畢赤酵母的培養(yǎng)基1

1、畢赤酵母的培養(yǎng) 巴斯德畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌。與其它酵母一樣，在無(wú)性生長(zhǎng)期主要以單倍體形式存在，當(dāng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)限制時(shí)，常誘導(dǎo)2個(gè)生理類型不同的接合型單倍體細(xì)胞交配，融合成雙倍體。比赤酵母表達(dá)常用的培養(yǎng)基：1 LB培養(yǎng)基 胰蛋白胨 1% 酵母粉 0.5% 氯化鈉 1% PH 7.0-大腸桿菌培養(yǎng) 制作平板加入2%的瓊脂粉，121攝氏度20分鐘，可于室溫保存。 用于培養(yǎng) pPICZ A 原核宿主菌 TOP10F時(shí)可加入 Zeocin 25ug / mL（博來(lái)霉素，抗菌素）宿主細(xì)胞His- -誘變?cè)斐傻?。MD-酵母轉(zhuǎn)化篩選培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)缺陷型His-）13.

2、4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表達(dá)的畢赤酵母都屬于組氨酸缺陷型的只有染色體上成功整合入重組質(zhì)粒載體基因的畢赤酵母菌株才能在組氨酸缺失的MD培養(yǎng)基生長(zhǎng)，以此篩選出重組子。MM-酵母轉(zhuǎn)化進(jìn)一步篩選培養(yǎng)基僅能滿足微生物野生型菌株生長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基，成為基本培養(yǎng)基（minimal medium,MM），有時(shí)用符號(hào)“ ”來(lái)表示。不同微生物的基本培養(yǎng)基是不相同的。2 LLB 培養(yǎng)基 胰蛋白胨 1% 酵母粉 0.5% 氯化鈉 0.5% PH 7.0制作平板時(shí)加入 2瓊脂粉。 121高壓滅菌 20min。 可于室溫保存數(shù)月。 用于培養(yǎng) pPICZ A 原核宿主菌 TOP10F時(shí)

3、，加入 Zeocin 25ug / ml，可以 4條件下保存 12 周. 3 YPD培養(yǎng)基 酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固體加2%的瓊脂粉，YPD 培養(yǎng)基可常溫保存,是畢赤酵母的最基本培養(yǎng)基，瓊脂 YPD 平板在 4可保存 幾個(gè)月。加入 Zeocin 100ug / ml，成為 YPDZ 培養(yǎng)基，可以 4條件下保存 12 周。4 BMGY培養(yǎng)基 酵母粉1% 蛋白胨2%， 磷酸鉀緩沖溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10 -5 ）%甘油1%，畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基，YNB和Biotin過(guò)濾除菌。培養(yǎng)24小時(shí)后，一 般靜置

4、過(guò)夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培養(yǎng)基，改換BMMY培養(yǎng)基，進(jìn)入誘導(dǎo)表達(dá)階段。5 BMMY培養(yǎng)基 酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸鉀緩沖溶液平PH 6 100mmol/L YNB 1.34% 生物素（4×10 -5 ）% 甘油1% 甲醇3%，畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基，YNB和Biotin過(guò)濾除菌。搖瓶培養(yǎng)時(shí)每24小時(shí) 之后加入3%的甲醇誘導(dǎo)，一般誘導(dǎo)72小時(shí)。6 YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基 酵母粉1% 蛋白胨2% 葡萄糖2%，山梨醇1M, 瓊脂2%，博來(lái)霉素100mg/ml 不管是液體 YPDS 培養(yǎng)基，還是 YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基，都必須存放 4條件下，有效 

5、1-2周。7 MGY培養(yǎng)基 34%YNB,1%甘油，4×10 -5 %生物素，將 800ml 滅菌水、100ml 的 10*YNB 母液、2ml 的 500*B 母液和 100ml 的 10*GY 母液混勻即可，4保存，保存期為 2 個(gè)月。8 MGYH培養(yǎng)基 MGY培養(yǎng)基+0.004%的組氨酸 MGYH 在 1000ml 的 MGY 培養(yǎng)基中加入 10ml 的 100*H 母液混勻，4保存，保存期為 2 個(gè)月。9 RD -5 Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培養(yǎng)基） （含有：1mol/L 的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10 %生物素

6、；0.005%氨基酸） （1）. 將 186g 的山梨醇定容至 700ml，高壓滅菌；（ 2）. 冷卻后于 45水?。?（3）. 將 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB；2ml 的 500*B；10ml 的 100*AA 等母液和 88ml 無(wú)菌 水混勻，預(yù)熱至 45后，與步驟 2 的山梨醇溶液混合。4保存。 10 RDH Regeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸） 在 RD 培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入 10ml 的 100*H 母液，同時(shí)無(wú)菌水的體積減少至 78ml 即可，其余配制方法與

7、 RD 相同。4保存。11 RD 及 RDH 平板的制備 1. 將 186g 的山梨醇和 1520g 瓊脂粉定容至 700ml，高壓滅菌；冷卻后于 60水??； 2. 參照 RD/RDH 液體培養(yǎng)基配制的步驟 4， 100ml 的 10*D、 將 100ml 的 10*YNB； 的 500*B； 2ml 10ml 的 100*AA 等母液、 （10ml 的 100*H 母液）和 88（78）ml 無(wú)菌水混勻，預(yù)熱至 45 后，與步驟 1 的山梨醇/瓊脂液混勻； 3. 迅速制備平板。4可保存數(shù)月。12 RD 及 RDH 的 TOP 瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被） 瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被）

8、 （1）.將 186g 的山梨醇和 7.510g 瓊脂粉定容至 700ml，高壓滅菌；冷卻后于 60水浴； 瓊脂粉 60 （2）.參照 RD/RDH 液體培養(yǎng)基配制的步驟 4， 100ml 的 10*D、 將 100ml 的 10*YNB； 的 500*B； 2ml 10ml 的 100*AA 等母液、 （10ml 的 100*H 母液）和 88（78）ml 無(wú)菌水混勻，預(yù)熱至 45后， 與步驟 1 的山梨醇/瓊脂液混勻； （3）.將該 TOP 瓊脂置于 45水浴冷卻、保溫，備用。13 MD 與 MDH -5 Minimal Dextrose Medium +（Histidine） 最小葡萄糖

9、培養(yǎng)基 +（ 0.004 %組氨酸） （含有：1.34%YNB； ；4*10 % 生物素；2%葡萄糖） 1. 100ml 的 10*YNB；2ml 的 500*B 和 100ml10*D 母液，用 800ml 的無(wú)菌水定容至 1000ml 即可； 2. 如配制 MDH，可在上述的 MD 中加入 10ml 的 100*H 即可； 3. 如配制平板，可無(wú)菌水的滅菌前，加入 1520g 的瓊脂。4可保存數(shù)月。14 SOC 培養(yǎng)基： 培養(yǎng)基： Trypton Yeast Extract NaCl Glucose (1mol / L) 121高壓滅菌 20min，冷卻后，4保存。 l 0.5 0.05

10、2% 母液的配置注： 母液的配置注： 10*YNB （含有硫酸銨、無(wú)氨基酸的 13.4%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基） 4保存。34g 酵母 基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基（無(wú)硫酸銨）+100g 硫酸銨，溶于 1000ml 水中，過(guò)濾除菌。 500*B （0.02%生物素 Biotin） 4保存 保存期為 1 年。20mg 的生物素 溶于 100ml 水中，過(guò)濾除菌。 100*H （0.4%Histidine 組氨酸） 4保存 保存期為 1 年。400mg 的 L-組氨酸溶于 100ml 水中， （加熱至 50以促進(jìn)溶解） ，過(guò)濾除菌。 10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期為 1 年。200g 葡萄糖溶

11、于 1000ml 水中，滅 菌 15min 或過(guò)濾除菌。 10*M 過(guò)濾除菌。 （5%Methanol 甲醇） 保存期為 2 個(gè)月。將 5ml 的甲醇與 95ml 水混勻， 10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期為 1 年以上。將 100ml 甘油和 900ml 水混勻 后，高壓滅菌或過(guò)濾除菌。 100*AA 過(guò)濾除菌。 （0.5% of each Amino Acid，各種氨基酸） 4保存 保存期為 1 年。分 別將 500mg 的 L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和 L-異亮氨酸溶于 100ml 水中， 1M 磷酸鉀溶液（potassium phosphate

12、buffer，pH6.0） ，將 1mol/L 的 K2HPO4 溶液 132ml 與 1mol/L 的 KH2PO4 溶液 868ml 混勻，其 pH 為 6.0，如需調(diào)節(jié) pH，則使用磷酸和氫氧化鉀調(diào)節(jié) pH。10*YNB:34g 酵母 基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基（無(wú)硫酸銨）+100g 硫酸銨，溶于 1000ml 水中，過(guò)濾除菌。 500*B （0.02%生物素 Biotin） 4保存 保存期為 1 年。20mg 的生物素 溶于 100ml 水中，過(guò)濾除菌。 100*H （0.4%Histidine 組氨酸） 4保存 保存期為 1 年。400mg 的 L-組氨酸溶于 100ml 水

13、中， （加熱至 50以促進(jìn)溶解） ，過(guò)濾除菌。10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期為 1 年。200g 葡萄糖溶于 1000ml 水中，滅 菌 15min 或過(guò)濾除菌。10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期為 2 個(gè)月。將 5ml 的甲醇與 95ml 水混勻，過(guò)濾除菌。  10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期為 1 年以上。將 100ml 甘油和 900ml 水混勻 后，高壓滅菌或過(guò)濾除菌。  100*AA 過(guò)濾除菌。 （0.5% of each Amino Acid，各種氨基酸） 4保存 保存期為1 年。分 別將 500

14、mg 的 L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和 L-異亮氨酸溶于 100ml 水中過(guò)濾除菌。 1M磷酸鉀溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0） ，將 1mol/L 的 K2HPO4 溶液 132ml 與 1mol/L 的 KH2PO4 溶液 868ml 混勻，其 pH 為 6.0，如需調(diào)節(jié) pH，則使用磷酸和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH。畢赤酵母表達(dá)常用載體： 典型的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體載體包含醇氧化酶1（AOX1）基因的啟動(dòng)子 和轉(zhuǎn)錄終止子（5'AOX1 和 3'AOX1） ，它們被多克隆位點(diǎn)（MCS）分開(kāi)，外源基 因可以在此插入。此載體還

15、包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標(biāo)記及 3'AOX1 區(qū)。當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體時(shí)，它的 5'AOX1 和 3'AOX1 能與染色體上的同源基因重組，從而使整個(gè)載體連同外源基因插入到受體染色體上， 外源基因在 5'AOX1 啟動(dòng)子控制下表達(dá)。畢赤酵母本身不分泌內(nèi)源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導(dǎo)分泌的信號(hào)序列。而由 89 個(gè)氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號(hào) 交配因 子(-factor)引導(dǎo)序列已經(jīng)成功地引導(dǎo)了幾種外源蛋白的分泌。 分泌表達(dá)載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZ A，pYAM75P 等。胞內(nèi)表達(dá)載體主要 有 ： pHIL

16、-D2 ， pA0815 ， pPIC3K ， pPICZ ， pHWO10 ， pGAPZ ， pGAPZa(Invitrogen)， pPIC3.5K 等。工程菌株 Y11430，MG1003，GS115 （AOX1） KM71， ， SMD1168。 畢赤酵母宿主菌常用的有 GS115 和 KM71 兩種， 都具有 HIS4 營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記。其中，GS115 茵株具有 AOX1 基因，是 Mut，即 表型為 Muts， 甲醇利用正常型； KM71 菌株的 AOX1 位點(diǎn)彼 ARG4 基因插入， 而 即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。多拷貝表達(dá)菌株的 獲得方式： 與自主復(fù)

17、制的質(zhì)粒型表達(dá)載體不同，整合型表達(dá)載體的拷貝數(shù)可以 有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達(dá)菌株合成蛋白的量也較多。體內(nèi)整合可 通過(guò)高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入；而體外整合可通過(guò)連接產(chǎn)生外源 基因的串聯(lián)插入。多拷貝表達(dá)菌株的獲得方式有兩種：一種是利用 SDS-PAGE 電泳、免疫雜交或菌落點(diǎn)雜交方法在大量的轉(zhuǎn)化子中進(jìn)行自然篩選。得到產(chǎn)量高 的表達(dá)菌株。另一種在轉(zhuǎn)化前將多個(gè)表達(dá)盒拷貝插入到單個(gè)載體中，而后再通過(guò)交換整合到受體染色體上。表達(dá)蛋白純化方法： 酵母系統(tǒng)表達(dá)的蛋白一般都具 有活性，所以都采用較溫和的純化方式來(lái)純化目的蛋白，分泌型表達(dá)的蛋白有利 于純化，可用硫酸銨沉淀，然后用離子交換，凝膠過(guò)濾層析，疏水層析等方法進(jìn) 一步純化。具體的方法和操作應(yīng)按所處理的目的蛋白的性質(zhì)選擇。2. 畢赤酵母利用的優(yōu)缺點(diǎn)分析 Pichia.pastoris酵母菌體內(nèi)無(wú)天然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。包括啟動(dòng)子、外源基因克隆位點(diǎn)、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌復(fù)制擴(kuò)增