必須標(biāo)定相對保留時，但必須標(biāo)定相對保留時間。未達到基線分離的間。未達到基線分離的共有峰共有峰，應(yīng)計算該組峰的總峰面積作為峰面積，應(yīng)計算該組峰的總峰面積作為峰面積，同時標(biāo)定該組各峰的相對保留時間。同時標(biāo)定該組各峰的相對保留時間。44、非共有

6、峰面積、非共有峰面積 非共有峰總面積不得非共有峰總面積不得 總面積的總面積的10%。5、方法學(xué)考察、方法學(xué)考察（1）穩(wěn)定性）穩(wěn)定性 主要考察供試品的穩(wěn)定性。取同一供試品，分別在不同時間檢測，主要考察供試品的穩(wěn)定性。取同一供試品，分別在不同時間檢測，考察色譜峰的相對保留時間、峰面積的一致性，確定檢測時間。考察色譜峰的相對保留時間、峰面積的一致性，確定檢測時間。（2）精密度）精密度 主要考察儀器的精密度。取同一供試品，連續(xù)進樣主要考察儀器的精密度。取同一供試品，連續(xù)進樣5次以上，考次以上，考察色譜峰的相對保留時間、峰面積比值的一致性。其峰面積比值的相察色譜峰的相對保留時間、峰面積比值的一致性。其峰

7、面積比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd不得大于不得大于3%。（3）重現(xiàn)性）重現(xiàn)性 主要考察實驗方法的重現(xiàn)性。取同一批號的供試品主要考察實驗方法的重現(xiàn)性。取同一批號的供試品5份以上，按份以上，按照供試品的制備和檢測方法制備供試品并進行檢測，考察色譜峰的相照供試品的制備和檢測方法制備供試品并進行檢測，考察色譜峰的相對保留時間、峰面積比值的一致性。其峰面積比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差對保留時間、峰面積比值的一致性。其峰面積比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd不得大于不得大于3%。56、其他注意問題、其他注意問題（1）樣品定容）樣品定容 一般制成樣品的標(biāo)示濃度單位為一般制成樣品的標(biāo)示濃度單位為g/ml或或mg/ml。（2）

8、放置）放置 供試品溶液應(yīng)在避光、低溫、密閉容器條件下保存，供試品溶液應(yīng)在避光、低溫、密閉容器條件下保存，一般不超過兩周，溶液不穩(wěn)定的，一般不超過一般不超過兩周，溶液不穩(wěn)定的，一般不超過48小時。小時。（3）有效數(shù)字）有效數(shù)字 相對保留時間和相對峰面積的有效數(shù)字要求取小數(shù)點相對保留時間和相對峰面積的有效數(shù)字要求取小數(shù)點后后3位。位。（4）留樣）留樣 注意留樣的數(shù)量不少于實驗實際用量的注意留樣的數(shù)量不少于實驗實際用量的3倍。倍。6（5）參照物）參照物 復(fù)方制劑首選君藥的活性成分或指標(biāo)性成分，盡可能闡明參照復(fù)方制劑首選君藥的活性成分或指標(biāo)性成分，盡可能闡明參照物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)名稱，也可以選擇適當(dāng)?shù)?/p>

9、內(nèi)標(biāo)物插入色譜中。物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)名稱，也可以選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物插入色譜中。 （6）量化的含義）量化的含義 是指在定量的操作條件下，所得到的藥材指紋圖譜在整體特征是指在定量的操作條件下，所得到的藥材指紋圖譜在整體特征上可以半定量的比較，以表達原料藥材指紋圖譜在上可以半定量的比較，以表達原料藥材指紋圖譜在“量量”方面的總體方面的總體差異程度，以及半成品（提取物）和成品之間及成品批間指紋圖譜在差異程度，以及半成品（提取物）和成品之間及成品批間指紋圖譜在“量量”的相對程度。的相對程度。（7）相似度軟件）相似度軟件 2004年年sfda中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評

10、價軟件，一，一般成品指紋圖譜相似度計算結(jié)果在般成品指紋圖譜相似度計算結(jié)果在0.9-1.0之間為符合要求。之間為符合要求。7圖圖2 福建太子參福建太子參hplc指紋圖譜指紋圖譜圖圖1 福建蓮子福建蓮子hplc指紋圖譜指紋圖譜8第五節(jié)第五節(jié) 研究實例研究實例 丹參丹參hplc指紋圖譜構(gòu)建指紋圖譜構(gòu)建一、藥材來源（一、藥材來源（gap基地）與鑒定基地）與鑒定二、色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗二、色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.1%乙酸乙酸（5：95）為流動相；檢測波長）為流動相；檢測波長254nm；柱溫為室溫；流；柱溫為室溫；流速為速

11、為1ml/min。9四、供試溶液的制備四、供試溶液的制備 40目，目，10批次，各批次，各1g（精密稱?。麴s水提取，（精密稱?。麴s水提取，趁熱過濾，得提取液趁熱過濾，得提取液100ml，加，加10%鹽酸調(diào)鹽酸調(diào)ph為為2，再用，再用乙酸乙酯乙酸乙酯40ml萃取萃取1次。萃取液濃縮至干，殘渣用次。萃取液濃縮至干，殘渣用1ml流流動相溶解，作為供試品溶液，動相溶解，作為供試品溶液，hplc分析前用微孔濾膜過分析前用微孔濾膜過濾。濾。五、測定五、測定 分別取各批次藥材供試品分別取各批次藥材供試品10 l，注入，注入hplc儀，記錄儀，記錄1h色譜。色譜。 供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜有供試品指紋圖譜應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所附的對照指紋圖譜有良好的相似性。良好的相似性。 指紋圖譜應(yīng)有指紋圖譜應(yīng)有12個特征峰。個特征峰。10相對保留時間相對保留時間/min（特征峰序號）（特征峰序號） 0.150（1）、）、0.368（2）、）、0.437（3）、）、0.495（4）、）、0.591（5）、）、1.000（s）、）、1.143（6）、）、1.393（7）、）、1.627（8）、）、2.585（9）、）、2.911（10）3.968（11）。）。特征指紋峰面積積分相對比值特征指紋峰面積積分相對比值 0.15230%(1)、0.72(