微生物實驗室建設(shè)

1、顏小平顏小平 自貢三院自貢三院1.生物安全防護實驗室w 在以微生物為實驗（檢測）對象的實驗工作中，針對微生物危害程度建設(shè)的可以預(yù)防生物危害，保障工作人員自身和臨近安全的實驗室稱為生物安全防護實驗室。生物安全防護三原則w實驗室生物安全防護的內(nèi)容包括：安全設(shè)備、個體防護裝置和措施（一級防護）實驗室的特殊設(shè)計和建設(shè)要求（二級防護）嚴(yán)格的管理制度和標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序和規(guī)程術(shù)語和定義術(shù)語和定義2.1 生物因子生物因子biological agents 一切微生物和生物活性物質(zhì)一切微生物和生物活性物質(zhì)2.2 病原體病原體pathogens 可使人、動物或植物致病的生物因子。可使人、動物或植物致病的生物因子。

2、2.3 危險廢棄物危險廢棄物hazardous waste 有潛在生物危險、可燃、易燃、腐蝕、有毒、放有潛在生物危險、可燃、易燃、腐蝕、有毒、放射和起破壞作用的對人、環(huán)境有害的一切廢棄物。射和起破壞作用的對人、環(huán)境有害的一切廢棄物。2.4 危害危害risk 傷害發(fā)生的概率及其嚴(yán)重性的綜合。傷害發(fā)生的概率及其嚴(yán)重性的綜合。2.5 氣溶膠氣溶膠aerosols 懸浮于氣體介質(zhì)中的粒徑一般為懸浮于氣體介質(zhì)中的粒徑一般為0.001100的固態(tài)或液態(tài)微小粒子形成的相對穩(wěn)定的分散的固態(tài)或液態(tài)微小粒子形成的相對穩(wěn)定的分散體系。體系。2.6 生物安全生物安全 biosafety避免危險生物因子造成實驗室人員暴

3、露、向?qū)嶒炇冶苊馕ｋU生物因子造成實驗室人員暴露、向?qū)嶒炇彝鈹U散并導(dǎo)致危害的綜合措施。外擴散并導(dǎo)致危害的綜合措施。2.7 高效空氣過濾器高效空氣過濾器 high efficiency particulate air filter(hepa)通常以濾除大于等于通常以濾除大于等于0.3微粒為目的，濾除效率符微粒為目的，濾除效率符合相關(guān)要求的過濾器。合相關(guān)要求的過濾器。2.8安全罩安全罩 safety hood置于實驗室工作臺或儀器設(shè)備上的負(fù)壓排風(fēng)罩，以置于實驗室工作臺或儀器設(shè)備上的負(fù)壓排風(fēng)罩，以減少實驗室工作者的暴露危險。減少實驗室工作者的暴露危險。2.9生物安全柜生物安全柜biological s

4、afety cabinet(bsc)負(fù)壓過濾排風(fēng)柜。防止操作者和環(huán)境暴露于實驗過負(fù)壓過濾排風(fēng)柜。防止操作者和環(huán)境暴露于實驗過程中產(chǎn)生的生物氣溶膠。程中產(chǎn)生的生物氣溶膠。2.10個人防護裝備個人防護裝備personal protective equipment(ppe)用于防止人員受到化學(xué)和生物等有害因子傷害的器用于防止人員受到化學(xué)和生物等有害因子傷害的器材和用品。材和用品。2.11 實驗室分區(qū)實驗室分區(qū) laboratory area按照生物因子污染概率的大小，實驗室可按照生物因子污染概率的大小，實驗室可進行合理的分區(qū)。進行合理的分區(qū)。2.12 緩沖間緩沖間 buffer room設(shè)置在清潔區(qū)

5、、半污染區(qū)和污染區(qū)相臨兩設(shè)置在清潔區(qū)、半污染區(qū)和污染區(qū)相臨兩區(qū)之間的緩沖密閉室，具有通風(fēng)系統(tǒng)，其區(qū)之間的緩沖密閉室，具有通風(fēng)系統(tǒng)，其兩個門具有互鎖功能，且不能同時處于開兩個門具有互鎖功能，且不能同時處于開啟狀態(tài)。啟狀態(tài)。2.13 氣鎖氣鎖air lock 氣壓可調(diào)節(jié)的氣密室，用于連接氣壓不同氣壓可調(diào)節(jié)的氣密室，用于連接氣壓不同的兩個相鄰區(qū)域，其兩個門具有互鎖功能，的兩個相鄰區(qū)域，其兩個門具有互鎖功能，不能同時處于開啟狀態(tài)。在實驗室中用作不能同時處于開啟狀態(tài)。在實驗室中用作特殊通道。特殊通道。危害程度分級危害程度分級根據(jù)生物因子對個體和群體的危害程度將其分為根據(jù)生物因子對個體和群體的危害程度將其

6、分為4級。級。 危害等級危害等級（低個體危害，低群體危害）（低個體危害，低群體危害）不會導(dǎo)致健康工作者和動物致病的細(xì)菌、真菌、病毒不會導(dǎo)致健康工作者和動物致病的細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等生物因子。和寄生蟲等生物因子。 危害等級危害等級（中等個體危害，有限群體危害）（中等個體危害，有限群體危害）能引起人或動物發(fā)病，但一般情況下對健康工作者、能引起人或動物發(fā)病，但一般情況下對健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會引起嚴(yán)重危害的病原體。實驗群體、家畜或環(huán)境不會引起嚴(yán)重危害的病原體。實驗室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和預(yù)防措施，室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和預(yù)防措施，并且傳播風(fēng)險有限。并且傳播風(fēng)險

7、有限。危害程度分級危害程度分級 危害等級危害等級（高個體危害，低群體危害）（高個體危害，低群體危害） 能引起人類或動物嚴(yán)重的疾病，或造成嚴(yán)重經(jīng)濟損能引起人類或動物嚴(yán)重的疾病，或造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失，但通常不能因偶然接觸而在個體間傳播，或能使失，但通常不能因偶然接觸而在個體間傳播，或能使用抗生互不、抗寄生蟲藥治療的病原體。用抗生互不、抗寄生蟲藥治療的病原體。 危害等級危害等級（高個體危害，高群體危害）（高個體危害，高群體危害）能引起人類或動物非常嚴(yán)重的疾病，一般不能治愈，能引起人類或動物非常嚴(yán)重的疾病，一般不能治愈，容易直接、間接或因偶然接觸在人與人，或動物與人，容易直接、間接或因偶然接觸在人與人，

8、或動物與人，或人與動物，或動物與動物間傳播的病原體?；蛉伺c動物，或動物與動物間傳播的病原體。生物危害評估生物危害評估 當(dāng)實驗室活動涉及傳染或潛在傳染性生當(dāng)實驗室活動涉及傳染或潛在傳染性生物因子時，應(yīng)進行危害程度評估。危害程物因子時，應(yīng)進行危害程度評估。危害程度評估應(yīng)至少包括下列內(nèi)容：生物因子的度評估應(yīng)至少包括下列內(nèi)容：生物因子的種類（已知的、未知的、基因修飾的或未種類（已知的、未知的、基因修飾的或未知傳染性的生物材料）、來源、傳染性、知傳染性的生物材料）、來源、傳染性、致病性、傳播途徑、在環(huán)境中的穩(wěn)定性、致病性、傳播途徑、在環(huán)境中的穩(wěn)定性、感染劑量、濃度、動物實驗數(shù)據(jù)、預(yù)防和感染劑量、濃度、動

9、物實驗數(shù)據(jù)、預(yù)防和治療。治療。 危害程度評估應(yīng)由適當(dāng)?shù)挠薪?jīng)驗的專業(yè)危害程度評估應(yīng)由適當(dāng)?shù)挠薪?jīng)驗的專業(yè)人員進行。人員進行。 防護屏障和生物安全水平分級防護屏障和生物安全水平分級5.1 防護屏障防護屏障5.1.1 一級防護屏障一級防護屏障實驗室的生物安全柜和個人防護裝備等構(gòu)成的防護屏障。實驗室的生物安全柜和個人防護裝備等構(gòu)成的防護屏障。5.1.2 二級防護屏障二級防護屏障實驗室的設(shè)施結(jié)構(gòu)和通風(fēng)系統(tǒng)等構(gòu)成的防護屏障。實驗室的設(shè)施結(jié)構(gòu)和通風(fēng)系統(tǒng)等構(gòu)成的防護屏障。5.2 生物安全水平分級生物安全水平分級 根據(jù)所操作的生物因子的危害程度和采取的防護措施，根據(jù)所操作的生物因子的危害程度和采取的防護措施，將生

10、物安全防護水平（將生物安全防護水平（biosafety level, bsl）分為）分為4級，級，i級防級防護水平最低，護水平最低，級防護水平最高。以級防護水平最高。以bsl1、bsl2、bsl3、bsl4表示實驗室的相應(yīng)生物安全防護水平；以表示實驗室的相應(yīng)生物安全防護水平；以absl1、absl2、absl3、absl4表示動物實驗表示動物實驗室的相應(yīng)生物安全防護水平。室的相應(yīng)生物安全防護水平。生物安全柜的分級 i 級生物安全柜 class i biosafety cabinet 至少裝置一個高效空氣過濾器對排氣進行凈化，工作時柜正面玻璃推拉窗打開一半，上部為觀察,下部為操作窗口.外部空氣由

11、操作窗口吸進,而不可能由操作窗口逸出.工作狀態(tài)時保證工作人員不受侵害，但不保證實驗對象不受污染。 級生物安全柜 至少裝置一個高效空氣過濾器對排氣進行凈化，工作空間為經(jīng)高效過濾器凈化的無渦流的單向流空氣.工作時正面玻璃推拉窗打開一半，上部為觀察窗，下部為操作窗口.外部空氣由操作窗口吸進,而不可能由操作窗口逸出。工作狀態(tài)下遵守操作規(guī)程時既保證工作人員不受侵害，也保證實驗對象不受污染。 級生物安全柜 至少裝置一個高效空氣過濾器對排氣進行凈化，工作空間為經(jīng)高效過濾器凈化的無渦流的單向流空氣。正面上部為觀察窗，下部為手套箱式操作口。箱內(nèi)對外界保持負(fù)壓.可確保人體與柜內(nèi)物品完全隔絕。生物安全實驗室分級生物

12、安全實驗室分級1 沒有特殊要求沒有特殊要求, 不需要特殊培訓(xùn)。進行一級生物安全實驗。不需要特殊培訓(xùn)。進行一級生物安全實驗。2 工作人員需要經(jīng)過培訓(xùn)，配備生物安全柜（工作人員需要經(jīng)過培訓(xùn)，配備生物安全柜（1級或級或2級），有可能級），有可能發(fā)生氣溶膠或溢出的實驗要求在安全柜內(nèi)進行。進行二級生物安發(fā)生氣溶膠或溢出的實驗要求在安全柜內(nèi)進行。進行二級生物安全實驗。全實驗。3 工作人員必須經(jīng)過特殊培訓(xùn)工作人員必須經(jīng)過特殊培訓(xùn), 配備生物安全柜（配備生物安全柜（1級或級或2級）級）, 有感有感染性材染性材 料的實驗料的實驗, 有可能發(fā)生氣溶膠或溢出的實驗要求在安全柜有可能發(fā)生氣溶膠或溢出的實驗要求在安全柜

13、內(nèi) 進 行 ， 實 驗 室 內(nèi) 為 負(fù) 壓內(nèi) 進 行 ， 實 驗 室 內(nèi) 為 負(fù) 壓 , 進 行 三 級 生 物 安 全 的 實 驗 。進 行 三 級 生 物 安 全 的 實 驗 。4 除除bsl-3的條件外的條件外, 必須是獨立的建筑物，生物安全柜為必須是獨立的建筑物，生物安全柜為2或或3級，級，進行四級生物安全的實驗。進行四級生物安全的實驗。實驗室標(biāo)記舉例實驗室標(biāo)記舉例三級生物安全實驗室三級生物安全實驗室bsl-3病原體名稱病原體名稱實驗室負(fù)責(zé)人實驗室負(fù)責(zé)人生物危害標(biāo)記生物危害標(biāo)記實驗室和微生物的分級w 一級生物安全防護實驗室一級生物安全防護實驗室w 實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)

14、備適用于對健康成年人已知無致病作用的微生物，如用于教學(xué)的普通微生物實驗室等。包含微生物舉例： 大腸桿菌、格魯伯耐格里原蟲、感染性犬肝炎病毒、枯草桿菌等。實驗室和微生物的分級w 二級生物安全防護實驗室二級生物安全防護實驗室w 實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物。包含微生物舉例：麻疹病毒、 沙門氏菌 、弓形體、乙型肝炎病毒、衣原體、志賀氏菌。w 三級生物安全防護實驗室三級生物安全防護實驗室 實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于主要通過呼吸途徑使人傳染上嚴(yán)重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有預(yù)防傳染的疫苗和相應(yīng)的治療方法。實驗室和微

15、生物的分級 艾滋病病毒的研究（血清學(xué)實驗除外）應(yīng)在三級生物安全防護實驗室中進行。包含微生物舉例：結(jié)核分枝桿菌 、牛分枝桿菌、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、熱病原體、hiv (血清學(xué)檢測除外)、澳大利亞立克次氏體、加拿大立克次氏體 。實驗室和微生物的分級w 四級生物安全防護實驗室四級生物安全防護實驗室w 實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對人體具有高度危險性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。與上述情況類似的不明微生物，也必須在四級生物安全防護實驗室中進行。待有充分?jǐn)?shù)據(jù)后再決定此種微生物或毒素應(yīng)在四級還是在較低級別進行。實驗室和微生物的分級w

16、實驗脊椎動物生物安全防護實驗室，其適用微生物范圍與同級的一般生物安全防護實驗室相同。以absl-1、 absl-2、 absl-3、absl-4表示動物實驗室的相應(yīng)生物安全防護水平。生物安全防護實驗室基本要求（設(shè)施和設(shè)備） 一級生物安全防護實驗室一級生物安全防護實驗室 bsl-1w 6.1w 1）無需特殊選址，普通建筑物即可，但應(yīng)有防止節(jié)肢動物和嚙齒動物進入的設(shè)計。w 2）每個實驗室應(yīng)設(shè)洗手池，宜設(shè)置在靠近出口處。w 3）在實驗室門口處應(yīng)設(shè)掛衣裝置，個人便裝與實驗室工作服分開放置。w 4）實驗室圍護結(jié)構(gòu)內(nèi)表面應(yīng)易于清潔。地面應(yīng)防滑、無縫隙，不得鋪設(shè)地毯。w 5）實驗臺表面應(yīng)不透水，耐腐蝕、耐熱

17、。w 6）實驗室中的家具應(yīng)牢固。為易于清潔，各種家具和設(shè)備之間應(yīng)保持一定間隙。應(yīng)有專門放置生物廢棄物容器的臺（架）。w 7）實驗室如有可開啟的窗戶，應(yīng)設(shè)置紗窗。w 8）實驗室內(nèi)應(yīng)保證工作照明，避免不必要的反光和強光。w 9）應(yīng)有適當(dāng)?shù)南驹O(shè)備。二級生物安全防護實驗室二級生物安全防護實驗室bsl-2bsl-2w 6.2w 1）滿足6.1的要求w 2）實驗室門宜帶鎖、可自動關(guān)閉。實驗室的門應(yīng)有可視窗。w 3）應(yīng)有足夠的儲存空間擺放物品以便使用。在實驗室工作區(qū)域外還應(yīng)當(dāng)有供長期使用的儲存空間。w 4）在實驗室內(nèi)應(yīng)使用專門的工作服；戴乳膠手套。w 5）在實驗室的工作區(qū)域外應(yīng)有存放個人衣物的條件。w 6

18、）在實驗室所在的建筑內(nèi)應(yīng)配備高壓蒸汽滅菌器，并按期檢查和驗證，以保證符合要求。w 7）應(yīng)在實驗室內(nèi)配備生物安全柜。w 8）應(yīng)設(shè)置洗眼裝置。必要時應(yīng)有應(yīng)急噴淋裝置。w 9）應(yīng)通風(fēng)，如使用窗戶自然通風(fēng)，應(yīng)有防蟲紗窗。w 10）有可靠的電力供應(yīng)和應(yīng)急照明。必要時，重要設(shè)備如培養(yǎng)箱、生物安全柜、冰箱等應(yīng)設(shè)備用電源。w 11）實驗室出口應(yīng)有在黑暗中可辨認(rèn)的標(biāo)識?？偨Y(jié)w 生物安全防護實驗室：用于檢測具有生物危害的標(biāo)本和材料，通過合理實驗室建筑結(jié)構(gòu)和布局，使用一定的防護設(shè)備。主要保障工作人員自身不受侵害和周圍環(huán)境的安全，同時也保證受檢標(biāo)本原有性狀。如何建立一個微生物實驗室呢？如何建立一個微生物實驗室呢？ w

19、 電熱恒溫培養(yǎng)箱電熱恒溫培養(yǎng)箱w 電熱鼓風(fēng)干燥箱電熱鼓風(fēng)干燥箱w 高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋w 電冰箱電冰箱 電子天平電子天平w 生物顯微鏡生物顯微鏡 w 凈化工作臺或生物安全柜凈化工作臺或生物安全柜w 純水蒸餾水器純水蒸餾水器w 電熱恒溫水箱電熱恒溫水箱w 紅外接種環(huán)滅菌器紅外接種環(huán)滅菌器w 離心機離心機w 細(xì)菌鑒定分析系統(tǒng)細(xì)菌鑒定分析系統(tǒng) 微生物實驗室設(shè)備配置表微生物實驗室設(shè)備配置表 w 普通光學(xué)顯微鏡w 暗視野顯微鏡w 熒光顯微鏡w 倒置顯微鏡w 電子顯微鏡顯微鏡顯微鏡w一一.形態(tài)學(xué)檢查形態(tài)學(xué)檢查w 1.不染色標(biāo)本的檢查：標(biāo)本中的有形成分觀察、細(xì)菌動力觀察（濕片法、懸滴法、毛細(xì)管法）臨

20、床細(xì)菌檢驗技術(shù)與方法臨床細(xì)菌檢驗技術(shù)與方法w 革蘭染色（自動染色機）w 抗酸染色： 萋-尼染色法（加熱） 金永染色法（不需加熱） 改良金永染色（1%硫酸脫色3分鐘）墨汁莢膜染色法：新型隱球菌瑞氏染色：細(xì)菌染成藍(lán)色乳酚棉蘭染色2.染色標(biāo)本的檢查染色標(biāo)本的檢查w 無菌操作技術(shù) 基本要求與無菌技術(shù)臨床細(xì)菌分離培養(yǎng)臨床細(xì)菌分離培養(yǎng)w 接種環(huán)及接種針w 設(shè)施和設(shè)備：為達(dá)到無菌技術(shù)要求而建立的細(xì)菌接種場所。w 接種和分離方法： 平板劃線分離法： 連續(xù)劃線分離法（含菌量少的標(biāo)本） 分區(qū)劃線分離法（含菌量多的標(biāo)本） 棋盤劃線分離法（含菌量多的如：大便標(biāo)本）接種基本條件接種基本條件w 斜面接種法w 穿刺接種法w 液體接種法w 傾注平板法w 涂布法w 自動接種法接種分離方法接種分離方法w 血平板w 巧克力平板w 麥康凱或中國藍(lán)平板w 沙保弱瓊脂平板或真菌顯色平板w ss平板培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的選擇標(biāo)本類型標(biāo)本類型接種平