蛋白質(zhì)的定量測(cè)定方法

1、IT六、蛋白質(zhì)含量定量法行一、Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量幕【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法和操作。【實(shí)驗(yàn)原理】蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與Folin-酚試劑起氧化還原反應(yīng)。 反應(yīng)過程分為兩步，第一步：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu 2+作用生成蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物；第二步：蛋白質(zhì)-Cu 2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鋁酸和磷鴇酸，生成藍(lán)色的化合物。該呈色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)即接近極限，并且在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系， 故可用比色的方法

2、確定蛋白質(zhì)的含量。進(jìn)行測(cè)定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測(cè)定波長(zhǎng)：若蛋白質(zhì)含量高時(shí)（25-100z）在500nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，含量低時(shí)（5-25gX 755nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。最后 根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。Folin-酚試劑法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5dg即可測(cè)得，是測(cè)定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。【實(shí)驗(yàn)材料】1 .實(shí)驗(yàn)器材100毫升容量瓶 2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；721型分光光度計(jì)。2 .實(shí)驗(yàn)試劑 Fo1in-酚試劑甲：將lg碳酸鈉溶于50ml 0.lmol /L氫氧化鈉溶液中，再把 0.5g硫酸銅 （CuSO 4 5H 2O

3、）溶于100m1 1 %酒石酸鉀（或酒石酸鈉）溶液，然后將前者 50ml與后者lml混合?；旌虾? 日內(nèi)使用有效。（2）Folin-酚試劑乙：在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鴇酸鈉（W2WO4 2H2。）、25g鋁酸鈉（Na2M00 4 2H2。）、700ml蒸儲(chǔ)水、50ml 85 %磷酸及100ml濃鹽酸，充分混勻后回流 10h?；亓魍?畢，再加150g硫酸鋰、50ml蒸儲(chǔ)水及數(shù)滴液體澳，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的澳，冷卻后定容到1000ml。過濾，如顯綠色，可加濱水?dāng)?shù)滴使氧化至溶液呈淡黃色。置于棕色瓶中暗處保存。使用前用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚血:為指示劑，以標(biāo)定該試劑的

4、酸度，一般為2mol/L左右（由于濾液為淺黃色，滴定時(shí)濾液需稀釋100倍，以免影響滴定終點(diǎn)的觀察）。使用時(shí)適當(dāng)稀釋（約1倍），使最后濃度為lmol /L酸。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用分析天平精密稱取牛（或人）血清白蛋白100毫克，用少量蒸儲(chǔ)水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至100毫升容量瓶中，準(zhǔn)確稀釋至刻度，使蛋白質(zhì)濃度1mg/ml。（4）樣品溶液：配制約 0.5mg/ml的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液?！緦?shí)驗(yàn)操作】1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管，按下表分別加入各試劑袂試劑管號(hào)妍0肄1蛔2蟻3蜘4蒞5膂6放標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（ml）袈0.0嵋0.1襖0.2蒂0.3s 0.4滕0.5節(jié)0.6賺蒸儲(chǔ)水（ml）s 1.0薇0

5、.9肄0.8W0.7肇0.6妨0.5蒂0.4蠅Fo1in-酚試劑甲（ml）腿5B 5艘5螂5芾5荽5螞5奠搖勻，室溫下放置 10分鐘萌Fo1in-酚試劑乙（ml）贛1英1蔗1藏1芨1袁1前1薇各管加入Folin-酚試劑乙后，立即搖勻，放置30分鐘后比色，在 500nm處記下各管光密度，以 0號(hào)管為對(duì)照，以光密度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.測(cè)定未知樣品：取 2支試管，分別準(zhǔn)確吸取 1毫升樣品溶液，各加 5毫升Folin-酚試劑甲，搖勻，室 溫放置10分鐘后，再各加1毫升Folin-酚試劑乙，立即搖勻，放置30分鐘，在500nm處測(cè)定光密度值。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)未知樣品溶

6、液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。蔻二、凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 著【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)凱氏定氮法的原理和操作技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】 凱氏定氮法用于測(cè)定有機(jī)物的含氮量，若蛋白質(zhì)的含氮量已知時(shí)，則可用此法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時(shí)，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成氨， 并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸錢。此過程通常稱為消化”。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。消化完成后，在凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸錢分解，游離出氨，借助水蒸汽蒸儲(chǔ)法，將 產(chǎn)生

7、的氨蒸儲(chǔ)到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結(jié)合，使溶液中的氫 離子濃度降低，指示劑顏色改變，然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)鹽酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來的氫離子濃度為止。根 據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的量可計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。蛋白質(zhì)的含氮量為16% ,即1克蛋白質(zhì)中的氮相當(dāng)于 6.25克蛋白質(zhì)，用凱氏定氮法測(cè)出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量。【實(shí)驗(yàn)材料】1 .實(shí)驗(yàn)器材 微量凱氏定氮儀 1套；50ml凱氏燒瓶4個(gè)；移液管；錐形瓶；試管；小玻璃珠2 .試驗(yàn)t劑（1）濃硫酸；30%氫氧化鈉溶液；2%硼酸溶液；標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液 （0.01mol/L）。（2）粉末硫酸鉀 一硫酸銅混合物：K2

8、SO4與CuSO 4 5H2。以3: 1配比研磨混合。 （3）混合指示劑（田氏指示劑）:由 50ml 0.1 %甲烯藍(lán)乙醇溶液與 200ml 0.1 %甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。（4）樣品溶液：配制3mg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品?！緦?shí)驗(yàn)操作】1 .安裝凱氏定氮儀。2 .消化：取4個(gè)50ml凱氏燒瓶并標(biāo)號(hào)，各加1顆玻璃珠，在 1號(hào)及2號(hào)瓶中各加樣品 1ml,催化劑 （K2SO4- CuSO 4 5H2。）200 mg ,濃硫酸5 ml。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3號(hào)及4號(hào)瓶中各加1 ml蒸儲(chǔ)水和與1、2號(hào)瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對(duì)照。在通

9、風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行 消化。 在消化開始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。撤掉火力，冷卻至室溫。3 .蒸儲(chǔ)：（1）蒸儲(chǔ)器的洗滌：用水洗滌干凈微量凱氏定氮儀，在蒸汽發(fā)生器中加入用幾滴硫酸酸化的蒸儲(chǔ) 水和幾滴甲基紅指示劑，用這樣的水蒸氣洗滌凱氏定氮儀。約 15分鐘后，在冷凝器下端傾斜放好裝有硼 酸-指示劑的錐形瓶，繼續(xù)蒸汽洗滌2分鐘，觀察錐形瓶?jī)?nèi)的溶液是否變色，如不變色則證明蒸儲(chǔ)裝置內(nèi)部已洗滌干凈。移走錐形瓶，停止加熱，打開夾子。（2）蒸儲(chǔ)：取下棒狀玻塞，用吸管吸取消化液，細(xì)心地插到反應(yīng)室小玻璃杯的下方，塞緊棒狀玻塞。將一

10、個(gè)含有硼酸和指示劑的錐形瓶放在冷凝器下方，使冷凝器下端浸沒在液體內(nèi)。 取30 %的氫氧化鈉溶液10ml放入小玻璃杯中，輕提棒狀玻璃塞使之流入反應(yīng)室 （為 了防止冷凝管倒吸， 液體流入反應(yīng)室必須緩慢）。尚未完全流入時(shí)，將玻璃塞蓋緊，向玻璃杯中加入蒸儲(chǔ)水 約5ml o再輕提玻璃塞，使一半蒸儲(chǔ)水慢慢流入反應(yīng)室，一半留在玻璃杯中作水封。加熱水蒸汽發(fā)生器，沸騰后夾緊夾子，開始蒸儲(chǔ)。氨氣進(jìn)入錐形瓶，瓶中的酸溶液由紫色變成綠色。變色時(shí)起記時(shí)，再蒸儲(chǔ)5分鐘。移動(dòng)錐形瓶，使硼酸液面離開冷凝管約 1厘米，并用少量蒸儲(chǔ)水洗滌冷凝管口外面，繼續(xù)蒸儲(chǔ)1分鐘，移開錐形瓶，用表面皿覆蓋錐形瓶。蒸儲(chǔ)完畢后，須將反應(yīng)室洗滌干凈

11、，再繼續(xù)下一個(gè)蒸儲(chǔ)操作。待 樣品和對(duì)照均蒸儲(chǔ)完畢后，同時(shí)進(jìn)行滴定。4 .滴定：用0.01mol /L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液由綠色變淡紫色為 滴定終點(diǎn)。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】樣品中氮的含量（g*）=生以竺以1x10。CxlOOO生物秀 ww.bbioo.cotn樣品中蛋白質(zhì)的含量（g"）(.4-5)x0.01x14x625 xlOOCxlOOOml數(shù)； B為滴定對(duì)照液用去的鹽酸溶液平均ml數(shù)；C為所取其中：A為滴定樣品用去的鹽酸溶液平均 樣品溶液的ml數(shù)。賺三、紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量薇【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握紫外分光光度計(jì)的操

12、作方法。【實(shí)驗(yàn)原理】大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使蛋白質(zhì)在280nm的紫外光區(qū)產(chǎn)生最大吸收，并且這一波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收值與蛋白質(zhì)濃度的成正比，利用這一特性可定量測(cè) 定蛋白質(zhì)的含量。紫外吸收法可測(cè)定 0.1-0.5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，此操作簡(jiǎn)便，測(cè)定迅速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，此法在蛋白質(zhì)的制備中廣泛應(yīng)用?！緦?shí)驗(yàn)材料】1.實(shí)驗(yàn)器材：試管及試管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度計(jì)。5 .實(shí)驗(yàn)試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確配制2mg/ml的酪蛋白溶液。（2）樣品溶液：配制約 0.5mg/ml的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。【實(shí)驗(yàn)操作】

13、1 .繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管按下列各表加入各試劑：裊它號(hào)芍試齊神0蝸1黃2蜜3第4帔5蝸6菜標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（ml）螞0.0祎0.5蝴1.0裂1.5蓬2.0噩2.5腦3.0薄蒸儲(chǔ)水（ml）方8.0方7.5菱7.0建6.5用6.0展5.5贛5.0刷蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）犀 0.000盆 0.125前 0.250節(jié) 0.375蟄 0.500薄 0.625薄 0.750肄試劑加完后搖勻，在紫外分光光度計(jì)上，于 280nm處以0號(hào)管為對(duì)照，分別測(cè)定各管溶液的光密度值。以光密度為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 .測(cè)定未知樣品取樣品溶液4毫升，加蒸儲(chǔ)水4ml混勻，在280nm下測(cè)定其

14、光密度值?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液的蛋白質(zhì)含量。覆四、BCA方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 蝕【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握用BCA方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法箍【實(shí)驗(yàn)原理】 BCA檢測(cè)法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡(jiǎn)單,試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高(微量檢測(cè)可達(dá)到0.5 wg/ml ,應(yīng)用更加靈活。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將 Cu2+還原成Cu + o二唾咻甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562

15、nm處具有強(qiáng)吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。【實(shí)驗(yàn)材料】1 .實(shí)驗(yàn)器材721分光光度計(jì)；恒溫水浴槽；移液管；微量進(jìn)樣器；試管架和試管。2 .實(shí)驗(yàn)試劑BCA試劑的配制試齊ij A, 1L:分別稱取 10g BCA (1%) , 20g Na2CO3 H2O (2%) , 1.6g Na 2c4H406 2H20(0.16%), 4g NaOH (0.4%), 9.5g NaHCO 3 (0.95),加水至 1L,用 NaOH 或固體 NaHCO 3 調(diào)節(jié) pH 值至 11.25。試劑 B, 50ml :取 2g CuSO 4 5H 2O (4%

16、),加蒸儲(chǔ)水至 50ml。BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取 40mg牛血清白蛋白，溶于蒸儲(chǔ)水中并定容至100ml ,制成400科g/ml的溶液。(3)樣品溶液：配制約 50 pg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品?！緦?shí)驗(yàn)操作】1 .繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支干燥潔凈的大試管，編號(hào)，按下表加入試劑。別呂勺螞1蠅2莆3肄4筮5蠅6蟆標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(襖0芍50期100肆150藏200妨250蔽蒸儲(chǔ)水(口先250腿200蒙150袁100蜜50蒞0膀BCA試齊J ( ml)量5輻5蜜5唐5蔽5其5衿蛋白質(zhì)含量(在0量0聿20腿40芳60籟80芨100索上述

17、試劑加完后，混勻，于 37 c保溫30min ,冷卻至室溫后，以第 1管為對(duì)照，在 562nm處比色，讀 取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 .樣品測(cè)定準(zhǔn)確吸取250口樣品溶液于一干燥潔凈的試管中，加入 BCA試劑5ml,搖勻，于37 c保溫30min ,冷卻 至室溫后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線 1號(hào)管為對(duì)照，在 595nm處比色，記錄吸光值?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量螃五、考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量聿【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆沼每捡R斯亮藍(lán)染料結(jié)合比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】 考馬斯亮藍(lán) G-250是一種染料

18、，在游離狀態(tài)下呈紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變成深藍(lán)色，最大吸收峰變?yōu)?595nm。蛋白質(zhì)含量在1-1000g范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在 595nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用比色法測(cè)定。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度，最低檢出量為1 wg蛋白。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合迅速，大約為2分鐘，結(jié)合物的顏色在 1小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。所以本法操作簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)含量的常用方法。【實(shí)驗(yàn)材料】1 .實(shí)驗(yàn)器材721型分光光度計(jì)；試管；移液管；容量瓶。2 .實(shí)驗(yàn)試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸儲(chǔ)水中并

19、定容至 100ml ,制成100 pg/ml 的溶液。（2）考馬斯亮藍(lán) G-250試劑：稱取100mg考馬斯亮藍(lán) G-250 ,溶于50ml 95 %乙醇中，加入 85% （m/v）的磷酸100ml ,最后用蒸儲(chǔ)水定容到 1000ml。此溶液可在常溫下放置一個(gè)月。（3）樣品溶液：配制約50g/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品?！緦?shí)驗(yàn)方法】1 .繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支干燥潔凈的大試管，編號(hào)，按下表加入試劑。曹管號(hào)荽1菜2衿3# 4w 56標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（ml）0.00.20.40.60.81.0蒸儲(chǔ)水（ml）1.00.80.60.40.20.0考馬斯亮藍(lán) G-250試齊J （ ml）555555蛋白質(zhì)含量（pg）020406080100上述試劑加完后，混勻，室溫靜置2min ,以第1管為對(duì)照，在595nm處比色，讀取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 .樣品測(cè)定準(zhǔn)確吸