發(fā)酵過程的生物學(xué)基礎(chǔ)

1、發(fā)酵工程 課件 Fermentation Engineering第1章 發(fā)酵過程的生物學(xué)基礎(chǔ) 歡迎光臨主講人：程云清本章的教學(xué)內(nèi)容第一節(jié) 發(fā)酵過程與微生物第二節(jié) 微生物的營養(yǎng)與培養(yǎng)基的設(shè)計(自學(xué)復(fù)習(xí)）第三節(jié)微生物的生長模式及其動力學(xué)(自學(xué)復(fù)習(xí)）第四節(jié) 環(huán)境對微生物的影響(自學(xué)復(fù)習(xí)）第五節(jié) 代謝產(chǎn)物的代謝調(diào)控第六節(jié) 微生物代謝產(chǎn)物的過量產(chǎn)生 第一節(jié)第一節(jié) 發(fā)酵過程與微生物發(fā)酵過程與微生物 o .微生物的概念(自學(xué)復(fù)習(xí)）o .微生物的種類(自學(xué)復(fù)習(xí)）o .微生物的特點(自學(xué)復(fù)習(xí)）o .微生物與發(fā)酵一、微生物的概念o 微生物(Microorganism, microbe) o 是指一大類形體微小、結(jié)

2、構(gòu)簡單的低等生物的總稱。微生物的概念三個要點:?。河^察借助光鏡；測量單位為微米或納米；簡：簡單多細胞;單細胞;無細胞結(jié)構(gòu)低：進化程度低，為原始的生命形式；1.微生物小的直觀感覺真核細胞型原核細胞型電鏡微生物的相對大小肉眼光學(xué)顯微鏡可見范圍病毒微生物的概念2.微生物的 細胞類型 真核細胞的主要特征:有核膜，核仁，染色體;有細胞器;核糖體為80S;微生物的概念微生物的細胞類型原核細胞的主要特征:無核膜、核仁、染色體，僅有裸露的DNA鏈形成的核區(qū)域，稱核質(zhì)體； 無細胞器；核糖體為70S；微生物的概念二、微生物的種類2、真核生物 真菌（霉菌、酵母菌等）、 原生動物、單細胞藻類；3、非細胞生物 病毒、類

3、病毒、擬病毒、朊病毒等；1、原核生物 細菌、放線菌、衣原體 支原體、立克次氏體、 藍細菌；各種“視野”下的細菌光鏡暗視野熒光透射電鏡超薄切片冷凍切片掃描電鏡DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物微生物的種類電鏡下的微生物曲霉阿米巴草履蟲酵母菌微生物的種類放線菌的球形桿形弧形螺旋形發(fā)酵工業(yè)常用微生物的形態(tài)特征球形桿形弧形螺旋形發(fā)酵工業(yè)常用微生物的形態(tài)特征基本結(jié)構(gòu):細胞壁；細胞膜；細胞質(zhì)；核質(zhì)體；特殊結(jié)構(gòu):莢膜；芽孢；鞭毛；發(fā)酵工業(yè)常用微生物的形態(tài)特征固體培養(yǎng)基上:菌落(colony)：指微生物細胞在一定條件下，在固體培養(yǎng)基表面形成的肉眼可見的微生物群體。若來自一個細胞，則為純培養(yǎng)或稱克隆( clone)。菌苔(la

4、wn)：大量細菌的菌落連成一片。發(fā)酵工業(yè)常用微生物的形態(tài)特征液體培養(yǎng)基上 均勻混濁； 沉淀生長； 表面生長。發(fā)酵工業(yè)常用微生物的形態(tài)特征o典型結(jié)構(gòu):細胞壁；細胞膜；細胞核；液 泡；線粒體；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；核糖體；微體；微絲；內(nèi)含物發(fā)酵工業(yè)常用微生物的形態(tài)特征發(fā)酵工業(yè)常用微生物的形態(tài)特征四、微生物的特點o 體積??；o 種類多；o 分布廣；o 繁殖快；o 便于培養(yǎng)；o 容易發(fā)生變異；o 在生產(chǎn)中不易受時間、季節(jié)、地區(qū)的限制 五、微生物與發(fā)酵o 發(fā)酵工程是以微生物的生命活動為中心的 o 微生物的生物學(xué)性狀和發(fā)酵條件決定了其相應(yīng)產(chǎn)物的生成o 工業(yè)上用的全部微生物都稱為工業(yè)微生物，工業(yè)生產(chǎn)上常用的微生物主要是細

5、菌、放線菌、酵母菌和霉菌 o 由于發(fā)酵工程本身的發(fā)展以及基因工程正在進入發(fā)酵過程，病毒、藻類等其它微生物也正在逐步地變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)菌。 第五節(jié) 微生物的代謝調(diào)節(jié) 在生物進化過程中，微生物細胞形成了愈來愈完善的代謝調(diào)節(jié)機制，在代謝繁殖過程中，能量的利用以及對細胞生長繁殖過程中所需的各種物質(zhì)的形成是非常合理和經(jīng)濟的，細胞經(jīng)常處于平衡生長狀態(tài)，不會有代謝產(chǎn)物的積累。 現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)要研究的主要內(nèi)容就是通過改變培養(yǎng)條件和遺傳特性，使微生物的代謝途徑改變或代謝調(diào)節(jié)失控而獲得某一發(fā)酵產(chǎn)物的過量產(chǎn)生。其方法大體可分為兩類：n 改變產(chǎn)生菌的基因型而改變代謝途徑；n 改變控制代謝速率，即影響基因型的表達。 代謝調(diào)節(jié)

6、代謝調(diào)節(jié)(regulation of metablism）是指微生物的代謝速度和方向按照微生物的需要而改變的一種作用。v 酶量的調(diào)節(jié)v 酶活性的調(diào)節(jié) 微生物代謝的控制微生物代謝的控制是指運用人為的方法對微生物的代謝調(diào)節(jié)進行遺傳改造和條件的控制，以期按照人們的愿望按照人們的愿望，生產(chǎn)有用的微生物制品。 代謝調(diào)節(jié)的方式 酶合成的調(diào)節(jié) 酶活性的調(diào)節(jié)方式 初級代謝的調(diào)節(jié) 次級代謝的調(diào)節(jié)一、代謝調(diào)節(jié)方式 細胞透性的調(diào)節(jié) 代謝途徑區(qū)域化 代謝流向的調(diào)控 代謝速度的調(diào)控1，細胞透性的調(diào)節(jié) 細胞質(zhì)膜的透性直接影響物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌，從而影響到細胞內(nèi)代謝的變化。 細胞質(zhì)膜的透性的調(diào)節(jié)是微生物代謝調(diào)節(jié)的重

7、要方式，由它控制著營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和產(chǎn)物分泌。代謝調(diào)節(jié)方式o 例如，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌吸收乳糖是由滲透酶和環(huán)狀A(yù)MP(cAMP)協(xié)同控制來完成的。cAMP的濃度是由腺苷酸環(huán)化酶(AC)的活性控制的，也就是說，乳糖的吸收受滲透酶和AMP環(huán)化酶的控制，調(diào)節(jié)蛋白通過磷酸化的形式和腺苷酸環(huán)化酶（AC）或滲透酶結(jié)合，分別使腺苷酸環(huán)化酶活化或使?jié)B透酶失活。當(dāng)有葡萄糖時，乳糖的滲透酶以無活性狀態(tài)存在，而腺苷酸環(huán)化酶也以非活性狀態(tài)存在。代謝調(diào)節(jié)方式2，代謝途徑區(qū)域化 原核微生物細胞結(jié)構(gòu)雖然簡單，但也劃分出不同的區(qū)域，對于某一代謝途徑有關(guān)的酶系則集中某一區(qū)域，以保證這一代謝途徑的酶促反應(yīng)順利進行，避免了其他

8、途徑的干擾。n 例如呼吸的酶系集中在細胞質(zhì)膜上；而與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的酶系則位于核蛋白體上；分解大分子的水解酶，在革蘭氏陰性菌里是位于壁膜間隙中，而革蘭氏陽性菌則將這些水解酶類，分泌于胞外。代謝調(diào)節(jié)方式 在真核微生物細胞里，各種酶系被細胞器隔離分布。v 如與呼吸產(chǎn)能有關(guān)的酶系集中于線粒體內(nèi)膜上；蛋白質(zhì)的合成酶系位于核蛋白體上；DNA合成的某些酶位于細胞核里。代謝調(diào)節(jié)方式 細胞具有復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)使其代謝活動只能在特定的部位上進行，即代謝活動是區(qū)域化的，其實質(zhì)是控制酶與底物接觸，使各個反應(yīng)有序地進行。代謝調(diào)節(jié)方式線粒體線粒體:丙酮酸氧化丙酮酸氧化;三羧三羧酸循環(huán)酸循環(huán); -氧化氧化;呼吸鏈電呼吸鏈電子

9、傳遞子傳遞;氧化磷酸化氧化磷酸化細胞質(zhì)細胞質(zhì):酵解酵解;磷磷戊糖途徑戊糖途徑;糖原糖原合成合成;脂肪酸合脂肪酸合成成;細胞核細胞核:核酸合成核酸合成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng):蛋白質(zhì)合成蛋白質(zhì)合成;磷脂合成磷脂合成酶酶定定位位的的區(qū)區(qū)域域化化3，代謝流向的調(diào)控 微生物在不同條件下可以通過控制各代謝途徑中某個酶促反應(yīng)的速率來控制代謝物的流向，從而保持機體代謝的平衡。它包括兩種形式v 由一個關(guān)鍵酶控制的可逆反應(yīng)v 由兩種酶控制的逆單向反應(yīng)代謝調(diào)節(jié)方式o 由一個關(guān)鍵酶控制的可逆反應(yīng)由一個關(guān)鍵酶控制的可逆反應(yīng) 同一個酶可以通過不同輔基(或輔酶)控制代謝物的流向。n 例如，谷氨酸脫氫酶以NADP+為輔酶時，主要是催化

10、谷氨酸的合成，當(dāng)以NAD+為輔酶時，則催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通過不同的輔基來控制代謝物的流向。代謝調(diào)節(jié)方式o 由兩種酶控制的逆單向反應(yīng)由兩種酶控制的逆單向反應(yīng) 逆單向反應(yīng)是在生物體代謝的關(guān)鍵部位的某些反應(yīng)，它是由兩種各自不同的酶來催化的。即在一個“可逆”反應(yīng)中，其中一種酶催化正反應(yīng)，而另一種酶則催化逆反應(yīng)。n例如，葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖是由己糖激酶催化的，而其逆反應(yīng)則是由6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1，6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的，逆反應(yīng)則由1，6-二磷酸果糖酯酶催化。代謝調(diào)節(jié)方式4，代謝速度的調(diào)控 在不可逆反應(yīng)中，微生物通過調(diào)節(jié)酶的活性和酶量來控制代謝物

11、的流量。 微生物在不同條件下能按照需要，通過激活或抑制原有酶的活性或通過誘導(dǎo)或阻遏酶的合成來自我調(diào)節(jié)其代謝速度，使之高度經(jīng)濟有效地利用能量和原料進行生長繁殖。代謝調(diào)節(jié)方式二、酶合成的調(diào)節(jié)o 酶合成的誘導(dǎo)o 酶合成的阻遏1，酶合成的誘導(dǎo)酶合成的調(diào)節(jié)2，酶合成誘導(dǎo)的機制酶合成的調(diào)節(jié)3，酶合成的阻遏酶合成的調(diào)節(jié)4，酶合成阻遏的機制酶合成的調(diào)節(jié)三、酶活性的調(diào)節(jié)概概 念念 酶活性調(diào)節(jié)酶活性調(diào)節(jié)是指一定數(shù)量的酶，通過其分子構(gòu)象或分子結(jié)構(gòu)的改變來調(diào)節(jié)其催化反應(yīng)的速率。影響因素影響因素底物和產(chǎn)物的性質(zhì)和濃度環(huán)境因子(如壓力、pH、離子強度和輔助因子等)其他的酶的存在調(diào)節(jié)方式調(diào)節(jié)方式激活已有酶的活性抑制已有酶的

12、活性（一）激活 激活：在激活劑的作用下，使原來無活性的酶變成有活性，或使原來活性低的酶提高了活性的現(xiàn)象。 代謝調(diào)節(jié)的激活作用：主要是指代謝物對酶的激活。v 前（體）饋激活，指代謝途徑中后面的酶促反應(yīng)，可被該途徑中較前面的一個中間產(chǎn)物所促進。v 代謝中間產(chǎn)物的反饋激活，指代謝中間產(chǎn)物對該代謝途徑的前面的酶起激活作用酶活性的調(diào)節(jié)反饋激活和前（體）饋激活示意圖反饋激活和前（體）饋激活示意圖AB C D FAB GCDEE+例例1:1:糖代謝途徑中丙酮酸積累激活丙酮酸羧化酶，糖代謝途徑中丙酮酸積累激活丙酮酸羧化酶，例例2 2：乙酰：乙酰CoACoA的積累激活的積累激活PEPPEP羧化酶羧化酶酶酶的的反

13、反饋饋激激活活葡萄糖葡萄糖草酰乙酸草酰乙酸丙酮酸丙酮酸羧化酶羧化酶乙酰乙酰CoA活化活化磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸擰檬酸擰檬酸 -酮戊二酸酮戊二酸1，6-二磷酸果糖二磷酸果糖（二）抑制 抑制：由于某些物質(zhì)的存在， 降低酶活性的現(xiàn)象。 反饋抑制（feedback inhibition） ：反饋抑制是指代謝的末端產(chǎn)物對酶(往往是代謝途徑中的第一個酶)活性的抑 制。v 無分支代謝途徑的調(diào)節(jié)v 有分支代謝途徑的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)1，無分支代謝途徑的調(diào)節(jié) 通常是在線形的代謝途徑中末端產(chǎn)物對催化第一步反應(yīng)的酶活性有抑制作用。酶活性的調(diào)節(jié)o 例如，在大腸桿菌中，由蘇氨酸(Thr)合成異亮氨酸(IIeu)

14、時，異亮氨酸對催化反應(yīng)途徑中的第一步反應(yīng)的蘇氨酸脫氨酶(TD)有抑制作用。蘇氨酸 -酮丁酸 異亮氨酸 TD酶活性的調(diào)節(jié)2，有分支代謝途徑的調(diào)節(jié) 在有兩種或兩種以上的末端產(chǎn)物的分支合成代謝途徑中，調(diào)節(jié)方式較復(fù)雜，其共同特點是每個分支途徑的末端產(chǎn)物控制分支點后的第一個酶，同時每個末端產(chǎn)物又對整個途徑的第一個酶有部分的抑制作用，分支代謝的反饋調(diào)節(jié)方式有多種:v 順序反饋抑制（sequential feedback inhibition） v 同工酶的反饋抑制（isoenzyme feedback inhibition） v 協(xié)同反饋抑制（concerted feedback inhibition）

15、v 累積反饋抑制（cumulative feedback inhibition） v 超相加反饋抑制（cooperative feedback inhibition） 酶活性的調(diào)節(jié)（1）順序反饋抑制sequential feedback inhibition 分支代謝途徑中的兩個末端產(chǎn)物，不能直接抑制途徑中的第一個酶，只有當(dāng)兩個末端產(chǎn)物都過量時，才能對途徑中的第一個酶有抑制作用。酶活性的調(diào)節(jié)o 例如，枯草桿菌在芳香族氨基酸合成中，色氨酸(Try)抑制鄰氨基苯甲酸合成酶(AS)，苯丙氨酸(Phe)抑制預(yù)苯酸脫水酶(PT)，酪氨酸(Tyr)抑制預(yù)苯酸脫氫酶(PD)，預(yù)苯酸和分支酸又部分地抑制7-磷

16、酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸合成酶(DS)。PEP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：4-磷酸赤蘚糖；DAHP：7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸；CA：分支酸；Per：預(yù)苯酸；AA：鄰氨基苯甲酸；HPPA：對羥基苯丙酮酸；PPA：苯丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Try：色氨酸；Phe：苯丙氨酸；I：7-磷酸-2-酮-3-脫氧庚糖酸合成酶；II：鄰氨基苯甲酸合成酶；III：分支酸變位酶；IV：預(yù)苯酸脫氫酶；V：預(yù)苯酸脫水酶（2）同工酶的反饋抑制isoenzyme feedback inhibition 同功酶是指能催化同一生化反應(yīng)，但它們的結(jié)構(gòu)稍有不同，可分別被相應(yīng)的末端產(chǎn)物抑制的一類酶。其特點是：途徑中第一個反

17、應(yīng)被兩個不同的酶所催化，一個酶被H抑制，另一個酶被G抑制。只有當(dāng)H和G同時過量才能完全阻止A轉(zhuǎn)變?yōu)锽。o例如，大腸桿菌以天門冬氨酸為前體合成蘇氨酸(Thr)、異亮氨酸(Ileu)、甲硫氨酸(Met)和賴氨酸(Lys)的代謝途徑中有三種天門冬氨酸激酶的同功酶(AKI、AKII和AKIII)和兩種高絲氨酸脫氫酶的同功酶(HSDHI和HSDHII)。其中AKI和HSDHI受到蘇氨酸、異亮氨酸的反饋抑制和阻遏，AKII和HSDHII受甲硫氨酸的反饋抑制和阻遏；AKIII受賴氨酸的反饋抑制和阻遏。 （3）協(xié)同反饋抑制concerted feedback inhibition 在分支代謝系統(tǒng)中，幾種末端產(chǎn)

18、物同時都過量，才對途徑中的第一個酶具有抑制作用，如果末端產(chǎn)物單獨過量則對途徑中的第一個酶無抑制作用。o 例如，莢膜紅假單胞菌中天門冬氨酸族氨基酸生物合成途徑中，天門冬氨酸激酶(AK)是受末端產(chǎn)物賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制。（4）累積反饋抑制cumulative feedback inhibition 在分支代謝途徑中各種末端產(chǎn)物單獨過量時，它們各自能對途徑中的第一個反應(yīng)的酶僅產(chǎn)生較小的抑制作用。一種末端產(chǎn)物單獨過量并不影響其它末端產(chǎn)物的形成，只有當(dāng)幾種末端產(chǎn)物同時過量時，才對途徑中的第一個酶產(chǎn)生較大的抑制。酶活性的調(diào)節(jié)o 例如，大腸桿菌谷氨酰胺合成酶(GS)活性的調(diào)節(jié)是一個典型的累積反饋調(diào)節(jié)

19、的例子。谷氨酰胺由谷氨酸、銨和ATP合成。谷氨酰胺中的酰胺基是色氨酸、組氨酸、氨基甲酰磷酸、6-磷酸葡萄糖胺、CTP、AMP、GMP等化合物生物合成過程中的氮源。谷氨酰胺合成酶被谷氨酰胺代謝的每種末端產(chǎn)物以及丙氨酸和甘氨酸所累積抑制。谷氨酰胺合成酶對這些抑制物中的每一種末端產(chǎn)物均有特異的結(jié)合部位。當(dāng)上述8種末端產(chǎn)物同時過量都與酶結(jié)合時，谷氨酰胺合成酶的活性將受到最大的抑制。（5）超相加反饋抑制cooperative feedback inhibition 超相加反饋抑制是一種既不同于協(xié)同反饋抑制又不同于累積反饋抑制。對一個分支代謝途徑中，幾種末端產(chǎn)物單獨過量時，僅產(chǎn)生對共同途徑的第一個酶部分的

20、抑制。如果每種末端產(chǎn)物都過量時，其抑制作用則超過各種末端產(chǎn)物單獨過量時抑制的總和。酶活性的調(diào)節(jié)o例如，在嘌呤核苷酸的生物合成途徑中，催化第一步反應(yīng)的酶，5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的酰胺基轉(zhuǎn)移酶，可被各種嘌呤核苷酸產(chǎn)物(如AMP、GMP)所抑制。例如，一定量的GMP或AMP僅能抑制5-磷酸核糖-1-焦磷酸酰胺基轉(zhuǎn)移酶活力的10，而當(dāng)二者混合時，則可抑制其酶活力的50。因為這些嘌呤核苷酸與5-磷酸核糖-1-焦磷酸并無結(jié)構(gòu)相似性，又因該酶是一種調(diào)節(jié)酶，GMP和AMP可能分別結(jié)合在該酶的不同部位上。 5.酶活性調(diào)節(jié)的分子機制 解釋酶活性調(diào)節(jié)機制的理論：v 別構(gòu)調(diào)節(jié)理論(其核心是酶分子構(gòu)象的改

21、變)v 酶分子的化學(xué)修飾理論(其核心是酶分子結(jié)構(gòu)的改變)。酶活性的調(diào)節(jié)四、初級代謝的調(diào)節(jié)Regulation of Primary Metabolism 產(chǎn)能代謝的調(diào)節(jié)：能荷調(diào)節(jié)(Energy Charge Regulation) 核蛋白體合成的調(diào)節(jié)（Regulation of Ribosome Synthesis） 氨基酸、核苷酸合成代謝的調(diào)節(jié)（Regulation of amino acids and nucleotidemetabolism）能荷調(diào)節(jié)(Energy Charge Regulation)o 能荷：能荷：即指細胞中ATP、ADP、AMP系統(tǒng)中可為代謝反應(yīng)供能的高能磷酸鍵的量度

22、o 能荷的大小與細胞中ATP、ADP和AMP的相對含量有關(guān)。當(dāng)細胞中全部腺苷酸均以ATP形式存在時，則能荷最大，為100%，即能荷為滿載。當(dāng)全部以AMP形式存在時，則能荷最小，為零。當(dāng)全部以ADP形式存在時，能荷居中，為50%。若三者并存時，能荷則隨三者含量的比例不同而表現(xiàn)不同的百分值。能荷調(diào)節(jié)(Energy Charge Regulation)o 研究證明，細胞中能荷高時，抑制了ATP的生成，但促進了ATP的利用，也就是說，高能荷可促進分解代謝，并抑制合成代謝。相反，低能荷則促進合成代謝，抑制分解代謝。o 能荷調(diào)節(jié)是通過ATP、ADP和AMP分子對某些酶分子進行變構(gòu)調(diào)節(jié)進行的。例如糖酵解中，

23、磷酸果糖激酶是一個關(guān)鍵酶，它受ATP的強烈抑制，但受ADP和AMP促進。丙酮酸激酶也是如此。在三羧酸環(huán)中，丙酮酸脫氫酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶和-酮戊二酸脫氫酶等，都受ATP的抑制和ADP的促進。呼吸鏈的氧化磷酸化速度同樣受ATP抑制和ADP促進。 五、次級代謝的調(diào)節(jié)Regulation of Secondary Metabolism 初級代謝對次級代謝的調(diào)節(jié) 碳代謝物的調(diào)節(jié)作用 氮代謝物的調(diào)節(jié)作用 磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用 次級代謝中的誘導(dǎo)作用及產(chǎn)物的反饋作用 次級代謝中細胞膜透性調(diào)節(jié)初級代謝對次級代謝的調(diào)節(jié)o 許多次級代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)是由少數(shù)幾種初級代謝產(chǎn)物構(gòu)成的，所以次級代謝產(chǎn)物是以初級

24、代謝產(chǎn)物為母體衍生出來的，次級代謝途徑并不是獨立的，而是與初級代謝途徑有密切關(guān)系的。因此次級代謝必然會受到初級代謝的調(diào)節(jié)。o 例如青霉素的合成會受到賴氨酸的強烈抑制，而賴氨酸合成的前體 a- 氨基己二酸可以緩解賴氨酸的抑制作用，并能刺激青霉素的合成。這是因為 a- 氨基己二酸是合成青霉素和賴氨酸的共同前體。如果賴氨酸過量，它就會抑制這個反應(yīng)途徑中的第一個酶，減少 a- 氨基己二酸的產(chǎn)量，從而進一步影響青霉素的合成。碳源代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)碳源代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)o 碳分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)指能迅速被利用的碳源(葡萄糖)或其分解代謝產(chǎn)物，對其他代謝中的酶(包括分解酶和合成酶)的調(diào)節(jié)。分為分解產(chǎn)物阻遏和抑制兩種。o

25、 葡萄糖是菌體生長良好的碳源和能源，但對青霉素、頭孢菌素、卡那霉素、新霉素、絲裂霉素等都有明顯降低產(chǎn)量的作用。氮代謝物的調(diào)節(jié)作用o 在次級代謝中，氮分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)，即被迅速利用的氮源(氨)抑制作用于含底物的酶(蛋白酶、硝酸鹽還原酶、酰胺酶、脲酶、組氨酸酶)的合成。在次級代謝中，其阻遏作用也確實存在。在抗生素生產(chǎn)中使用黃豆餅粉就是由于它緩慢分解成有阻遏作用的氨基酸和氨，防止或減弱氮分解代謝產(chǎn)物阻遏作用的結(jié)果。磷酸鹽的調(diào)節(jié)磷酸鹽的調(diào)節(jié)o 磷酸鹽不僅是菌體生長的主要限制性營養(yǎng)成分，還是調(diào)節(jié)抗生素生物合成的重要參數(shù)。其機制按效應(yīng)劑說有直接作用，即磷酸鹽自身影響抗生素合成，和間接作用，即磷酸鹽調(diào)節(jié)胞內(nèi)

26、其他效應(yīng)劑(如ATP、腺苷酸能量負荷和cAMP)，進而影響抗生素合成。o 已發(fā)現(xiàn)過量磷酸鹽對四環(huán)素、氨基糖苷類和多烯大環(huán)內(nèi)酯等32種抗生素的合成產(chǎn)生阻抑作用。細胞膜透性的調(diào)節(jié)細胞膜透性的調(diào)節(jié)o 外界物質(zhì)的吸收或代謝產(chǎn)物的分泌都需經(jīng)細胞膜的運輸，如發(fā)生障礙，則胞內(nèi)合成代謝物不能分泌出來，影響發(fā)酵產(chǎn)物收獲，或胞外營養(yǎng)物不能進入胞內(nèi)，也影響產(chǎn)物合成，使產(chǎn)量下降。o 如在青霉素發(fā)酵中，產(chǎn)生菌細胞膜輸入硫化物能力的大小影響青霉素發(fā)酵單位的高低。如果輸入硫化物能力增加，硫源供應(yīng)允足，合成青霉素的量就增多。第六節(jié) 微生物代謝產(chǎn)物的過量產(chǎn)生o 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法o 提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法o 高濃度

27、微生物的培養(yǎng)一、提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法 1，使用誘導(dǎo)物o 水解酶類大都屬誘導(dǎo)酶類，因此向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物就會增加胞外酶的產(chǎn)量。如加入槐糖(1，2-D-葡二糖)誘導(dǎo)木霉菌的纖維素酶的生成，木糖誘導(dǎo)半纖維素酶和葡萄糖異構(gòu)酶的生成等。o 誘導(dǎo)物的濃度過高及能被迅速利用時，會發(fā)生酶合成的阻遏，這在纖維二糖對纖維素酶的產(chǎn)生，木二糖對半纖維素酶產(chǎn)生中都己觀察到，這也是使用誘導(dǎo)物時應(yīng)予注意的。 2，除去誘導(dǎo)物選育組成型產(chǎn)生菌o 在發(fā)酵工業(yè)中，要選擇到一種廉價、高效的誘導(dǎo)物是不容易的，分批限量加入誘導(dǎo)物在工藝上也多不便，更為有效的方法是改變菌株的遺傳特性，除去對誘導(dǎo)物的需要，即選育組成型突變株。o 通過

28、誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，都可達到此目的。 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法o 設(shè)計選育組成型突變株的方法的原則是創(chuàng)造一種利于組成型菌株生長而不利于誘導(dǎo)型菌株生長的培養(yǎng)條件，造成對組成型的選擇優(yōu)勢以及適當(dāng)?shù)淖R別兩類菌落的方法，從而把產(chǎn)生的組成型突變株選擇出來。n 連續(xù)培養(yǎng)法 n 交替培養(yǎng)法o 在平板上識別組成型突變株的方法：透明圈、變色圈。 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法3，降低分解代謝產(chǎn)物濃度，減少阻遏的發(fā)生o 高分子的多糖類、蛋白質(zhì)等的分解代謝產(chǎn)物(如能被迅速利用的單糖、氨基酸以及脂肪酸、磷酸鹽等)都會阻遏分解其聚合物的水解酶類的

29、生成。因此用限量流加這類物質(zhì)或改用難以被水解的底物的方法，都可減少阻遏作用的發(fā)生，而獲得較高的酶產(chǎn)量。 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法4，解除分解代謝阻遏篩選抗分解代謝阻遏突變株 o 從遺傳學(xué)角度來考慮，如調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白失活；不能與末端分解代謝產(chǎn)物結(jié)合，或操縱基因發(fā)生突變使阻遏蛋白不能與其結(jié)合，都能獲得抗分解代謝阻遏的突變株。前者為隱性突變，后者為顯性突變，都能由此導(dǎo)致酶的過量產(chǎn)生。提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法o 可以直接以末端代謝產(chǎn)物為底物來篩選抗阻遏突變株，如以葡萄糖、甘油為碳源篩選纖維系酶抗阻遏突變株。o 更多地是利用選育結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株的方法。選育結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株的方

30、法所依據(jù)的機制是：結(jié)構(gòu)類似物由于在分子結(jié)構(gòu)上與分解代謝的未端產(chǎn)物相類似，因此、它也能與阻遏蛋白相結(jié)合，如調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變而使阻遏蛋白不能與結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合，即出現(xiàn)抗性菌株。由于分子結(jié)構(gòu)上的類似，這種抗性菌株產(chǎn)生的阻遏蛋白也不能與正常的分解代謝產(chǎn)物相結(jié)合，即同時也具有對相應(yīng)的分解代謝產(chǎn)物阻遏作用的抗性，而能導(dǎo)致相應(yīng)酶類的過量生產(chǎn)。 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法結(jié)構(gòu)類似物及代謝末端產(chǎn)物 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法5，解除反饋抑制篩選抗反饋抑制突變株o 選育對末端產(chǎn)物有抗性的突變株n 如天冬氨酸激酶是賴氨酸生物合成途徑中的調(diào)節(jié)酶，由黃色短桿菌分離到對賴氨酸的類似物(2-氨基半胱氨酸)有抗性的突變株，它對

31、天冬氨酸激酶的反饋抑制不敏感，賴氨酸的產(chǎn)量可達57mgm1。 o 選育營養(yǎng)缺陷型n 如谷氨酸經(jīng)過乙酰谷氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸而合成精氨酸。選育精氨酸缺陷型，就能得到瓜氨酸的過量生產(chǎn)。 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法6，防止回復(fù)突變的產(chǎn)生和篩選負變菌株的回復(fù)突變株o 選育雙重營養(yǎng)缺陷型；o 可在培養(yǎng)液中加入適量結(jié)構(gòu)類似物，以防止抗結(jié)構(gòu)類似物的高產(chǎn)菌株的回復(fù)突變株的增殖；o 利用高產(chǎn)株和回復(fù)突變株對抗生素敏感性的不同，加適量抗生素防止回復(fù)株增殖 ；o 負變菌株的回復(fù)突變株可用來提高代謝產(chǎn)物的過量產(chǎn)生。 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法7，改變細胞膜的通透性 o 微生物細胞吸收作為代謝所需要的底物和離子是依靠定

32、位在細胞膜上的主動輸送系統(tǒng)來進行，與產(chǎn)能代謝過程相偶聯(lián)。輸送系統(tǒng)有高度的專一性，這主要取決于其蛋白質(zhì)的組成，即透性酶。 o 細胞內(nèi)形成的代謝產(chǎn)物排出細胞時，也與細胞膜的結(jié)構(gòu)有關(guān)。當(dāng)控制物理、化學(xué)條件或者篩選細胞膜、細胞壁結(jié)構(gòu)組成的突變株以改進物質(zhì)的進出速率。影響代謝過程時，都有可能造成代謝產(chǎn)物的過量生產(chǎn)。 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法8，篩選抗生素抗性突變株 o 抗生素種類繁多，其抑制微生物代謝的機制各不相同，一些主要抗生素的作用機制已比較清楚。篩選抗生素抗性突變體，也能取得由此而改變代謝調(diào)節(jié)，獲得過量生產(chǎn)的結(jié)果。 n衣霉素可抑制細胞膜糖蛋白的生成?？莶輻U菌的衣霉素抗性突變株的-淀粉酶的產(chǎn)量較親

33、株提高了5倍（分泌機制改變的結(jié)果）n抗利福平的蠟狀芽抱桿菌的無芽孢突變株的-淀粉酶產(chǎn)量提高了7倍（芽孢形成的延遲利于-淀粉酶的形成，而抗利福平的突變株往往失去了形成芽抱的能力 ） 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法9，選育條件抗性突變株 o 因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為“野生型”菌株的特性和突變型菌株特性的突變被稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。其中溫度敏感型突變常被用于提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。n適于在中溫條件下(如37C左右)生長的細菌，經(jīng)誘變后可得到在較低溫度下生長而在較高溫度(如37C以上)不能生長的突變株，即溫度敏感型突變株。這是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)改變后，在高溫條件下活力喪失的緣故。如此酶為蛋白質(zhì)、核苷

34、合成途徑上的酶，則此突變株在高溫條件下的表型就是營養(yǎng)缺陷型。 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法10，調(diào)節(jié)生長速率o 在酶的誘導(dǎo)合成研究中發(fā)現(xiàn)，一些物質(zhì)具有誘導(dǎo)效應(yīng)及難被利用；與其只能維持較低的生長速率有關(guān)。而起阻遏作用的物質(zhì)則都是易被迅速利用和能維持高的生長速率。估計這是因為誘導(dǎo)、阻遏的發(fā)生都與產(chǎn)能代謝有關(guān)而造成的。因此，改變培養(yǎng)條件如溫度、供氧量等以控制生長速率，也能獲得一定效果。 n里氏木霉纖維素酶的大量合成是在菌體大量形成時，如控制它的比生長速率近于零，則能在一較長時間內(nèi)持續(xù)合成纖維素酶并獲得高產(chǎn)。 提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法11， 加入酶的競爭性抑制劑 o 生物化學(xué)上把底物和抑制劑與酶相結(jié)合

35、時呈現(xiàn)的互相排斥現(xiàn)象稱為競爭性抑制，即酶與抑制劑結(jié)合后就不能與底物相結(jié)合，反之亦然。 n葡萄糖經(jīng)不完全氧化(酵解)生成丙酮酸，脫羧生成乙酰輔酶A，進入TCA循環(huán)。乙酰輔酶A與草酰乙酸經(jīng)檸檬酸合成酶催化，把乙?；梢阴］o酶A轉(zhuǎn)移至草酰乙酸而成為檸檬酸。檸檬酸又因烏頭酸酶的存在而和它的異構(gòu)體順烏頭酸、異檸檬酸呈平衡。單氟乙酸在微生物細胞內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏鷻幟仕?，此酸與烏頭酸酶有競爭性抑制，因此，向培養(yǎng)基中加入單氟乙酸可導(dǎo)致檸檬酸的積累，減少異檸檬酸的生成。由此，篩選不能利用檸檬酸或?qū)畏宜崦舾械耐蛔円m，都達到了提高檸檬酸產(chǎn)量和減少異檸檬酸生成的結(jié)果。這些突變株的烏頭酸酶的活力都比較低。 提高初級代謝

36、產(chǎn)物產(chǎn)量的方法二、提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法1，次級代謝物合成的特點，次級代謝物合成的特點 次級代謝物合成過程遠較初級代謝產(chǎn)物復(fù)雜； 次級代謝產(chǎn)物則需要復(fù)雜的營養(yǎng)條件； 在分批培養(yǎng)條件下，次級代謝產(chǎn)物一般都是在菌體生長的峰值出現(xiàn)后才大量合成。 2，常用的提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法 提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法1，補加前體類似物o 在合成途徑已基本清楚的條件下，向發(fā)酵培養(yǎng)基中補加前體是增加次級產(chǎn)物的有效方法。n如青霉素G的生產(chǎn)中，苯乙酰-CoA是限速性因子，補加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的產(chǎn)量。 o 次級代謝產(chǎn)物形成中并不是所有前體類似物都是限制性因子。加入前體提高產(chǎn)量的效果更取決于總體代謝

37、的調(diào)節(jié)水平。前體物質(zhì)本身是否易于得到等。這都是在生產(chǎn)應(yīng)用中需綜合考慮的。 提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法2，加入誘導(dǎo)物o 把一些對次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生有誘導(dǎo)作用的物質(zhì)加入發(fā)酵培養(yǎng)基中會增加產(chǎn)量。n 如加蛋氨酸或硫脲可使頂頭孢霉增產(chǎn)頭孢霉素C，加入巴比妥可提高利福霉素產(chǎn)量等。但在工業(yè)生產(chǎn)中還未普遍應(yīng)用此技術(shù)，而只是在選擇培養(yǎng)基組成時給以考慮。 3，防止碳分解代謝阻遏或抑制的發(fā)生o 青霉素發(fā)酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以減少碳分解阻遏的發(fā)生，是一項很有效的提高產(chǎn)量的方法。 o 使用寡糖、多糖等緩慢利用的碳源，葡萄糖與麥芽糖、葡萄糖與蔗糖、葡萄糖與淀粉混合碳源的利用，也都能減少碳分解阻遏的發(fā)生。o 加入影響

38、糖代謝的硫氰酸芐酯可使金霉菌對葡萄糖的利用速度減緩，可增加金霉素的產(chǎn)量。 提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法4，防止氮代謝阻遏的發(fā)生o 避免使用高濃度的銨鹽做氮源以防止氮代謝阻遏的發(fā)生，是抗生素發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中比較成熟的經(jīng)驗。在抗生素產(chǎn)生期如補加氮源則會造成發(fā)酵逆轉(zhuǎn)，返回生長期，抗生素的產(chǎn)量會大為減少。o 使用亞適量(對菌體生長)的磷酸鹽，亦是抗生素發(fā)酵工業(yè)中遵循的原則之一。 o 為防止氮、磷分解阻遏的發(fā)生，應(yīng)選用黃豆餅粉、蛋白胨類物質(zhì)為主要原料，而盡量少用易被迅速利用的無機氮源。 提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法5，篩選耐前體或前體類似物的突變株o 加入前體有提高次級產(chǎn)物產(chǎn)量的效果；但過量對菌體又會有毒。篩

39、選對前體抗性的突變株以減少或消除前體的反饋阻遏，從而可獲得高產(chǎn)。n 如抗苯乙酸的青霉突變株，其青霉素的產(chǎn)量會增加。n 半胱氨酸、纈氨酸是-內(nèi)酰胺類抗生素的前體，篩選上述氨基酸的結(jié)構(gòu)類似物，三氟亮氨酸、D-纈氨酸的抗性菌株，其-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)量會提高。 提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法6，選育抗抗生素突變株o 鏈霉素、氯霉素、金霉素籌多種抗生素都具有抑制產(chǎn)生自身菌體蛋白質(zhì)的能力。一株高產(chǎn)抗生素產(chǎn)生菌，必然應(yīng)具備對自身所分泌的抗生素的抗性。篩選抗抗生素產(chǎn)生菌也就成了菌種選育中的常用方法。金霉素、鏈霉素產(chǎn)生菌的抗性菌株產(chǎn)量有數(shù)倍增加的實驗室結(jié)果已有不少報道。 提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法7，篩選營養(yǎng)缺陷型

40、的回復(fù)突變株o 次級代謝產(chǎn)物都來自初級代謝產(chǎn)物，因此其營養(yǎng)缺陷型的產(chǎn)量一般都很低，但其回復(fù)突變型中卻有不少獲得高產(chǎn)的例子，其機制尚不清楚，估計是次級代謝產(chǎn)物或其前體合成的反饋抑制被解除。在金霉素產(chǎn)生菌選育中，運用此方法曾獲得高產(chǎn)菌株。 提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法8，抗毒性突變株的選育o 重金屬離子、羥胺類物質(zhì)對-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生菌有毒，但與抗生素相結(jié)合可解毒。選擇適當(dāng)濃度的此類毒性物質(zhì)使其恰好抑制產(chǎn)生菌生長，在此條件下能生長的菌株，應(yīng)為抗生素類物質(zhì)過量產(chǎn)生的突變株。曾由頭孢霉素C對重金屬離子的抗性突變株中選育到高產(chǎn)菌株。 提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法o 以上主要是從微生物的代謝調(diào)節(jié)機制出發(fā)探討獲得代謝產(chǎn)物過量生產(chǎn)的方法。但是，微生物代謝產(chǎn)物特別是次級產(chǎn)物形成的途徑和調(diào)節(jié)控制機制是相當(dāng)復(fù)雜的，研究得比較清楚的只是少數(shù)。因此，上述方法的應(yīng)用往往也是經(jīng)驗性的。 o 在生產(chǎn)實踐中為提高微生物產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)經(jīng)常使用的方法是誘變后隨機篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化。近年來運用遺傳工程的方法以獲得代謝產(chǎn)物的過量生產(chǎn)是很活躍的研究領(lǐng)域。 三、高濃度微生物的培養(yǎng) o 1，為什么要采用高濃度微生物的培養(yǎng)？o微生物液體發(fā)酵大