微生物大小及數(shù)量的測(cè)定

1、 山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2014年 11月 30 日姓名 班級(jí) 13級(jí)生命基地班 學(xué)號(hào) 同組者： 科目 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 微生物大小及數(shù)量的測(cè)定 組別 3【實(shí)驗(yàn)題目】 微生物大小及數(shù)量的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 了解顯微鏡測(cè)定微生物大小與血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物數(shù)量的原理。2. 學(xué)習(xí)并掌握顯微鏡下測(cè)定微生物細(xì)胞大小的技術(shù)，包括目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺的校正技術(shù)與測(cè)定細(xì)胞大小的技術(shù)。3. 了解血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)，學(xué)習(xí)并掌握血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)微生物數(shù)量的技術(shù)，包括樣品的點(diǎn)樣、菌數(shù)計(jì)數(shù)的方法與計(jì)算?！緦?shí)驗(yàn)器材】1、 菌種： 酵母菌液，枯草芽孢桿菌2、試劑：  結(jié)晶紫，蒸餾水，香柏油，二甲苯等3、 儀器和用具

2、：  顯微鏡，目鏡測(cè)微尺，鏡臺(tái)測(cè)微尺，血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片、吸水紙、計(jì)數(shù)器、滴管、擦鏡 紙，酒精燈等【實(shí)驗(yàn)原理】 一、微生物大小的測(cè)定1、 測(cè)微尺的構(gòu)造 微生物細(xì)胞的大小，是微生物重要的形態(tài)特征之一，也是分類(lèi)鑒定的依據(jù)之一。由于菌體很小、只能在顯微鏡下來(lái)測(cè)量。顯微鏡測(cè)微尺是由目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)接物測(cè)微尺組成。目鏡測(cè)微尺 圖1 目鏡測(cè)微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在 5mm 刻尺上分 50 份，或把10 mm長(zhǎng)度刻成100等分。測(cè)量時(shí)，將其放在接目鏡中的隔板上(此處正好與物鏡放大的中間像重疊)來(lái)測(cè)量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測(cè)微尺每

3、格實(shí)際表示的長(zhǎng)度也不一樣，因此目鏡測(cè)微尺測(cè)量微生物大小時(shí)須先用置于鏡臺(tái)上的鏡臺(tái)測(cè)微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測(cè)微尺每小格所代表的相對(duì)長(zhǎng)度。鏡臺(tái)測(cè)微尺鏡臺(tái)測(cè)微尺是中央部分刻有精確等分線(xiàn)的載玻片，一般將lmm等分為100格，每格長(zhǎng)l0m（即0.0lmm），是專(zhuān)門(mén)用來(lái)校正目鏡測(cè)微尺的。校正時(shí)，將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在載物臺(tái)上，由于鏡臺(tái)測(cè)微尺與細(xì)胞標(biāo)本是處于同一位置，都要經(jīng)過(guò)物鏡和目鏡的兩次放大成象進(jìn)入視野，即鏡臺(tái)測(cè)微尺隨著顯微鏡總放大倍數(shù)的放大而放大，因此從鏡臺(tái)測(cè)微尺上得到的讀數(shù)就是細(xì)胞的真實(shí)大小，所以用鏡臺(tái)測(cè)微尺的已知長(zhǎng)度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測(cè)微尺，即可求出目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度，然后移

4、去鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上待測(cè)標(biāo)本片，用校正好的目鏡測(cè)微尺在同樣放大倍數(shù)下測(cè)量微生物大小。目鏡測(cè)微尺鏡臺(tái)測(cè)微尺 圖2： 目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺的校準(zhǔn)2、 球菌用直徑表示大小；桿菌用寬和長(zhǎng)來(lái)表示。2、 血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物數(shù)量鏡檢計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球計(jì)數(shù)板；一般細(xì)菌則采用彼得羅夫·霍澤(Petroff Hausser)細(xì)菌計(jì)數(shù)板。兩種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，故細(xì)菌不易看清。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間

5、的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)方格網(wǎng)(圖3)。每個(gè)方格網(wǎng)共分9大格，其中間的一大格(又稱(chēng)為計(jì)數(shù)室)常被用作微生物的計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即每個(gè)大方格都由400個(gè)小方格組成(圖4)。 每個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，每個(gè)小方格的面積為1400mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計(jì)數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室(大方格)的體積為0.1mm3，每個(gè)小方格的

6、體積為l4000mm3。計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。 以25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例，設(shè)5個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，則：1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個(gè)）同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B（個(gè)）       

7、60;  圖3 血球計(jì)數(shù)扳的構(gòu)造a. 平面圖(中間平臺(tái)分為兩半，各半邊有一個(gè)方格網(wǎng))b. 側(cè)面圖(中間平臺(tái)與蓋玻片之間有高度為0.1毫米的間隙) c. 圖4 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)網(wǎng)的分區(qū)和分格【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟】1、目鏡測(cè)微尺的校正  把目鏡的上透鏡旋下（CX20、CX21型號(hào)顯微鏡），將目鏡測(cè)微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)完全重合的刻度，計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目

8、鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)。因?yàn)殓R臺(tái)測(cè)微尺的刻度每格長(zhǎng)l0m，所以由下列公式可以算出目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度。 兩重合線(xiàn)間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)×10 目測(cè)尺每格長(zhǎng)度（um）= 兩重合線(xiàn)間目鏡測(cè)微尺格數(shù)  用此法分別校正在物鏡倍數(shù)為10×，40×，100×下目鏡測(cè)微尺每小格所代表的長(zhǎng)度。由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測(cè)微尺必須針對(duì)特定的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長(zhǎng)度）進(jìn)行，而且只能在特定的情況下重復(fù)使用，當(dāng)更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須重新校正目鏡測(cè)微尺每一格所代表的長(zhǎng)度。2、細(xì)胞大小的測(cè)定A. 酵母

9、菌的大小測(cè)定1) 取一滴酵母菌菌懸液制成水浸片。2) 移去鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測(cè)微尺來(lái)測(cè)量酵母菌菌體的直徑占幾格（不足一格的部分估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后一位數(shù)）。測(cè)出的格數(shù)乘上目鏡測(cè)微尺每格的校正值，即等于該菌的直徑。3）選取普遍大小的酵母菌菌體進(jìn)行測(cè)量，記錄三組數(shù)據(jù)，取平均值。B. 枯草芽孢桿菌的大小測(cè)定1) 將載玻片洗凈晾干后，在其中央滴一滴蒸餾水，然后通過(guò)無(wú)菌操作用接種針取少量枯草芽孢桿菌的斜面培養(yǎng)物于蒸餾水中，然后干燥2) 單染色用結(jié)晶紫染液對(duì)其進(jìn)行單染色：流程如下：加熱、固定、干燥洗片、干燥涂片染色水洗干燥鏡檢 3) 置于顯微鏡下鏡檢，用目

10、鏡測(cè)微尺測(cè)量枯草芽孢桿菌的長(zhǎng)和寬，測(cè)量菌體大小時(shí)要在同一個(gè)標(biāo)本片上測(cè)定3個(gè)大小相近的菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。而且一般是用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體進(jìn)行測(cè)定。3. 酵母菌菌懸液中酵母菌數(shù)量的測(cè)定1) 如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過(guò)多，難以數(shù)清，應(yīng)當(dāng)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋以便于酵母菌的計(jì)數(shù)。具體方法是：搖勻試管，取1mL酵母菌培養(yǎng)液，加入成倍的無(wú)菌水稀釋?zhuān)♂宯倍后，再用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，所得數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)。（本次實(shí)驗(yàn)中稀釋倍數(shù)為10倍）2) 取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)室上蓋上一塊蓋玻片。3) 將酵母菌菌懸液充分搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的右上角滴入一小滴(不宜過(guò)多)，

11、使菌液沿兩玻片間自行滲入計(jì)數(shù)室，勿使產(chǎn)生氣泡，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌液。4) 先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。5) 計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)由16個(gè)中方格組成，按對(duì)角線(xiàn)方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)中方格（即100小格）的菌數(shù)。如為25個(gè)中方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)大方格外，還需數(shù)中央l個(gè)大方格的菌數(shù)（即80個(gè)小格）。 6) 由于菌體在計(jì)數(shù)室中處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而觀察時(shí)必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)螺旋，方能數(shù)到全部菌體，防止遺漏。7) 如菌體位于中格的雙線(xiàn)上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線(xiàn)不數(shù)下線(xiàn)，數(shù)左線(xiàn)不數(shù)右線(xiàn)，以減少誤差。8) 凡酵母菌的芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí)

12、，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。若計(jì)數(shù)時(shí)不計(jì)芽體，最后要在結(jié)果中標(biāo)明。49) 計(jì)算1ml菌液中菌數(shù)公式：×25（或16）× 10 × B酵母菌菌數(shù)/ml= A 5 A:5個(gè)中方格菌數(shù)和 B:稀釋倍數(shù)10) 血球計(jì)數(shù)板使用后，用自來(lái)水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95%的乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過(guò)鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】 1、目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定結(jié)果 物鏡倍數(shù)（目鏡均為10倍） 目鏡測(cè)微尺的格數(shù) （小格）鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)（小格）目鏡測(cè)微尺的每格的長(zhǎng)度（um）10倍

13、81809.8840倍 85212.47100倍 6160.982、 酵母菌的大小測(cè)定結(jié)果酵母菌菌號(hào)10倍鏡觀察結(jié)果目鏡測(cè)微尺格數(shù)直徑長(zhǎng)度um（長(zhǎng)軸） 10.87.9020.87.9030.87.90 平均值0.87.90 酵母菌菌號(hào)40倍鏡觀察結(jié)果目鏡測(cè)微尺格數(shù)直徑長(zhǎng)度um（長(zhǎng)軸） 43.07.4153.27.9063.17.66 平均值3.17.663、 枯草芽孢桿菌大小的測(cè)定（10×100）枯草芽孢桿菌菌號(hào)目鏡測(cè)微尺格數(shù)實(shí)際長(zhǎng)度um長(zhǎng)寬長(zhǎng)寬130.82.940.7822.90.72.840.6933.60.83.530.78平均值3.20.83.100.75 枯草芽孢桿菌大小平

14、均值 = 3.10 × 0.75 um²4、 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定酵母菌數(shù)量結(jié)果（25×16）實(shí)驗(yàn)次數(shù)每個(gè)方格中酵母菌菌數(shù)（芽孢不計(jì)入計(jì)數(shù)范圍）總菌數(shù)稀釋倍數(shù)81ml菌液菌數(shù)(個(gè)）157.66454.460.857.6294.4101.472×10【實(shí)驗(yàn)小結(jié)】在實(shí)驗(yàn)操作中，值得注意的地方：從容器中吸出酵母菌菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)之前，要將其輕輕震蕩幾下，這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀， 能提高計(jì)數(shù)的代表性和準(zhǔn)確性，使求得的培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量誤差減小。另外在滴加菌懸液和壓片的時(shí)候更要仔細(xì)小心，避免計(jì)數(shù)室有氣泡產(chǎn)生。計(jì)數(shù)時(shí)，由于菌體在計(jì)數(shù)室中處于不同的空間位置

15、，要在不同的焦距下才能看到，因而觀察時(shí)必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)螺旋，方能數(shù)到全部菌體，防止遺漏。此外，在測(cè)量菌體大小時(shí)，由于細(xì)菌個(gè)體微小，應(yīng)盡量使用油鏡觀察測(cè)量，以減少誤差，在選擇測(cè)量菌體對(duì)象時(shí)，應(yīng)選取普遍大小的菌體進(jìn)行測(cè)量，一般選取三個(gè)不同菌體取其平均值。最后，在觀察結(jié)束后不能忘記將油鏡鏡頭擦拭干凈?！舅伎寂c討論】1 為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時(shí)必須重新用鏡臺(tái)測(cè)微尺對(duì)目鏡微尺進(jìn)行標(biāo)定?答： 由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測(cè)微尺必須針對(duì)特定的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長(zhǎng)度）進(jìn)行，而且只能在特定的情況下重復(fù)使用，當(dāng)更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須重新校正目鏡測(cè)微尺每一格所代表的長(zhǎng)度。比如：10X的目鏡，4X的物鏡，總的放大倍數(shù)是40X，長(zhǎng)度是5mm?，F(xiàn)在把物鏡換成10X，總的放大倍數(shù)是100X，長(zhǎng)度也會(huì)因此而增長(zhǎng)，所以要重新定標(biāo)。2 若目鏡不變，目鏡測(cè)微尺也不變，只改變物鏡，那么目鏡測(cè)微尺每格所測(cè)量的鏡臺(tái)上的菌體細(xì)胞的實(shí)際長(zhǎng)度（或?qū)挾龋┦欠裣嗤?為什么?答： 不相同，因?yàn)槟跨R測(cè)微尺上讀的數(shù)值實(shí)際是目鏡和物鏡共同放大后的結(jié)果，現(xiàn)在物鏡改變，數(shù)值改變。3血球計(jì)