IgA腎病小鼠模型的建立與鑒定

1、xx年新教師個人總結(jié)（二）一年的工作生涯即將宣告結(jié)束，作為實習(xí)期的一年就這 樣很快的過去。從作為學(xué)生的校園轉(zhuǎn)到這個作為教師的校園, 角色發(fā)生了轉(zhuǎn)變，性質(zhì)也發(fā)生了轉(zhuǎn)變。這突然的轉(zhuǎn)變當(dāng)然起 先也有過不適應(yīng)，有過埋怨，有過失敗，但更多的是收獲， 收獲了經(jīng)驗，收獲了從理論轉(zhuǎn)化為實踐的體驗，收獲了與學(xué) 生的情感。在與學(xué)生一年的相處中，體味到了做老師的滋味， 真的是五味雜陳，悲喜交加。這一年，學(xué)校讓察腎小球系膜細胞及基質(zhì)變化；電鏡法 檢測系膜區(qū)有無電子致密物沉積；免疫熒光法觀察系膜區(qū) iga沉積情況。結(jié)果第1 2周末，模型組小鼠均出現(xiàn)不同程 度的血尿；scr、bun較正常對照組顯著增高（p【關(guān)鍵詞】iga

2、 腎病;模型；血尿；免疫熒光;小鼠abstrac t：objectivetoestab lishmousemodelofiganephropathyinorde ntbasisfortheclini phropathy. methods3 ndomlyassignedinto 10)andthemodelgrou ofiganephropathywa ethodoforalintakeo n(bsa)togetherwithrtoprovideexperime calresearchofigane okunmingmicewerera thecontrolgroup(n= p (n二20).

3、mousemodel sestablishedbythem fbovineserumalbumi injectionofstaphylococcusenterotoxin vein. attheendofthe wasgatheredfortheq ematuria；bloodwast sinusaftereyeballe inetheserumcreatin eanitrogen (bun)；th lcellsandmatrixint vedbylightmicrosco opywasemployedtode depositsinthemesan sionofigadepositio nof

4、luorescencestai area resultsbythee eredifferentdegree lgroupmice bunands upweresignificant1 rmalcontrolgroup(p pathy；model；hematu ncestaining；miceb (seb)viathecaudal 12weeks,freshurine uantitativetestofh akenthroughorbital xtirpationtodeterm ine (scr)andbloodur echangesofmesangia hekidneyswereobser

5、py；electronmicrosc tectelectron-dense gialarea；theexpres nwasmeasuredbyimmu ninginthemesangial ndof12weeks,therew sofhematuriainmode crlevelsinmodelgro yhigherthanintheno keywords：iganephro ria；immunofluoreseiga腎病世界范圍內(nèi)廣發(fā)的一種系膜增生型腎小球腎炎, 占原發(fā)性腎小球疾病的1 0%20%,中國、日本、新加坡等 發(fā)病率較高，其中有20%30%的患者進展到腎衰1。建立 與人類臨床病理生

6、理相似的iga腎病動物模型，對研究iga 腎病的發(fā)病機理、臨床治療等具有重要的作用。本實驗采用 口服牛血清白蛋白聯(lián)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素的方法 制作iga腎病小鼠模型，為進一步探索iga腎病提供實驗依 據(jù)。1材料和方法實驗材料實驗動物昆明種小鼠30只，鼠齡（10-12）周，體重20 26g,雄性，動物編號scxk（蘇）xx-0005,由徐州醫(yī)學(xué)院實驗 動物中心提供。主要實驗試劑和設(shè)備牛血清白蛋白（bsa,上海明睿生物有限公司，產(chǎn)品批號rf101-010）；葡萄球菌腸毒素b（seb,北 京博邁世紀生物技術(shù)有限公司）；兔抗小鼠iga抗體（北京博 奧森生物技術(shù)有限公司，抗體貨號bs-0774r）

7、；異硫氟酸熒光 素（fitc）-標記的 羊抗兔 igg （m i 11 iporecorporat ion） ；micromhm340石蠟切片機；光學(xué)顯微鏡（日本carton）；日 本sysmexca-1500自動生化分析儀；電鏡（h-600）,切片機 （lkbv 型）o實驗方法酸化水的制備新鮮的雙蒸水中加入鹽酸,濃度為mmol/l。即1000ml雙蒸水中加入10%鹽酸mlo 1%bsa酸化水的制 備,lgbsa加入100ml酸化水。造模方法適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，取新鮮尿液進行顯微鏡下 尿紅細胞檢測，均為陰性，將30只小鼠隨機分為正常對照 組（10只）、模型組（20只）。正常對照組小鼠自由飲水與飲

8、 食；模型組小鼠除自由飲水和飲食外，前5周隔日予bsa（500mgbs a 溶于200mg/kg)灌胃；第 6 周起予 b sa (20mg/kg, 500ml無菌生理鹽水中）尾靜脈注射，每天1次，連續(xù)3天;第8周起予seb（mg/kg, lmgseb溶于25ml無菌生理鹽水中） 尾靜脈注射，每周1次，連續(xù)3周，觀察至第12周末。iga腎病小鼠模型的鑒定血、尿液檢測第12周末留取小鼠新鮮尿液，行尿紅細胞定性檢測；經(jīng)摘眼球取血（待測scr, bun）后,處死小鼠， 留取右側(cè)腎臟分別固定于10%甲醛及戊二醛中，行病理（光鏡 和電鏡）及免疫熒光檢查。光鏡檢查小鼠腎組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，5n

9、m切片，蘇木精-伊紅染色（h-e）,光鏡下觀察系膜區(qū)系膜細胞 及基質(zhì)有無增生。電鏡檢查取材，前固定，漂洗，后固定，漂洗，脫水，置換 及浸透，包埋及聚合，修塊及切片，染色，電鏡觀察。免疫熒光小鼠腎組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，5um切片依次經(jīng)二甲苯i 20min,二甲苯ii20min,95%乙醇5min,95%乙醇 ii 5min,雙蒸水 5minx 3 次,3%h20210min, pbs 5minx 3 次，抗原修復(fù)（微波爐中高火5min,低火15min）,自然冷 卻,pbs5minx3 次,5% 羊血清 lh,兔抗小鼠 iga（l : 100）, 4°c 過夜,pbs5minx

10、3,fit c 標記羊抗兔 igg（l : 100）4°c it 夜,pbs5minx3,甘油封片，熒光顯微鏡下觀察攝像。免疫熒光半定量標準：半定量標準參照目前國內(nèi)通用的5級法（土+）分級: ±：低倍鏡下不能顯示;+：低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下可 見;+：低倍鏡下可見，高倍鏡下清晰可見;+：低倍鏡下清 晰可見，高倍鏡下耀眼;+：高倍鏡下刺眼。統(tǒng)計學(xué)處理全部數(shù)據(jù)采用spss醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件進行處理， 計數(shù)資料用土s差表示，采用兩獨立樣本t檢驗；等級資料用 兩獨立樣本非參數(shù)檢驗。p2結(jié)果一般情況造模過程中，正常對照組小鼠無死亡，模型組 小鼠先后死亡3只，分析原因可能是灌胃器誤插入氣

11、管，或 插入過深導(dǎo)致小鼠食管及胃黏膜損傷。尾靜脈注射seb后， 小鼠出現(xiàn)倦怠、少吃、少動等現(xiàn)象，2h后恢復(fù)正常。血、尿指標檢測12周末，采集新鮮尿液光鏡下尿紅細 胞計數(shù)。結(jié)果顯示模型組小鼠明顯高于正常對照組（p鏡下結(jié) 構(gòu)改變光鏡模型組小鼠腎組織主要表現(xiàn)為腎小球毛細血管祿 擴張，系膜細胞及基質(zhì)明顯增生，毛細血管腔部分閉鎖，部 分小管擴張；光鏡下正常對照組小鼠腎小球，腎小管，及間 質(zhì)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常，系膜細胞及細胞基質(zhì)未見增多 （圖1）。圖112周末，各組小鼠光鏡下腎組織病理變化的比較 （it-e 染色，x400）a.模型組，腎小球系膜細胞及基質(zhì)增生，毛細血管腔部 分閉鎖，部分小管擴張;正常對

12、照組，腎小球系膜細胞及基 質(zhì)未見增生，毛細血管開放良好電鏡模型組小鼠腎小球系膜區(qū)有大量電子致密物沉積, 而正常組小鼠腎小球系膜區(qū)無或有少量的電子致密物沉積 （圖2）。圖212周末，各組小鼠電鏡下腎組織病理變化的比 較（x 10000）a.模型組，系膜區(qū)大量的電子致密物沉積;b.正常對照 組，系膜區(qū)無電子致密物沉積免疫熒光檢測12周末，免疫熒光可以看到，系膜區(qū)ig a熒光強度大多為+,而正常組系膜區(qū)iga熒光強度 為土+,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表3、圖3）。表32組小鼠腎 臟系膜區(qū)iga熒光半定量比較3討論自rifai等于1979年首次用balb/c小鼠成功制作iga 腎病模型以來，許多學(xué)者基于ig

13、a腎病已知的發(fā)病機制成功 復(fù)制了許多iga腎病模型2-6 o主要包括：免疫誘導(dǎo)型、繼 發(fā)病變型、自發(fā)病變型。但由于存在種種問題，與人的iga 腎病病理變化差距很大，模型建立的滯后導(dǎo)致對iga腎病的 研究較少，對iga腎病的治療未獲得新的手段。國內(nèi)常用的iga腎病為異種蛋白所誘導(dǎo)的免疫誘導(dǎo)型, 即口服牛血清白蛋白(bsa)聯(lián)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素 (seb) o由于部分患者對某些上呼吸道病原體、腸道菌群、食 物抗原有較高的血清抗體滴度，認為黏膜免疫在發(fā)病中起到 一定作用7。故口服免疫原如bsa及靜脈注射葡萄球菌、 大腸桿菌、呼吸道病毒等病原微生物成分或免疫復(fù)合物常用 于誘導(dǎo)主動性iga腎病模

14、型。bsa 口服免疫可使機體iga抗 體的產(chǎn)生，seb的具體機制目前還不十分明確，大多數(shù)認為 seb還可破環(huán)肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，引起iga清除不完全，進 而引起免疫復(fù)合物在系膜區(qū)的沉積。17只模型小鼠熒光證實 全部有iga沉積；光鏡下腎小球系膜細胞和系膜基質(zhì)增生；電 鏡下腎小球系膜區(qū)可見大量的高電子密度的致密物沉積；臨 床的尿、血檢測隨著腎臟病理變化的加重而逐漸加重，且與 正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明造模成功。此方法操作 簡單，重復(fù)性好，成功率高，應(yīng)該是目前理想的、有研究價 值的動物模型，能為進一步研究iga腎病的發(fā)病機制及治療 提供基礎(chǔ)平臺?！緟⒖嘉墨I】1 donadioj v, gran

15、denephropath y j. nengljmed, 200 2, 347(10)： 738-748.2bagherin,pepple da , hassanmo,etal. developmentofimmunecomplexglomerularinjuryj. labinvest ,xx,85(3):354-363.3jiaq,pestkajj. roleofcyclooxygenase-2indeoxynivalenobulinanephropathy1-inducedimmunoglojfoodchemtoxicol ,xx,43(5):721-728.4koyamaa,sharm

16、ins,sakuraih,etal staphylococcusaureuseel1envelopeantigenisanewcandidatefortheinductionofiganephropathy j. ki dneylnt, xx, 66 (1): 1 21-132.5suzukis,gejyof,nakatomiy,etal. roleofiga,igg,andlgmantibodiesagainsthaemophilusparainfluenzaeantigensinlganephropath yj. clinnephrol,1996,46 (5):287-295.6sharmins,shimizuy,hagiwaram,etal.