實驗十三細(xì)菌的生理生化反應(yīng)

1、37 C恒溫箱中，培養(yǎng) 2448h。3.觀察記錄取出以上試管,振蕩 5mL 以上對應(yīng)管中的培養(yǎng)液,各加入 養(yǎng)液上層, 若培養(yǎng)液上層變成紅色,或“一表示。實驗十三 細(xì)菌的生理生化反應(yīng)甲基紅試驗、糖發(fā)酵試驗、淀粉水解試驗，H2S 試驗，一、實驗?zāi)康?了解細(xì)菌鑒定中常用的主要生理生化反應(yīng)試驗法及其原理。2比較 4 種菌的大分子水解實驗結(jié)果。3比較 4 種菌的甲基紅反應(yīng)結(jié)果。4學(xué)習(xí)如何使用杜氏小管進行糖發(fā)酵試驗，并比較3 種菌的糖發(fā)酵試驗結(jié)果。二、實驗原理各種細(xì)菌由于具有不同的酶系統(tǒng)，致使它們能利用不同的底物，或雖然可以利用相同的 底物，卻產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，因此可以利用各種生理生化反應(yīng)來鑒別細(xì)菌。糖

2、發(fā)酵是最常用的生化反應(yīng)，存在于大多數(shù)細(xì)菌中。不同的細(xì)菌在糖的分解能力上存在 很大的差異。 有些細(xì)菌能分解某種糖并產(chǎn)生酸性物質(zhì)（如乳酸、丙酸、醋酸等）和氣體 （如二氧化碳、氫、甲烷等 ），而有些細(xì)菌只產(chǎn)生酸不產(chǎn)生氣體。例如大腸桿菌分解乳糖和葡萄糖產(chǎn) 酸并產(chǎn)氣， 普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣， 但不能分解乳糖。 酸的產(chǎn)生可利用指示劑來 判斷。在培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫 （pH5 2為黃色， pH6 8為紫色 ），當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，使培養(yǎng) 基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵試管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡的出現(xiàn)來驗 證。三、實驗器材1. 大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌的斜面菌種。熒光假單

3、胞菌（Pseudo monas fluoresce ns）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureuse）.2. 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖、乳糖或蔗糖 ）； 淀粉培養(yǎng)基、硫化氫實驗培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基。40NaOH 溶液、甲基紅試劑、 1.6溴甲酚紫指示劑。3. 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、試管、移液管,杜氏小管。四、實驗方法（一）甲基紅試驗：1. 試管標(biāo)記 取 5 支裝有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管, 分別標(biāo)記大腸桿菌、 產(chǎn)氣腸桿 菌、普通變形菌,枯草芽孢桿菌和空白對照。2. 接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上

4、相應(yīng)試管中,空白對照不接菌。置2min 。另取 5 支空試管相應(yīng)標(biāo)記菌名,分別加入32 3 滴甲基紅指示劑,注意沿管壁加入,仔細(xì)觀察培即為陽性反應(yīng), 若仍呈黃色, 則為陰性反應(yīng), 分別用 “+”二）糖發(fā)酵試驗1. 試管標(biāo)記2. 接種培養(yǎng)3. 觀察記錄 與對照管比較,若接種培養(yǎng)液保持原有顏色,其反應(yīng)結(jié)果為陰性,表明該菌不能利用該種糖,記錄用 “-”表示；如培養(yǎng)液呈黃色,反應(yīng)結(jié)果為陽性,表明該菌能分解 該種糖產(chǎn)酸,記錄用 “+表”示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng),表明該菌分解糖 能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用 爼”示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用6 ”表示。（三）淀粉水解試驗（一）淀粉水解

5、試驗?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細(xì)菌吸收 利用。淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)色。試驗時將裝有淀粉培養(yǎng)基的三角瓶置于洗水浴中融化，然后取出冷卻至約50C左右，即傾入培養(yǎng)皿中，待凝固后制成平板。每個同學(xué)用接種環(huán)取少量菌涂在平板上，每個菌種涂片0.30.5cm大小的圓（見圖14-1）、其中一種應(yīng)以枯草桿菌（Bacillus subtilis ）作為對照 菌。圖14- 1淀粉水解試驗接種示意圖1. 枯草芽孢桿菌2.試驗菌13.大腸桿菌4.試驗菌2將培養(yǎng)皿倒置于37C恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察時打開皿蓋滴加少量碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌體周圍出現(xiàn)無

6、色透明圈，則說明淀粉已被水解。透明圈的大小，說明該菌水解淀粉能力的強弱。（四）硫化氫的產(chǎn)生試驗許多細(xì)菌能從培養(yǎng)基中的含硫有機化合物產(chǎn)生硫化氫。硫化氫遇鉛鹽（或鐵鹽）則形成 黑色硫化鉛（或黑色硫化鐵）。試驗常用胱氨酸或半胱氨酸作為含硫有機物。1 方法接種與觀察：用新鮮斜面培養(yǎng)物（菌種）接種到硫化氫試驗培養(yǎng)基中。接種后，用無菌 鑷子夾取醋酸鉛濾紙條用棉塞塞緊，使懸掛于管中，下端接進培養(yǎng)基表面，不接觸液面，適溫培養(yǎng)。于接種后 3、7、14天觀察，紙條變黑者為陽性，不變者為陰性。2. 注意事項a. 此方法比較敏感，本培養(yǎng)基不適用于腸桿菌科。b. 紙條高度應(yīng)放置適當(dāng)，離液面太遠(yuǎn)影響靈敏度，太近容易被濺濕

7、。 同時移動試管時也要平穩(wěn)。c. 除空白對照外，應(yīng)放陰性對照。（五）石蕊牛奶試驗牛乳中通常含有蔗糖、乳糖、蛋白質(zhì)、酪蛋白等成分。細(xì)菌對牛乳的利用主要是指對乳 糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。中性時石蕊呈淡紫色，酸性時呈紅色，堿性時呈藍(lán)色，還原時則部分或全部脫色。細(xì)菌對牛乳的利用可分三種情況：1. 酸凝固作用細(xì)菌發(fā)酵乳糖后，產(chǎn)生許多酸，使石蕊牛乳變紅，當(dāng)酸度很高時，可使牛乳凝固，此稱 為酸凝固。2. 凝乳酸凝固作用某些細(xì)菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，這種凝固在中性環(huán)境中發(fā)生。通常這 種細(xì)菌還具有水解蛋白質(zhì)的能力，因而產(chǎn)生一些堿性物質(zhì)，使石蕊變藍(lán)。3

8、. 胨化作用酪蛋白被水解，使牛乳變成清亮透明的液體。胨化作用可以在酸性條件下或堿性條件下 進行，一般石蕊色素被還原脫色。接種大腸桿菌或熒光假單胞菌于石蕊牛乳培養(yǎng)基中，置于37 C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 7d。另外保留1支不接種的石蕊牛乳培養(yǎng)基作為對照。（六）油脂水解試驗?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生脂肪酶（胞外酶），能分解培養(yǎng)基中的脂肪成為甘油及脂肪酸。產(chǎn)生脂肪酸的檢驗，可通過油脂培養(yǎng)基中的中性紅來指示。指示范圍pH6.8時呈紅色至PH8.0時呈黃色。當(dāng)細(xì)菌分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸時，則培養(yǎng)基中出現(xiàn)紅色斑點。試驗時，將裝有油脂培養(yǎng)基的錐形瓶置于沸水浴中融化，取出并充分振蕩使油脂均勻分 布，再傾入培養(yǎng)皿中，待凝固后，做成平板

9、。每個同學(xué)劃線接種于同一平板的兩邊，其中一 種是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為對照菌（圖9-2 ）。置于37 C恒溫箱內(nèi)培 養(yǎng)24h,取出后觀察平板底層長菌的地方，如出現(xiàn)紅色斑點，即說明脂肪被水解，此反應(yīng)為 正反應(yīng)。圖14-2油脂水解試驗接種示意圖1.金黃色葡萄球菌 2.大腸桿菌3試驗菌14試驗菌2五、實驗報告細(xì)菌生理生化反應(yīng)試驗測定結(jié)果：六、關(guān)鍵步驟與注意事項1 甲基紅試驗中，不要過多滴加甲基紅指示劑，以免出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。2 在糖發(fā)酵試驗的培養(yǎng)管中裝入倒置杜氏小管時，注意防止小管內(nèi)有殘留氣泡。滅菌 時適當(dāng)延長煮沸時間可除去管內(nèi)氣泡。七、思考題1 細(xì)菌生理生化

10、反應(yīng)試驗中為什么要設(shè)有空白對照？2哪些生理生化試驗可用于區(qū)別大腸桿菌和產(chǎn)生腸桿菌？結(jié)果如何？3甲基紅試驗和伏一普試驗的最終產(chǎn)物如何?為什么會出現(xiàn)不同的最終產(chǎn)物 ?4現(xiàn)分離到一株腸道細(xì)菌，試結(jié)合本實驗學(xué)到的知識設(shè)計一個試驗方案進行鑒別。 5分述淀粉水解試驗油脂水解試驗和石蕊牛奶試驗的基本生化原理。附培養(yǎng)基：1淀粉水解培養(yǎng)基蛋白胨10g氯化鈉5g可溶性淀粉 2g,牛肉膏 3g,瓊脂1520g,水1000mL, pH 7.47.8 , 121 C高壓蒸汽滅菌 30min。2硫化氫試驗培養(yǎng)基蛋白胨 10g，胱氨酸 0.1g，Na2SO4 0.1g,蒸餾水 1000mL, pH7.07.4 分裝試管。每

11、管液層高度 45cm。 0.6kg 蒸汽滅菌 2030min。另外將普通濾紙剪成 0.51cm寬的紙條。長度根據(jù)試管與培養(yǎng)基高度而定。用5% -10%的醋酸鉛將紙條浸透，然后用烘箱烘干，放于培養(yǎng)皿內(nèi)滅菌備用。3石蕊牛奶培養(yǎng)基(1) 脫脂牛奶的制備新鮮牛奶用離心機分離，除去上層奶油，取下層脫脂牛奶。若無新鮮牛奶可用脫脂奶粉代替，每1000mL溶解100g脫脂奶粉，或?qū)Ⅴr奶煮沸，在冷涼處靜(2) 石蕊液的的制備將石蕊浸色即在蒸餾水中過夜或更長時間，使石蕊變軟而易于溶 解，溶解后過濾，即可用作配制石蕊牛奶。石蕊2.9g，蒸餾水100mL(3) 石蕊牛奶的配制：2.5%石蕊水溶液4mL,脂肪牛奶100mL，混合后的顏色為丁香 花紫色為適度，分裝試管，牛奶高度約4cm。間歇滅菌或以0.6kg蒸氣滅菌20-30min。注意事項：最好用新鮮牛奶，否則需調(diào)pH，但調(diào)過pH的牛奶色調(diào)不正。4. 油