常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)及應(yīng)用

1、實(shí)驗(yàn)一 常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)及應(yīng)用一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊? .掌握培養(yǎng)基的概念和分類。2 .掌握常用培養(yǎng)基制備的一般程序。3 .熟悉常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)和用途。二實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基（culture medium）是根據(jù)微生物生長繁殖所需要的一定比例的營養(yǎng)物質(zhì)（碳源、 氮源等）、氫離子濃度（pH值）以及滲透壓等條件，用人工方法制成的無菌營養(yǎng)基質(zhì)。主要 用于微生物分離培養(yǎng)、生化鑒定和保存菌種等。培養(yǎng)基按物理性狀不同可分為固體、 半固體和液體培養(yǎng)基； 按性質(zhì)和用途不同又可細(xì)分 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基。根據(jù)物理性狀和用途等不同常將培養(yǎng)基分裝于試管或平皿等容器中。常用培養(yǎng)基制

2、備的一般程序是：調(diào)配成分 溶解較正pH值過濾分裝滅菌質(zhì) 量檢驗(yàn)保存。配制培養(yǎng)基時(shí)可以按照培養(yǎng)基配方調(diào)配各種基本成分，也可購買半成品的商品培養(yǎng)基干粉制劑直接配制。三器材與試劑1 .試劑 普通營養(yǎng)瓊脂干粉、脫纖維羊血、半固體培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基干粉、克氏雙糖鐵培養(yǎng)基干粉、1 mol/L NaOH溶液、麥康凱培養(yǎng)基成分（蛋白月東、氯化鈉、膽鹽、乳糖、 5 g/L中性紅水溶液、瓊脂粉）、蒸儲(chǔ)水。2 .器材 小型藥物天平、藥匙、稱量紙、三角燒瓶、量筒、吸管、精密 pH值試紙?jiān)?管、硅膠塞、牛皮紙（或報(bào)紙）、棉線、玻璃棒、玻璃紙、無菌平皿、高壓蒸汽滅菌鍋、微 波爐等。四步驟與方法1 .常用培養(yǎng)基制備的一般程

3、序及方法1）調(diào)配成分根據(jù)培養(yǎng)基配方或用法，準(zhǔn)確計(jì)算、稱量所需培養(yǎng)基各基本成分或干粉 制劑，裝于三角燒瓶中，加入定量蒸儲(chǔ)水充分混合。2 ）溶解 將盛有混合物的三角燒瓶置于沸水浴或流動(dòng)蒸汽滅菌器中加熱溶解，呈半透明狀。3 ）校正pH值 即將培養(yǎng)基pH值校正到適合細(xì)菌生長的最適pH值，一般病原菌的最適pH值為7.27.6。校正培養(yǎng)基pH值的常用試劑有 1 mol/L NaOH溶?1 mol/L NaCO3 溶液和1 mol/L HCl溶液（注意：培養(yǎng)基高壓滅菌后， 用NaOH和HCl校正的pH值會(huì)下 降0.10.2,而用NaCO3溶液校正的pH值會(huì)上升0.10.2）;校正培養(yǎng)基pH值的方法常用 精密

4、pH值試紙法、比色法和電子pH計(jì)法等。4）過濾培養(yǎng)基中若存在雜質(zhì)或沉淀物時(shí)則需要過濾澄清。液體培養(yǎng)基用濾紙趁熱過濾，固體培養(yǎng)基用雙層紗布夾脫脂棉趁熱過濾。5 )分裝(1)液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基滅菌前分裝于潔凈試管中，分裝到試管的下1/41/3處，加塞，510支試管用牛皮紙蓋帽，棉線扎捆，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期。滅菌 后直立放置。(2)固體斜面培養(yǎng)基滅菌前分裝于潔凈試管中，分裝到試管的下1/31/2處，加塞，510支試管用牛皮紙蓋帽，棉線扎捆，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期。滅菌后趁熱擺成 斜面，斜面長度為試管長度的 2/3,并保持斜面下端距離管底有 1 cm以上柱高，同時(shí)斜面上 端距離試管塞1

5、cm以上。(3)瓊脂高層培養(yǎng)基滅菌前分裝于潔凈試管中，分裝到試管的下2/3處，加塞，510支試管用牛皮紙蓋帽，棉線扎捆，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制作日期。滅菌后直立放置。(4 )固體平板培養(yǎng)基將培養(yǎng)基分裝于三角燒瓶 (培養(yǎng)基的量要小于三角燒瓶最大容量)，先用玻璃紙或棉塞封口，再用牛皮紙蓋帽、棉線扎口。滅菌后將培養(yǎng)基冷卻至50 C左右，以無菌操作，傾注于平皿內(nèi)(內(nèi)徑為 9 cm的平皿傾注1520 mL培養(yǎng)基)，馬上水平 旋轉(zhuǎn)12周，使培養(yǎng)基均勻平鋪于皿底。待培養(yǎng)基凝固后，在皿底面上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、 制作日期，底上蓋下倒置保存。6)滅菌根據(jù)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)耐熱性的不同分別采取相應(yīng)的物理滅菌法(1)培養(yǎng)基成

6、分均耐高熱時(shí)常用高壓蒸汽滅菌法，這也是最常用、最可靠的培養(yǎng)基滅菌方法。常用滅菌條件為103.43 kPa (121.3 C) 1520 min；含糖培養(yǎng)基用 68.95 kPa(115.6 C) 1015 min,以免破壞糖類物質(zhì)。(2)培養(yǎng)基中含有不耐高熱營養(yǎng)物質(zhì)(如糖類、明膠和牛乳等)時(shí)，常用流通蒸汽滅 菌法，方法是 80100 c加溫30 min,每天1次，連續(xù)3 d。(3)培養(yǎng)基中富含蛋白質(zhì)(如血清或雞蛋清)時(shí)需用血清凝固器滅菌，方法是將需滅 菌的培養(yǎng)基擺放在血清凝固器內(nèi)(一般做成斜面)，第一天75 C加熱30 min,第二天80 C加熱30 min,第三天85 C加熱30 min,在

7、3次滅菌間隙將培養(yǎng)基取出，置35 c恒溫箱中過夜。(4)對液態(tài)高營養(yǎng)的不耐熱培養(yǎng)基，如血清、細(xì)胞培養(yǎng)液等，可采用濾過除菌。7)質(zhì)量檢驗(yàn)制備好的培養(yǎng)基須經(jīng)性狀檢查、無菌檢驗(yàn)和效果檢驗(yàn)均合格才可使用。(1)性狀檢查液體培養(yǎng)基應(yīng)外觀清澈透明；半固體培養(yǎng)基應(yīng)質(zhì)地均勻，呈半固態(tài)；固體斜面培養(yǎng)基應(yīng)質(zhì)地均勻，凝固后斜面穩(wěn)定，不下滑；平板培養(yǎng)基應(yīng)質(zhì)地均勻，表面光滑、平整，薄厚適宜。(2)無菌檢驗(yàn)將制備好的培養(yǎng)基置于 35c培養(yǎng)24 h,以無任何細(xì)菌生長為合格。(3)效果檢驗(yàn) 將已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于待檢培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后檢查標(biāo)準(zhǔn)菌的生長 繁殖狀況和生化反應(yīng)是否與預(yù)期的結(jié)果符合。8）保存 制備好且標(biāo)記清楚的培養(yǎng)基

8、置于4C冰箱保存?zhèn)溆?，?yán)格滅菌后的培養(yǎng)基一般可保存1周以上，但不宜過久。注意平板培養(yǎng)基應(yīng)底上蓋下倒置保存，以防止蓋內(nèi)水蒸 汽落在培養(yǎng)基表面， 使得培養(yǎng)基表面粘滯易污染且不易接種；液體、半固體等培養(yǎng)基應(yīng)直立保存。2 .常用培養(yǎng)基的制備技術(shù)1 ）營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基用量筒準(zhǔn)確量取所需蒸儲(chǔ)水，先倒入三角燒瓶一部分，隨后按照營養(yǎng)肉湯成分配方（蛋白月東10 g,牛肉浸出粉 3 g,氯化鈉5 g,蒸儲(chǔ)水1000 mL見附錄一） 或干粉制劑說明書用法準(zhǔn)確計(jì)算、稱量所需粉劑，置于已經(jīng)盛有部分蒸儲(chǔ)水的三角燒瓶中， 最后將量筒內(nèi)剩余蒸儲(chǔ)水全部倒入三角燒瓶，充分混勻、加熱溶解后，用1 mol/L NaOH校正pH值到7.

9、57.6 （高壓后可降到培養(yǎng)基要求的7.4）,分裝于試管中，加塞扎捆標(biāo)記后高壓蒸汽121c滅菌20 min。取出后直立放置，待冷卻后置于4 C保存?zhèn)溆?。可用于一般?xì)菌的增菌培養(yǎng)。2）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用量筒準(zhǔn)確量取所需蒸儲(chǔ)水，先倒入三角燒瓶一部分，之后按照營養(yǎng)瓊脂成分配方（蛋白月東10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,瓊脂粉20 g,蒸儲(chǔ)水1000 mL見附錄一）或干粉制劑說明書用法準(zhǔn)確計(jì)算、稱量所需粉劑，置于已經(jīng)盛有部分蒸儲(chǔ)水的三角燒瓶中，最后將量筒內(nèi)剩余蒸儲(chǔ)水全部倒入三角燒瓶，充分混勻、加熱煮沸溶解后呈半透明狀，校正pH值到7.27.4。若制作固體斜面則先分裝于試管中，加塞扎捆標(biāo)記后高壓蒸 汽

10、121c滅菌20 min,高壓后趁熱擺成斜面，凝固后置于4 C保存，可用于一般細(xì)菌菌種的傳代保存；若制作固體平板，則直接封裝在三角燒瓶中，高壓蒸汽121c滅菌20 min,滅菌后以無菌操作傾注平板，待凝固后標(biāo)記、倒置于4 C保存，可用于對營養(yǎng)要求不高細(xì)菌 的分離培養(yǎng)和純化。3）半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：配方見附錄一是蛋白月東10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,瓊脂粉5 g,蒸儲(chǔ)水1000 mL , pH為7.4,具體做法同肉湯培養(yǎng)基?？捎糜谟^察細(xì)菌的動(dòng)力和 保存菌種。4）血瓊脂平板將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂冷卻到50 C左右，以無菌操作加入 10%的無菌脫纖維羊血（或兔血），立即混勻，避免產(chǎn)生氣泡，然后

11、以無菌操作分裝于無菌試管或平皿， 制成血瓊脂斜面或血瓊脂平板。血瓊脂斜面可用于保存營養(yǎng)要求高的細(xì)菌；血瓊脂平板可用分離培養(yǎng)細(xì)菌和檢測其溶血性。5）巧克力瓊脂平板是基于血瓊脂平板制備基礎(chǔ)之上，特點(diǎn)在于滅菌后的營養(yǎng)瓊脂冷卻到7080 c時(shí)加入無菌脫纖維血液，且在 80 C水浴中搖勻1520 min,使血液的色澤 由鮮紅轉(zhuǎn)變?yōu)榍煽肆ι?，然后冷?0 C左右，以無菌操作傾注平板即制成巧克力瓊脂平板。 可用于分離培養(yǎng)奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌屬等對營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌。6）麥康凱瓊脂平板按照配方基本成分（蛋白月東20 g, NaCl 5 g，膽鹽5 g,乳糖 10 g, 5 g/L中性紅水溶液5 mL,瓊脂2

12、0 g,蒸儲(chǔ)水1000 mL見附錄一）自行配制時(shí)，先將 除乳糖、中性紅之外的成分混合加熱溶解，調(diào) pH7.2之后，再加入乳糖、中性紅，混勻后高 壓滅菌115 c 15 min,取出冷卻至50 C左右，以無菌操作傾注平板，凝固后標(biāo)記、倒置于4 C保存，可用于腸桿菌科細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定。五注意事項(xiàng)1 .要防止加熱溶解時(shí)培養(yǎng)基粘瓶底燒結(jié)，可先在三角燒瓶底部加入部分量好的蒸儲(chǔ) 水，再加入稱量好的固體成分，最后將量筒內(nèi)剩余的蒸儲(chǔ)水全部倒入三角燒瓶。2 .制備培養(yǎng)基最好用玻璃器皿（燒瓶、燒杯） 。若制備大量培養(yǎng)基時(shí)可用鋁鍋或搪瓷 桶，但不能用鐵、銅器皿，因?yàn)殍F離子進(jìn)入培養(yǎng)基，達(dá)到一定濃度會(huì)抑制細(xì)菌生長，而銅離 子會(huì)抑制細(xì)菌毒素產(chǎn)生。3 .在按照配方自行配制培養(yǎng)基時(shí)，若培養(yǎng)基中